Phần 2: Đánh Giá Chiết Xuất Protein Từ Ấu Trùng Sâu Bột Vàng (Tenebrio molitor) Như Một Chất Bảo Vệ Chống Đông Lạnh Cho Tôm Thẻ Chân Trắng Đông Lạnh

3. Kết quả và thảo luận

3.1. Hoạt tính bảo vệ chống đông lạnh của chiết xuất protein sâu bột vàng

Hiệu quả bảo vệ chống đông của YMPE được đánh giá thông qua việc theo dõi enthalpy nóng chảy eutectic của dung dịch NaCl, như trình bày trong Hình 1. Kết quả cho thấy dung dịch NaCl có bổ sung YMPE có enthalpy nóng chảy eutectic đạt 1,41 J/g, thấp hơn đáng kể so với dung dịch đối chứng không chứa YMPE. Sự giảm enthalpy này là bằng chứng nhiệt động học rõ ràng cho thấy YMPE có khả năng can thiệp vào quá trình kết tinh của băng. Enthalpy nóng chảy eutectic phản ánh tỷ lệ các pha có trật tự trong hỗn hợp eutectic và các tinh thể băng (Karnjanapratum & Benjakul, 2015). Do đó, giá trị enthalpy thấp hơn khi có mặt YMPE cho thấy tỷ lệ pha có trật tự đã giảm, qua đó cung cấp bằng chứng nhiệt động học về khả năng liên kết với băng của peptide, giúp cản trở quá trình tạo mầm băng và làm chậm sự hình thành các tinh thể băng.

3.2. Xác định các peptide chống đông trong chiết xuất protein sâu bột vàng

Phân tích protein của YMPE đã xác định tổng cộng 766 protein khác nhau (Bảng S1), trong đó có 12 protein được phân loại là protein chống đông. Mã định danh UniProt và trình tự axit amin tương ứng của các protein này được trình bày trong Bảng 1. Trong số các peptide được phát hiện từ YMPE, các peptide DCFEAPTCTDSTNCYK, AATTCTDSTNCYKAK, NCLKAATCTGSTNCK, TCTGSTDCNRAMTCTNSK, TCTNSQHCVRAR và AATCTGSTDCNTAR đều chứa các mô típ trình tự có mức độ tương đồng cao với trình tự lặp lại gồm 12 axit amin (TCTxSxxCxxAx) đặc trưng của protein chống đông ở Tenebrio molitor (TmAFP) (Bar-Dolev et al., 2020; Graether, 2011; Kristiansen, 2020). Đáng chú ý, peptide TCTGSTDCNRAMTCTNSK thể hiện hai mô típ này lặp lại liên tiếp, trong khi TCTNSQHCVRAR có trình tự axit amin tương đồng mạnh với TmAFP. Sự hiện diện của các mô típ lặp này là bằng chứng hỗ trợ cho sự tồn tại của các protein tương tự AFP có nguồn gốc tự nhiên trong YMPE. Các peptide được xác định đều giàu gốc threonine và cysteine, hai loại axit amin có liên quan đến khả năng liên kết với băng và tác dụng bảo vệ chống đông lạnh (Kristiansen, 2020). Trong đó, threonine đóng vai trò thiết yếu trong quá trình liên kết với băng, còn cysteine góp phần duy trì sự ổn định cấu trúc của protein thông qua việc hình thành các liên kết disulfide (Liou et al., 2000). Nhóm ưa nước của các gốc threonine có khả năng liên kết chặt chẽ với cả mặt đáy và mặt lăng trụ của tinh thể băng trong quá trình hình thành và kết tinh lại, từ đó làm chậm quá trình tạo băng cũng như sự phát triển của các tinh thể băng (Ramya & Ramakrishnan, 2016; Zachariassen et al., 2011).

Bảng 1. Mã định danh UniProt tương ứng và trình tự axit amin của các protein chống đông đã được xác định.

Các peptit được in đậm là các peptit có sự tương đồng mạnh mẽ với các chuỗi lặp lại 12 gốc axit amin (TCTxSxxCxxAx).

3.3. Lựa chọn nồng độ tối ưu của chiết xuất protein sâu bột vàng

Ảnh hưởng của việc ngâm tôm trong dung dịch chiết xuất protein từ sâu bột vàng (YMPE) ở các nồng độ 0,25%, 0,5%, 1% và 3% (w/v) đến mức tăng trọng và hàm lượng nước có thể đóng băng, so với tôm được ngâm trong nước cất (DW) và dung dịch phosphat hỗn hợp (MP), được trình bày trong Bảng 2. Kết quả cho thấy tôm ngâm trong các dung dịch YMPE ở mọi nồng độ đều có mức tăng trọng cao hơn đáng kể so với tôm ngâm trong nước cất (P < 0,05), cho thấy YMPE có khả năng cải thiện khả năng giữ nước của tôm trong quá trình ngâm. Mức tăng trọng tăng khi nồng độ YMPE tăng từ 0,25% lên 0,5%, nhưng giảm nhẹ ở các nồng độ cao hơn (1% và 3%). Hiện tượng này có thể liên quan đến sự tự kết tụ của YMPE ở nồng độ cao, phù hợp với đặc tính kết tụ của các protein chưa gấp nếp đã được ghi nhận trước đây (Bianco và cs., 2020). Sự kết tụ này có thể làm giảm khả năng tương tác của protein với các sợi cơ, từ đó hạn chế khả năng hấp thụ nước. Tuy nhiên, mức tăng trọng của tôm xử lý bằng YMPE vẫn thấp hơn đáng kể so với tôm ngâm trong dung dịch phosphat hỗn hợp, vốn đạt giá trị tăng trọng cao nhất (P < 0,05). Hiệu quả này có thể bắt nguồn từ khả năng giữ nước của phosphat hỗn hợp, thông qua việc làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các sợi cơ nhờ sự thay đổi cường độ ion và độ pH (Thangavelu và cs., 2019).

Bảng 2. Tăng trọng lượng và hàm lượng nước có thể đóng băng của tôm ngâm trong dung dịch chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE) ở các nồng độ khác nhau so với tôm ngâm trong nước cất (DW) và dung dịch phosphat hỗn hợp (MP).

Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3), và các chữ cái khác nhau trong cùng một cột cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Về hàm lượng nước có thể đóng băng, tất cả các mẫu tôm được xử lý bằng YMPE đều có giá trị thấp hơn so với mẫu ngâm trong nước cất nhưng cao hơn so với mẫu xử lý bằng dung dịch phosphat hỗn hợp. Kết quả này cho thấy YMPE có khả năng làm giảm lượng nước tự do sẵn có để hình thành tinh thể băng. Hiệu quả này có thể liên quan đến khả năng liên kết nước của protein từ sâu bột vàng, nhờ các nhóm chức có khả năng tạo liên kết hydro với các phân tử nước, từ đó hạn chế sự di chuyển của nước tự do (Lee và cs., 2019). Tuy nhiên, khi tăng nồng độ YMPE lên trên 0,5%, hàm lượng nước có thể đóng băng không giảm thêm một cách có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu sử dụng collagen thủy phân trong bột đông lạnh, trong đó hàm lượng nước có thể đóng băng thấp nhất đạt được ở nồng độ collagen thủy phân 0,25%, và việc tiếp tục tăng nồng độ không tạo ra sự khác biệt đáng kể (Cao và cs., 2020). Hiện tượng này có thể liên quan đến sự gia tăng độ nhớt hoặc sự tự kết tụ của các thành phần giàu peptide ở nồng độ cao hơn (1% và 3%), làm cản trở quá trình khuếch tán và phân bố đồng đều của các peptide có tác dụng bảo vệ chống đông trong mô cơ. Sự kết tụ phụ thuộc vào nồng độ này có thể làm giảm khả năng tương tác của peptide với các phân tử nước hoặc các nhân tạo băng, từ đó làm suy giảm khả năng liên kết với băng. Ngoài ra, hiện tượng phân tách pha cục bộ có thể làm hạn chế nồng độ hiệu quả của các peptide chức năng tại các vị trí hình thành băng, dẫn đến giảm hiệu quả tổng thể mặc dù nồng độ danh nghĩa được tăng lên.

Dựa trên kết quả, nồng độ YMPE 0,5% được chọn để nghiên cứu sâu hơn trong hệ thống mô hình tôm đông lạnh rã đông, vì nó mang lại mức tăng trọng cao nhất và giảm hàm lượng nước có thể đóng băng hiệu quả hơn so với các nồng độ YMPE khác.

3.4. Tác dụng bảo vệ chống đông lạnh của chiết xuất protein sâu bột vàng đối với tôm đông lạnh rã đông

3.4.1. Tổn thất khi rã đông và tổn thất khi nấu

Khả năng giữ nước là một chỉ tiêu chất lượng quan trọng của hải sản đông lạnh, vì sự mất nước quá mức trong quá trình rã đông và nấu chín có thể làm giảm kết cấu, độ mọng nước và chất lượng cảm quan tổng thể của sản phẩm. Mức hao hụt khi rã đông phản ánh mức độ duy trì tính toàn vẹn của mô cơ trong quá trình đông lạnh, được thể hiện qua lượng dịch rỉ ra sau khi rã đông, trong khi hao hụt khi nấu chín phản ánh tác động kết hợp của sự giải phóng nước và quá trình biến tính protein trong xử lý nhiệt.

Kết quả cho thấy tổn thất khi rã đông và khi nấu chín của tất cả các mẫu tôm đều chịu ảnh hưởng đáng kể bởi phương pháp ngâm và số chu kỳ đông lạnh – rã đông (P < 0,05), đồng thời tăng lên khi số chu kỳ đông lạnh – rã đông tăng (Hình 2). Các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp lại thúc đẩy sự hình thành và tái kết tinh của tinh thể băng, làm phá vỡ cấu trúc sợi cơ và tế bào, từ đó làm gia tăng lượng nước thất thoát trong quá trình rã đông (Cao và cs., 2022).

Trong các nghiệm thức, tôm ngâm trong nước cất (DW) có mức hao hụt khi rã đông (Hình 2A) và khi nấu chín (Hình 2B) cao nhất (P < 0,05), trong khi tôm xử lý bằng dung dịch phosphat hỗn hợp (MP) luôn có giá trị thấp nhất (P < 0,05). Kết quả này có thể liên quan đến khả năng tăng cường giữ nước của phosphat, như đã thể hiện ở Bảng 2. Tôm ngâm trong dung dịch chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE) có mức hao hụt khi rã đông và khi nấu chín nằm giữa nhóm đối chứng âm (DW) và đối chứng dương (MP), cho thấy YMPE có tác dụng bảo vệ lạnh ở một mức độ nhất định.

Việc giảm hao hụt khi rã đông và khi nấu chín ở nghiệm thức YMPE phù hợp với kết quả của Kittiphattanabawon, Temdee và cộng sự (2024), khi các tác giả ghi nhận rằng peptide liên kết băng thu được từ gelatin thủy phân da cá rô phi sông Nile có khả năng duy trì hiệu quả khả năng giữ nước của tôm sau quá trình rã đông và nấu chín. Những kết quả này cho thấy YMPE góp phần bảo tồn khả năng giữ nước thông qua việc tăng cường các tương tác protein–protein và protein–nước được hình thành trong quá trình ngâm. Quan sát này cũng phù hợp với kết quả về sự giảm hàm lượng nước có thể đóng băng được trình bày ở Bảng 2. Hàm lượng nước có thể đóng băng thấp hơn ở các mẫu xử lý bằng MP và YMPE phản ánh sự giảm đáng kể quá trình hình thành tinh thể băng, từ đó hạn chế tổn thương mô cơ và cải thiện khả năng giữ nước.

Đáng chú ý, mặc dù các peptide có đặc tính tương tự protein chống đông (AFP) được xác định là có vai trò quan trọng trong việc ức chế sự tái kết tinh của băng và làm thay đổi đáng kể đặc tính nhiệt, thể hiện qua sự giảm enthalpy trong Hình 1, kết quả này khẳng định rằng hiệu quả bảo vệ chống đông của YMPE không phụ thuộc vào một cơ chế liên kết đặc hiệu duy nhất mà nhiều khả năng được chi phối bởi cơ chế đa phương thức.

Là một dịch chiết thô, YMPE không chỉ chứa protein mà còn chứa các hợp chất hòa tan trong nước được đồng chiết xuất, chẳng hạn như các loại đường tự nhiên (ví dụ trehalose) và khoáng chất. Các thành phần này có thể hoạt động như chất điều hòa áp suất thẩm thấu, góp phần hạ thấp điểm đóng băng và ổn định cấu trúc tự nhiên của protein (Storey & Storey, 2012). Bên cạnh đó, đặc tính ưa nước của nền protein thô có thể tạo ra hiệu ứng bao phủ bề mặt, làm giảm sự mất nước và hình thành hàng rào hạn chế sự lan truyền của tinh thể băng. Vì vậy, khả năng duy trì chất lượng của tôm xử lý bằng YMPE có thể là kết quả của tác động hiệp đồng giữa các peptide liên kết băng và các cơ chế bảo vệ chống đông tổng quát này.

Tuy nhiên, hiệu quả hạn chế hao hụt của YMPE vẫn thấp hơn so với dung dịch phosphat hỗn hợp, có thể do sự khác biệt về cấu trúc phân tử cũng như khả năng ổn định protein sợi cơ kém hơn trong quá trình chế biến. Mặc dù Bar và cộng sự (2008) đã báo cáo rằng protein chống đông trong YMPE có độ bền nhiệt lên đến 66 °C, điều này có thể góp phần bảo vệ sản phẩm trong quá trình nấu chín, nhưng hiệu quả vẫn thấp hơn so với khả năng ổn định hóa học mà phosphat mang lại.

3.4.2. Hoạt động của AG và NAG

Hoạt tính của α-glucosidase (AG) và β-N-acetyl-glucosaminidase (NAG) là những chỉ thị quan trọng phản ánh sự rò rỉ enzyme từ lysosome, qua đó đánh giá mức độ tổn thương màng tế bào cơ trong quá trình đông lạnh – rã đông. Kết quả cho thấy hoạt tính của cả AG và NAG đều tăng đáng kể theo số chu kỳ đông lạnh – rã đông ở tất cả các nghiệm thức (P < 0,05) (Hình 3), đồng thời có mối liên hệ với mức hao hụt do rã đông (Hình 2A). Xu hướng này cho thấy tổn thương tích lũy do các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp lại, làm màng tế bào bị phá vỡ ngày càng nghiêm trọng và tạo điều kiện cho các enzyme này rò rỉ vào dịch tiết. Sự gia tăng dần hoạt tính của AG và NAG sau mỗi chu kỳ đông lạnh – rã đông nhấn mạnh vai trò của việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào trong bảo quản chất lượng tôm. Mối tương quan chặt chẽ giữa sự rò rỉ enzyme và sự thoái hóa mô cơ cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây, trong đó cho thấy các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp đi lặp lại làm gia tăng hiện tượng phá vỡ màng tế bào, thúc đẩy quá trình thủy phân enzyme và làm suy giảm cấu trúc tổng thể của mô cơ (Kingwascharapong & Benjakul, 2016; Kittiphattanabawon, Sriket, et al., 2024).

Trong các nghiệm thức xử lý, tôm xử lý bằng nước cất (DW) có hoạt tính AG và NAG cao nhất sau 5 chu kỳ đông lạnh – rã đông (P < 0,05), phản ánh mức độ vỡ lysosome và thoái hóa cơ nghiêm trọng. Ngược lại, tôm xử lý bằng dung dịch phosphat hỗn hợp (MP) ghi nhận hoạt tính của hai enzyme này thấp nhất (P < 0,05), trong khi nghiệm thức xử lý bằng YMPE có mức rò rỉ enzyme ở mức trung bình. Tác dụng bảo vệ của phosphat hỗn hợp có thể liên quan đến khả năng ổn định protein cơ và duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào thông qua việc cân bằng lực ion và hạn chế sự biến tính của protein (Liu et al., 2023). Trong khi đó, YMPE giúp ổn định màng tế bào trước tổn thương do quá trình đông lạnh – rã đông nhờ sự tương tác của các peptide giống AFP trong YMPE (Bảng 1) với bề mặt màng, từ đó làm giảm sự phá vỡ cơ học do quá trình hình thành và tái kết tinh tinh thể băng (Kristiansen, 2020). Sự ổn định của màng tế bào góp phần hạn chế sự giải phóng các enzyme lysosome như AG và NAG.

3.4.3. Tính chất lý hóa

Các đặc tính lý hóa của tôm được xử lý bằng nước cất, hỗn hợp phosphat và YMPE trải qua quá trình đông lạnh-rã đông được thể hiện trong Hình 4. Với số chu kỳ đông lạnh-rã đông tăng lên, độ hòa tan protein (Hình 4A) và hoạt tính Ca²⁺ -ATPase ( Hình 4B ) giảm, trong khi độ kỵ nước bề mặt (Hình 4C) và hàm lượng liên kết disulfide ( Hình 4D ) tăng lên ở tất cả các nghiệm thức (P  < 0,05). Tôm được xử lý bằng hỗn hợp phosphat cho thấy độ hòa tan protein và hoạt tính Ca²⁺ -ATPase cao nhất, cùng với độ kỵ nước bề mặt và hàm lượng liên kết disulfide thấp nhất (P < 0,05). Điều thú vị là, tôm được xử lý bằng YMPE cho thấy độ hòa tan protein thấp hơn so với tôm được xử lý bằng nước cất (P < 0,05) nhưng vẫn giữ được hoạt tính Ca²⁺ -ATPase cao hơn đáng kể (P < 0,05), cho thấy sự bảo tồn một phần chức năng protein sợi cơ. Việc duy trì hoạt tính Ca²⁺ -ATPase ở tôm được xử lý bằng YMPE phù hợp với việc duy trì hoạt tính AG và NAG được quan sát thấy trong cùng nghiệm thức (Hình 3), càng chứng tỏ tác dụng bảo vệ tiềm tàng của YMPE đối với tính toàn vẹn của cơ bắp trong các chu kỳ đông lạnh-rã đông.

Sự hiện diện của các protein có đặc tính tương tự protein chống đông (AFP) trong YMPE (Bảng 1) góp phần duy trì hoạt tính Ca²⁺-ATPase ở tôm được xử lý bằng YMPE thông qua việc giảm thiểu tổn thương cơ học do tinh thể băng gây ra đối với các protein sợi cơ. Các peptide này chứa các gốc threonine và cysteine, có cấu trúc tương đồng với các motif liên kết băng của AFP từ Tenebrio molitor, nhờ đó có khả năng tương tác với bề mặt tinh thể băng và làm giảm tổn thương cơ học trong quá trình đông lạnh – rã đông (Kristiansen, 2020). Tuy nhiên, sự suy giảm độ hòa tan của protein quan sát được ở tôm xử lý bằng YMPE có thể bắt nguồn từ sự gia tăng tính kỵ nước bề mặt và sự hình thành các liên kết disulfide (Hình 4C và D) do các axit amin chứa lưu huỳnh trong YMPE gây ra, thay vì do sự biến tính của protein sợi cơ. Nhận định này được củng cố bởi hàm lượng cysteine (252 mg/100 g) và methionine (181 mg/100 g) cao trong protein của sâu bột vàng đã được báo cáo trước đó (Pasini và cộng sự, 2022). Sự lộ ra của các gốc kỵ nước thúc đẩy quá trình kết tụ protein, trong khi các liên kết disulfide phản ánh hiện tượng liên kết ngang cộng hóa trị hình thành từ quá trình oxy hóa các nhóm thiol (Fass & Thorpe, 2018; Wei và cộng sự, 2023). Do đó, các tập hợp protein không hòa tan được hình thành có khả năng tạo thành một lớp phủ hoặc hàng rào bảo vệ kỵ nước trên bề mặt sợi cơ. Cấu trúc này giúp hạn chế sự di chuyển của nước và giảm sự phá vỡ vật lý trong quá trình đông lạnh – rã đông, qua đó giải thích việc cấu trúc cơ vẫn được bảo tồn mặc dù độ hòa tan của protein giảm đáng kể và tính kỵ nước bề mặt tăng lên.

Do đó, YMPE có thể tạo ra hiệu ứng bảo vệ một phần protein cơ tôm khỏi tác hại của đông lạnh bằng cách ức chế sự phát triển và tái kết tinh của tinh thể băng. Tuy nhiên, hiệu ứng này không hoàn toàn ngăn chặn sự kết tụ và liên kết chéo của protein, bằng chứng là độ hòa tan của protein thấp hơn, độ kỵ nước bề mặt tăng lên và hàm lượng liên kết disulfide tăng lên ở tôm được xử lý bằng YMPE. Những phát hiện này cho thấy rằng trong khi YMPE có thể giúp hạn chế tổn thương sợi cơ do tinh thể băng gây ra, nó cũng thúc đẩy một mức độ kết tụ protein nhất định thông qua quá trình oxy hóa thiol tăng cường và tương tác kỵ nước.

3.4.4. Lực cắt và màu sắc

Ảnh hưởng của các nghiệm thức ngâm gồm nước cất (DW), dung dịch phosphat hỗn hợp (MP) và dung dịch chiết xuất protein từ sâu bột vàng (YMPE) đến lực cắt và màu sắc của tôm sau các chu kỳ đông lạnh – rã đông được trình bày trong Bảng 3. Kết quả cho thấy lực cắt của cơ tôm tăng đáng kể (P < 0,05) khi số chu kỳ đông lạnh – rã đông tăng lên ở tất cả các nghiệm thức. Sự gia tăng này phản ánh sự thay đổi theo hướng dai hơn của cấu trúc cơ tôm do quá trình đông lạnh – rã đông lặp lại, làm thúc đẩy hiện tượng mất nước, biến tính protein và kết tụ các protein sợi cơ. Trong các nghiệm thức, tôm được ngâm trong dung dịch phosphat hỗn hợp luôn có lực cắt thấp nhất ở tất cả các giai đoạn đông lạnh – rã đông. Kết quả này được giải thích bởi tác dụng bảo vệ lạnh của phosphat, giúp tăng khả năng giữ nước của protein cơ thông qua việc làm tăng điện tích âm trên bề mặt sợi cơ, từ đó giảm tương tác giữa các phân tử protein và hạn chế sự kết tụ trong suốt các chu kỳ đông lạnh – rã đông (Liu và cộng sự, 2023). Ngược lại, tôm ngâm trong nước cất có lực cắt cao nhất sau 1 và 5 chu kỳ đông lạnh – rã đông, cho thấy mức độ suy giảm cấu trúc lớn nhất. Hiện tượng này có thể liên quan đến sự mất nước mạnh, biến tính và kết tụ protein cơ, làm tăng độ dai của thịt tôm, phù hợp với tỷ lệ hao hụt khi rã đông cao được ghi nhận ở nghiệm thức nước cất (Hình 2A). Trong khi đó, tôm được xử lý bằng YMPE có lực cắt thấp hơn so với nghiệm thức nước cất nhưng vẫn cao hơn nghiệm thức MP (P < 0,05). Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Song và cộng sự (2019), trong đó cà rốt, dưa chuột, bí ngòi và hành tây được xử lý bằng protein chống đông chiết xuất từ ấu trùng Tenebrio molitor có lực phá vỡ cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng sau 3 ngày bảo quản ở -2 °C.

Bảng 3. Ảnh hưởng của các phương pháp ngâm tẩm đến lực cắt và màu sắc của tôm trải qua các chu kỳ đông lạnh-rã đông khác nhau. Tôm được ngâm trong nước cất (DW), dung dịch phosphat hỗn hợp (MP) và dung dịch chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE) trước khi đông lạnh-rã đông.

Dữ liệu được hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 3), và sự khác biệt thống kê ở cùng một thông số được biểu thị bằng các chữ cái viết thường và viết hoa khác nhau, lần lượt thể hiện sự so sánh giữa các nghiệm thức trong mỗi chu kỳ đông-tan và sự so sánh giữa các chu kỳ trong mỗi nghiệm thức (P < 0,05).

Mặc dù tôm được xử lý bằng YMPE có độ hòa tan protein thấp hơn so với nhóm xử lý bằng nước cất, đồng thời thể hiện độ kỵ nước bề mặt và hàm lượng liên kết disulfide cao nhất (Hình 4C và D), lực cắt của nhóm này lại thấp hơn so với nhóm đối chứng sử dụng nước cất. Kết quả này cho thấy khả năng duy trì tính toàn vẹn của cơ tôm nhờ YMPE, được phản ánh qua hoạt động của các enzyme lysosome (Hình 3) và hoạt tính Ca²⁺-ATPase (Hình 4B), có vai trò bảo vệ lạnh hiệu quả hơn so với tác động của sự kết tụ protein do quá trình oxy hóa các nhóm thiol từ các axit amin chứa lưu huỳnh có trong YMPE. Đáng chú ý, mặc dù tôm xử lý bằng YMPE có độ hòa tan protein thấp nhất, đồng thời có độ kỵ nước bề mặt (Hình 4C) và hàm lượng liên kết disulfide (Hình 4D) cao nhất, lực cắt vẫn thấp hơn so với nhóm xử lý bằng nước cất. Điều này cho thấy YMPE đã mang lại khả năng bảo vệ một phần đối với sự suy giảm cấu trúc của cơ. Tác dụng này có thể liên quan đến sự hiện diện của các protein có đặc tính tương tự AFP trong YMPE (Bảng 1), có khả năng can thiệp vào quá trình hình thành các tinh thể băng lớn trong quá trình đông lạnh, từ đó làm giảm tổn thương cấu trúc. Bên cạnh đó, việc duy trì hoạt tính của AG và NAG (Hình 3) ở nhóm xử lý bằng YMPE cho thấy tính toàn vẹn của màng lysosome được bảo tồn tốt hơn, phản ánh mức độ tổn thương tế bào thấp hơn trong các chu kỳ đông lạnh – rã đông. Tương tự, hoạt tính Ca²⁺-ATPase cao hơn (Hình 4B) cho thấy màng sợi cơ được duy trì tốt hơn, góp phần bảo tồn cấu trúc cơ và hạn chế sự kết tụ protein. Mặc dù độ kỵ nước bề mặt và hàm lượng liên kết disulfide tăng cho thấy hiện tượng kết tụ protein xảy ra, nhưng hiện tượng này không dẫn đến sự thay đổi bất lợi về kết cấu, cụ thể là không làm cơ tôm trở nên dai hơn. Ngược lại, các tương tác này có thể đã tạo thành một mạng lưới ổn định giúp bảo tồn tính toàn vẹn của cơ hiệu quả hơn so với nhóm đối chứng, từ đó làm giảm lực cắt và cải thiện các đặc tính kết cấu của tôm được xử lý bằng YMPE so với nhóm xử lý bằng nước cất.

Ngược lại, giá trị L* hầu như không bị ảnh hưởng bởi các chu kỳ đông lạnh – rã đông, ngoại trừ ở tôm xử lý bằng MP, trong đó giá trị L* tăng đáng kể sau chu kỳ thứ năm (P < 0,05). Sau các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp lại, tôm xử lý bằng MP, YMPE và nước cất (DW) đều ghi nhận giá trị L* giảm dần (P < 0,05). Kết quả này cho thấy hỗn hợp phosphat có khả năng duy trì tính đồng nhất và độ phản xạ ánh sáng của bề mặt dịch đồng hóa tôm tốt hơn so với YMPE và nước cất. Hiệu quả này có thể liên quan đến khả năng của phosphat trong việc ổn định protein sợi cơ và tăng cường giữ nước, từ đó tạo nên cấu trúc dịch đồng hóa mịn và đồng nhất hơn, giúp cải thiện khả năng phản xạ ánh sáng trong quá trình đo màu. Nhận định này phù hợp với kết quả hao hụt khi rã đông thấp hơn ở tôm xử lý bằng MP (Hình 2A), phản ánh khả năng giữ nước và duy trì độ mịn bề mặt tốt hơn so với các nghiệm thức còn lại. Đối với giá trị a*, tôm xử lý bằng nước cất (DW) có giá trị a* giảm đáng kể sau quá trình đông lạnh – rã đông (P < 0,05), trong khi quá trình này không làm thay đổi giá trị a* ở các mẫu xử lý bằng MP và YMPE (P > 0,05). Giá trị a* của hai nghiệm thức MP và YMPE không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05), nhưng đều cao hơn so với nghiệm thức DW (P < 0,05). Giá trị b* tăng đáng kể ở tất cả các nghiệm thức sau các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp lại, có thể do sự giải phóng astaxanthin – sắc tố tự nhiên tạo nên màu vàng của tôm – trong quá trình đông lạnh và rã đông (Kingwascharapong & Benjakul, 2016). Sự giảm giá trị a* đồng thời với sự gia tăng giá trị b* có thể liên quan đến quá trình oxy hóa astaxanthin và sự phân ly giữa sắc tố với protein do hiện tượng biến tính, phản ánh sự suy giảm tính ổn định vật lý của cấu trúc cơ. Nhận định này được củng cố bởi sự gia tăng hoạt tính AG và NAG (Hình 3) cùng với sự giảm hoạt tính Ca²⁺-ATPase (Hình 4B), cho thấy tính toàn vẹn của mô cơ bị suy giảm và các vị trí liên kết sắc tố có thể bị phá vỡ. Hệ quả là sắc đỏ bị nhạt dần, làm cho mẫu tôm có màu sắc kém tươi hơn. So với nghiệm thức DW, tôm xử lý bằng MP có giá trị b* cao hơn (P < 0,05), trong khi nghiệm thức YMPE ghi nhận giá trị b* cao nhất (P < 0,05). Điều này cho thấy các sắc tố hoặc các hợp chất có khả năng ổn định sắc tố có nguồn gốc từ protein sâu bột vàng có thể góp phần làm tăng độ vàng của tôm trong suốt các chu kỳ đông lạnh – rã đông. Hiện tượng này có thể liên quan đến sự hiện diện tự nhiên của các sản phẩm phản ứng Maillard được hình thành trong quá trình chế biến dịch chiết protein sâu bột vàng, vốn tạo nên màu vàng đặc trưng.

3.4.5. Cấu trúc vi mô

Cấu trúc vi mô của cơ tôm ở các mẫu tươi và các mẫu trải qua năm chu kỳ đông lạnh – rã đông dưới ba nghiệm thức khác nhau gồm nước cất (DW), hỗn hợp phosphat (MP) và chiết xuất protein từ sâu bột vàng (YMPE) được thể hiện trong Hình 5. Ở các mẫu tươi (DW-F, MP-F và YMPE-F), cấu trúc vi mô đều được bảo tồn tốt, với các sợi cơ sắp xếp chặt chẽ và khoảng cách giữa các sợi rất nhỏ. Đặc điểm này phản ánh tính toàn vẹn của cấu trúc sợi cơ vẫn được duy trì khi mẫu chưa chịu tác động của các chu kỳ đông lạnh – rã đông.

Sau năm chu kỳ đông lạnh – rã đông, mẫu tôm xử lý bằng nước cất (DW-5) xuất hiện các tổn thương nghiêm trọng về cấu trúc siêu nhỏ, biểu hiện qua sự tách rời rộng rãi giữa các sợi cơ, khoảng cách giữa các tế bào gia tăng và sự hình thành các vết nứt lớn trong mạng lưới sợi cơ. Những biến đổi này được cho là bắt nguồn từ sự hình thành và tái kết tinh của các tinh thể băng có kích thước lớn, gây phá hủy cơ học các sợi cơ và làm tăng hiện tượng mất nước trong quá trình rã đông. Ngược lại, các mẫu xử lý bằng MP (MP-5) vẫn duy trì được cấu trúc siêu nhỏ tương đối nguyên vẹn, với mức độ tách rời giữa các sợi cơ rất thấp và tổn thương cấu trúc được hạn chế đáng kể. Kết quả này cho thấy tác dụng bảo vệ chống đông của các hợp chất phosphat, thông qua khả năng tăng cường giữ nước, ổn định protein sợi cơ và hạn chế sự phát triển của tinh thể băng nhờ cơ chế liên kết với nước và tạo phức chelat với protein (Tian và cộng sự, 2022). Quan sát này cũng phù hợp với kết quả về tỷ lệ mất nước khi rã đông thấp hơn ở mẫu MP (Hình 2A), cùng với mức độ biến tính protein thấp hơn thể hiện qua Hình 3 và Hình 4B. Đối với mẫu xử lý bằng YMPE (YMPE-5), cấu trúc mô cơ được bảo vệ ở mức trung gian. Mặc dù vẫn xuất hiện một số vết nứt và hiện tượng tách rời giữa các sợi cơ, nhưng nhìn chung tính toàn vẹn của mô cơ vẫn được duy trì tốt hơn so với mẫu xử lý bằng nước cất. Khả năng bảo vệ này có thể liên quan đến sự hiện diện của các protein có đặc tính tương tự AFP trong YMPE (Bảng 1) cùng với tác dụng chống đông của chúng, được phản ánh qua việc giảm hàm lượng nước có thể đóng băng (Bảng 2), hoạt tính NAG và AG thấp hơn (Hình 3) và hoạt tính Ca²⁺-ATPase cao hơn (Hình 4B) so với mẫu đối chứng xử lý bằng nước cất. Các protein có đặc tính tương tự AFP này có thể ức chế quá trình tái kết tinh băng bằng cách liên kết với bề mặt tinh thể băng thông qua các gốc threonine có khả năng liên kết băng (Zachariassen và cộng sự, 2011), từ đó hạn chế sự phát triển của tinh thể băng và giảm tổn thương cơ học, như được minh họa trong sơ đồ cơ chế đề xuất (Hình 6).

Cơ chế bảo vệ chống đông của YMPE được đề xuất (Hình 6) dựa trên sự tương tác đa cơ chế giữa các peptide có đặc tính chống đông và hệ thống cơ trong quá trình đông lạnh. Khi không có chất bảo vệ chống đông (DW), quá trình hình thành và tái kết tinh băng diễn ra không được kiểm soát, tạo ra các tinh thể băng lớn và không đồng đều. Các tinh thể này gây tổn thương cơ học cho sợi cơ, dẫn đến sự tách rời giữa các sợi, làm sụp đổ cấu trúc mô và làm tăng lượng dịch rỉ sau khi rã đông. Ngược lại, các mẫu được xử lý bằng YMPE biểu hiện cơ chế bảo vệ khác biệt. Các peptide có đặc tính tương tự protein chống đông được xác định, với các motif liên kết băng được bảo tồn, được giả thuyết có khả năng hấp phụ lên bề mặt tinh thể băng, từ đó ức chế quá trình tái kết tinh và hạn chế sự phát triển của các tinh thể. Kết quả là các tinh thể băng hình thành có kích thước nhỏ hơn và phân bố đồng đều hơn, qua đó làm giảm ứng suất cơ học tác động lên cấu trúc siêu vi của cơ. Bên cạnh hoạt tính chống đông đặc hiệu này, nền giàu protein của YMPE còn tạo ra tác dụng bảo vệ thứ cấp thông qua việc hình thành một lớp phủ liên kết trên bề mặt các sợi cơ. Lớp phủ này tăng cường tương tác giữa protein và nước, làm giảm khả năng di chuyển của nước, đồng thời đóng vai trò như một hàng rào vật lý hạn chế sự lan truyền của tinh thể băng và sự mất nước. Ngoài ra, các thành phần có khối lượng phân tử thấp được đồng chiết xuất, chẳng hạn như đường và khoáng chất, có thể hoạt động như các chất điều hòa áp suất thẩm thấu, góp phần ổn định cấu trúc protein trong suốt quá trình đông lạnh. Tác động phối hợp của việc ức chế tái kết tinh băng, bảo vệ cấu trúc và ổn định nước giúp duy trì tính toàn vẹn của mô cơ, được thể hiện qua việc giảm rò rỉ enzyme, duy trì hoạt tính của Ca²⁺-ATPase và cải thiện tính toàn vẹn của cấu trúc vi mô. Cơ chế hiệp đồng này tạo nên sự khác biệt giữa YMPE và các chất bảo vệ lạnh thông thường, vốn chủ yếu dựa trên việc điều chỉnh cường độ ion và độ pH.

Để đánh giá một cách toàn diện hiệu quả bảo vệ trong quá trình đông lạnh, hiệu suất của YMPE được so sánh với nhóm đối chứng âm (DW) và nhóm đối chứng dương (MP) trên tất cả các chỉ tiêu đánh giá, với kết quả được trình bày trong Bảng 4. Mặc dù nhóm MP cho thấy hiệu quả vượt trội hơn, YMPE vẫn luôn cải thiện các đặc tính chất lượng quan trọng so với nhóm DW, qua đó cho thấy tiềm năng của YMPE như một giải pháp thay thế theo hướng nhãn sạch.

Bảng 4. Tóm tắt so sánh các đặc tính lý hóa, kết cấu và cấu trúc của tôm đông lạnh được xử lý bằng nước cất (DW), hỗn hợp phosphat (MP) và chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE).

4. Kết luận

Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của chiết xuất protein từ sâu bột vàng (Tenebrio molitor) (YMPE) như một chất bảo vệ sinh học chống đông lạnh cho tôm thẻ chân trắng đông lạnh. Phân tích proteomics đã xác định được các peptide có đặc tính tương tự protein chống đông, chứa các motif liên kết băng được bảo tồn, qua đó cung cấp bằng chứng ở cấp độ phân tử cho hoạt tính bảo vệ chống đông của YMPE. Việc xử lý bằng phương pháp ngâm giúp cải thiện khả năng giữ nước, bảo tồn một phần chức năng của protein sợi cơ và giảm thiểu các tổn thương cấu trúc siêu vi do quá trình đông lạnh – rã đông lặp lại gây ra. Mặc dù hỗn hợp phosphat vẫn là nghiệm thức mang lại hiệu quả cao nhất, YMPE luôn thể hiện kết quả vượt trội so với nhóm đối chứng không xử lý ở nhiều chỉ tiêu lý hóa, hoạt tính enzym và cấu trúc mô. Đáng chú ý, đây là nghiên cứu đầu tiên đánh giá một cách toàn diện chiết xuất protein có nguồn gốc từ côn trùng như một chất bảo vệ chống đông trong hệ thống hải sản dựa trên cơ, đồng thời kết hợp giữa phân tích proteomics và xác nhận chức năng. Những kết quả này khẳng định tiềm năng của YMPE như một giải pháp thay thế nhãn sạch cho các chất phụ gia phosphat truyền thống trong chế biến hải sản. Tuy nhiên, nghiên cứu vẫn tồn tại một số hạn chế. Hoạt tính liên kết băng của các peptide được xác định mới chỉ được suy luận dựa trên sự tương đồng về trình tự, chưa được xác nhận bằng các thử nghiệm chức năng trực tiếp. Do đó, cần có thêm các nghiên cứu nhằm phân lập và đặc trưng hoạt tính cũng như động học của các peptide này. Ngoài ra, YMPE được sử dụng dưới dạng chiết xuất thô với hàm lượng protein 41,26%, trong khi sự hiện diện của các thành phần phi protein chưa được đặc trưng có thể tạo ra sự biến thiên phụ thuộc vào điều kiện nuôi sâu bột vàng. Vì vậy, việc chuẩn hóa nguyên liệu là cần thiết để đáp ứng yêu cầu ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Bên cạnh đó, mô hình đông lạnh – rã đông được sử dụng trong nghiên cứu chưa phản ánh đầy đủ quá trình tái kết tinh diễn ra dần dần trong suốt thời gian bảo quản đông lạnh kéo dài. Cuối cùng, sự gia tăng độ vàng (giá trị b*) ở tôm xử lý bằng YMPE cho thấy cần tiến hành các nghiên cứu đánh giá cảm quan trong tương lai nhằm xác định mức độ chấp nhận của người tiêu dùng.

Theo Phanat Kittiphattanabawon, Chodsana Sriket, Sitthipong Nalinanon, Narumon Phaonakrop, Sittiruk Roytrakul, Soottawat Benjakul,Wonnop Visessanguan

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643826005438

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Nuôi Cá Rô Phi Lai Trong Hệ Thống Sản Xuất Sinh Học Ngoài Trời
• Nồng Độ Nitrat Cao Gây Độc Cho Tôm
• Glutamate Tăng Cường Khả Năng Kháng Khuẩn Của Tôm Bằng Cách Tăng Cường Khả Năng Miễn Dịch Tế Bào Của Tôm