Phần 1: Tăng Cường Sức Đề Kháng Cho Cá Rô Phi: Tinh Dầu Chùm Ngây Cải Thiện Sự Phát Triển, Cấu Trúc Đường Ruột, Khả Năng Miễn Dịch Bẩm Sinh, Khả Năng Chống Oxy Hóa Và Khả Năng Chịu Đựng Amoniac Ở Cá Rô Phi

Tóm tắt

Nghiên cứu này đánh giá tiềm năng sử dụng tinh dầu Moringa oleifera (MEO) như một chất phụ gia thức ăn chức năng cho cá rô phi (Oreochromis niloticus), với trọng tâm là khả năng giảm thiểu stress do amoniac gây ra. Thí nghiệm được tiến hành trong 56 ngày trên 300 cá thể, được phân chia thành năm nhóm tương ứng với các mức bổ sung MEO gồm 0%, 0,5%, 1%, 1,5% và 2%.

Kết quả cho thấy việc bổ sung MEO cải thiện đáng kể hiệu suất tăng trưởng của cá, thể hiện qua sự gia tăng khối lượng cơ thể cuối cùng, tăng khối lượng, tốc độ tăng trưởng đặc trưng, lượng thức ăn tiêu thụ, hiệu quả sử dụng thức ăn và tỷ lệ hiệu quả protein, đồng thời làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR). Mức bổ sung MEO tối ưu cho tăng trưởng được xác định trong khoảng 1,3–1,4%.

Kết quả phân tích mô học cũng cho thấy MEO cải thiện đáng kể hình thái ruột so với nhóm đối chứng, thể hiện qua sự gia tăng chiều cao nhung mao, mật độ tế bào hình chén và mức độ phức tạp của sự phân nhánh nhung mao. Bên cạnh đó, các nhóm được bổ sung MEO có phản ứng miễn dịch cao hơn đáng kể, thể hiện qua sự gia tăng các chỉ tiêu miễn dịch bẩm sinh như hoạt tính lysozyme, nồng độ IgM và hoạt động thực bào.

Khả năng chống oxy hóa của cá cũng được cải thiện thông qua sự gia tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) và catalase (CAT), đồng thời làm tăng tổng lượng protein huyết thanh và giảm hàm lượng malondialdehyde (MDA). Ngoài ra, việc bổ sung MEO làm tăng đáng kể biểu hiện của các gen liên quan đến chức năng tiêu hóa, tăng trưởng, chống oxy hóa và miễn dịch, bao gồm chất vận chuyển oligopeptide (PepT1), mucin (Muc), yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF-1), thụ thể hormone tăng trưởng (GHR1), glutathione peroxidase (GPx), catalase (CAT), lysozyme (LYZ) và bổ thể (C3).

Sau khi cá tiếp xúc với amoniac, việc bổ sung MEO giúp tăng đáng kể khả năng chịu đựng amoniac của cá rô phi, thể hiện qua sự kéo dài giá trị LT50. Đồng thời, MEO góp phần làm giảm phản ứng stress thông qua việc hạ thấp nồng độ cortisol và glucose trong huyết tương.

Nhìn chung, kết quả nghiên cứu cho thấy việc bổ sung MEO vào khẩu phần ăn không chỉ cải thiện hiệu suất tăng trưởng mà còn điều chỉnh tích cực trạng thái sinh lý của cá thông qua ba cơ chế chính, gồm tăng cường chức năng miễn dịch, củng cố khả năng chống oxy hóa và hạn chế các rối loạn sinh lý do stress amoniac. Qua đó, MEO cho thấy tiềm năng trở thành một chất phụ gia thức ăn đa chức năng trong nuôi cá rô phi bền vững dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt.

1. Giới thiệu

Trong những thập kỷ gần đây, ngành nuôi trồng thủy sản đã phát triển mạnh mẽ, trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc đáp ứng nhu cầu ngày càng gia tăng của thế giới đối với nguồn protein từ thủy sản (Dawood và cộng sự, 2021). Tuy nhiên, tốc độ phát triển nhanh chóng này cũng đặt ra nhiều thách thức về mặt sinh lý đối với các quần thể cá nuôi, trong đó có tình trạng căng thẳng mãn tính, suy giảm chức năng miễn dịch và gia tăng nguy cơ mắc bệnh (Dawood và cộng sự, 2016; Dara và cộng sự, 2023). Trong số các yếu tố gây stress từ môi trường, độc tính amoniac là một vấn đề đặc biệt đáng quan tâm do có khả năng tác động bất lợi đến nhiều hệ thống sinh học. Amoniac có thể làm suy giảm hiệu suất tăng trưởng thông qua việc gây rối loạn quá trình trao đổi chất, thúc đẩy tổn thương oxy hóa và ức chế chức năng miễn dịch, từ đó ảnh hưởng đến phúc lợi của vật nuôi cũng như tính bền vững của hoạt động sản xuất (Zhang và cộng sự, 2012; Magouz và cộng sự, 2021). Những thách thức này đã thúc đẩy các nghiên cứu chuyên sâu nhằm phát triển những chiến lược dinh dưỡng mới, có khả năng nâng cao khả năng chống chịu stress của cá, đồng thời đáp ứng các yêu cầu về an toàn sinh thái và an toàn thực phẩm.

Trong bối cảnh này, các hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật đang được xem là những giải pháp thay thế đã được khoa học chứng minh cho các phương pháp truyền thống (Gonçalves et al., 2026). Các hợp chất này mang lại nhiều lợi ích chức năng, góp phần giải quyết những vấn đề sinh lý bệnh phức tạp phát sinh do các tác nhân gây căng thẳng trong nuôi trồng thủy sản (Moss et al., 2025; Ali et al., 2022; Pudota et al., 2025). Giá trị nổi bật của các hợp chất có nguồn gốc thực vật nằm ở khả năng tác động đa chức năng, bao gồm hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, điều hòa miễn dịch và kháng khuẩn, đồng thời có đặc tính thân thiện với môi trường (Parham et al., 2020; Pudota et al., 2025). So với các thuốc hóa trị liệu tổng hợp, các chất bổ sung có nguồn gốc thực vật phù hợp hơn với định hướng nuôi trồng thủy sản bền vững nhờ khả năng phân hủy sinh học, mức độ tác động sinh thái thấp và khả năng đáp ứng với các khung pháp lý ngày càng được phát triển liên quan đến việc sử dụng kháng sinh trong hệ thống sản xuất thực phẩm (Onomu & Okuthe, 2024).

Cây chùm ngây (Moringa oleifera) là một trong những cây thuốc nổi bật được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nhờ thành phần hóa học đặc trưng và các hoạt tính sinh học đã được chứng minh (Pareek et al., 2023). Các phương pháp phân tích hiện đại đã xác định nhiều hợp chất hoạt tính sinh học trong cây, bao gồm flavonoid glycoside, axit phenolic và các hợp chất chứa lưu huỳnh đặc trưng, góp phần tạo nên phổ hoạt tính dược lý đa dạng (Roy et al., 2022; El-Saadony et al., 2025). Các bộ phận khác nhau của cây, đặc biệt là lá, hạt và tinh dầu, sở hữu những đặc tính sinh học riêng biệt và có thể được ứng dụng trong dinh dưỡng nuôi trồng thủy sản (Dawood et al., 2022). Các chế phẩm từ lá, giàu hợp chất polyphenol, cho thấy hiệu quả trong việc giảm stress oxy hóa. Trong khi đó, chiết xuất từ hạt chứa glucosinolate thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rõ rệt trên một số loài thủy sản như cá rô phi (Kamble et al., 2024a; Nassar et al., 2024b) và cá hồi vân (Sanchooli et al., 2023). Bên cạnh đó, tinh dầu chùm ngây, với hàm lượng cao các terpen có hoạt tính sinh học, cho thấy tiềm năng trong việc cải thiện sức khỏe đường ruột, bảo vệ gan và nâng cao hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng (Samtiya et al., 2021; Chiș et al., 2023). Những lợi ích này đã được ghi nhận ở một số loài thủy sản, trong đó có tôm càng nước ngọt khổng lồ (Kaleo et al., 2019a) và cá rô phi (Gbadamosi et al., 2016).

Tinh dầu Moringa oleifera đang nhận được sự quan tâm đáng kể từ giới nghiên cứu với vai trò là một chất phụ gia thức ăn chức năng, nhờ khả năng đồng thời khắc phục nhiều hạn chế trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản thâm canh (Marrufo et al., 2013). Thành phần phức tạp của tinh dầu, bao gồm các hợp chất dễ bay hơi cùng những nhóm hoạt chất đặc trưng như phytochemical, carotenoid và glucosinolate, mang lại nhiều tác động có lợi, từ hạn chế tổn thương mô do quá trình oxy hóa, điều hòa phản ứng viêm đến cải thiện hiệu quả chuyển đổi thức ăn (Kashyap et al., 2022).

Những đặc tính này cho thấy tinh dầu Moringa là một ví dụ tiềm năng về việc ứng dụng các giải pháp có nguồn gốc thực vật nhằm góp phần phát triển hệ thống nuôi trồng thủy sản bền vững hơn, trong đó chú trọng đến sức khỏe vật nuôi và đồng thời đáp ứng các mục tiêu về kinh tế và môi trường. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung tinh dầu Moringa oleifera (MEO) vào khẩu phần ăn đến hiệu suất tăng trưởng, sức khỏe đường ruột, tình trạng miễn dịch và khả năng chống oxy hóa của cá rô phi, đồng thời đánh giá tiềm năng của MEO trong việc nâng cao khả năng chống chịu của cá trước stress amoniac cấp tính.

2. Chuẩn bị nghiên cứu

2.1. Tuyên bố phê duyệt đạo đức

Nghiên cứu này đã nhận được sự phê duyệt về mặt đạo đức từ Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thí nghiệm (IACUC) thuộc Đại học Kafrelsheikh, Ai Cập (Số phê duyệt: KFS-IACUC/294/2025). Tất cả các quy trình thí nghiệm đều được thực hiện tuân thủ theo hướng dẫn và quy định của KFS-IACUC. Nghiên cứu cũng tuân thủ các tiêu chuẩn đạo đức của tổ chức và tuân theo hướng dẫn báo cáo ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

2.2. Chiết xuất tinh dầu Moringa oleifera (MEO)

Lá tươi của cây Moringa oleifera được thu mua từ một chợ địa phương ở Kafrelsheikh, Ai Cập. Chiết xuất ethanol được điều chế theo một quy trình đã được thiết lập (Ugwu et al., 2013). Lá được rửa sạch bằng nước cất, phơi khô ở nhiệt độ phòng (28–35°C) trong 28 ngày, và nghiền mịn bằng máy nghiền tốc độ cao. Một kilogram bột thu được được ngâm trong một lít ethanol 100% trong 55 giờ. Dung dịch được lọc hai lần qua giấy lọc có kích thước lỗ 2 μm, và dịch lọc được cô đặc bằng máy cô quay ở 50°C. Hiệu suất cuối cùng là 92,5 g chiết xuất trên mỗi kg bột lá khô. Chiết xuất được hòa tan lại trong nước cất (1 g trong 10 mL) và bảo quản ở 4°C.

2.3. Khẩu phần ăn thử nghiệm

Năm công thức thức ăn thử nghiệm chứa các mức độ tinh dầu Moringa (MEO; 0, 5, 10, 15 và 20 g/kg thức ăn) khác nhau đã được xây dựng (Bảng 1). Đầu tiên, MEO được đồng nhất hóa với dầu cá trong thức ăn ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp này sau đó được kết hợp với các thành phần nghiền khác trước khi ép viên ngay lập tức với sự có mặt của nước (30–40%). Quá trình này được thực hiện nhanh chóng để hạn chế sự bay hơi. Các viên thức ăn thu được được sấy khô trong không khí ở nhiệt độ môi trường và sau đó được bảo quản ở -20 °C cho đến khi sử dụng.

* Được tính toán bằng cách sử dụng giá trị đốt cháy của protein, lipid và carbohydrate lần lượt là 236, 395 và 172 kJ/ g, và carbohydrate được tính bằng hiệu số: 100 – (protein + lipid + tro).

^a Dehulled-SBM (46 %): Bột đậu nành đã tách vỏ, 46 % protein thô.

^b Hỗn hợp vitamin (g/kg khẩu phần): 0,10 β-caroten; 0,01 vitamin (D3); 0,05 vitamin (K3); 0,38 vitamin (E); 0,06 vitamin (B1); 0,19 vitamin (B2); 0,05 vitamin (B6); 0,0001 vitamin (B12); 0,01 biotin; 3,85 inositol; 0,77 niacin (axit nicotic); 0,27 Ca panthothenate; 0,01 axit folic; 7,87 cholin cholorua; 0,38 axit ρ-aminobenzoic; 1,92 xelulo. ⁴ Hỗn hợp khoáng (g/kg thức ăn): 5,07 MgSO₄; 3,23 Na₂HPO₄ ; 8,87 K₂HPO₄ ; 1,10 Fe xitrat; 12.09 Ca lactat; 0,01 Al(OH)₃ (Nhôm hydroxit); 0,13 ZnSO₄ ; 0,004 CuSO₄; 0,03 MnSO₄; 0,01 Ca(IO₃)²; 0,04CoSO_4.​

2.4. Điều kiện nuôi cá

Tổng cộng 300 cá rô phi giống (Oreochromis niloticus), có khối lượng ban đầu 6,15 ± 0,04 g, được thu mua từ một trại giống địa phương tại Alreyad, tỉnh Kafrelsheikh, Ai Cập. Cá được vận chuyển về phòng thí nghiệm và thích nghi trong thời gian 2 tuần. Trong giai đoạn này, cá được cho ăn thức ăn thương mại cơ bản có hàm lượng 30% protein thô. Sau thời gian thích nghi, những cá thể có kích thước tương đồng (6,15 ± 0,04 g) và tình trạng sức khỏe tốt, biểu hiện qua hoạt động bình thường và không có tổn thương rõ ràng, được lựa chọn và phân bố ngẫu nhiên vào 15 bể kính, với mật độ 20 cá thể/bể. Các bể được cung cấp khí nén liên tục thông qua hệ thống máy bơm khí. Cá được chia thành 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, và được cho ăn các khẩu phần thí nghiệm đến khi cá có biểu hiện no rõ rệt vào lúc 9:00 và 13:00 hằng ngày trong 8 tuần liên tục. Chu kỳ chiếu sáng được duy trì ở mức 12 giờ sáng : 12 giờ tối trong suốt thời gian thí nghiệm bằng đèn huỳnh quang. Để duy trì chất lượng nước, trong cả giai đoạn thích nghi và thời gian thí nghiệm, mỗi ngày ba phần tư lượng nước trong bể được hút ra nhằm loại bỏ phân và thức ăn dư thừa. Lượng nước này sau đó được thay thế bằng nước mới đã được sục khí đầy đủ từ bể chứa.

2.5. Các phép đo chất lượng nước

Mẫu nước được thu thập định kỳ hai tuần một lần ở độ sâu 15 cm tại mỗi bể cá nhằm đánh giá các thông số chất lượng nước. Oxy hòa tan (DO) và nhiệt độ (°C) được đo trực tiếp tại bể bằng máy đo oxy cầm tay, trong khi pH được xác định bằng máy đo pH kỹ thuật số mini (Hoa Kỳ). Nồng độ amoniac không ion hóa (NH₃) được xác định bằng bộ dụng cụ chuyên dụng của HACH Co. (Loveland, CO., Hoa Kỳ). Các thông số chất lượng nước được duy trì trong phạm vi bình thường, với nhiệt độ dao động từ 27,5–29,2 °C và nồng độ DO từ 5,4–5,7 mg/L. Nồng độ NH₃ lần lượt dao động trong khoảng 7,4–7,6 mg/L và 0,074–0,082 mg/L. Trong suốt thời gian thí nghiệm, các giá trị này đều được duy trì trong phạm vi chấp nhận được đối với nuôi cá theo El Basuini et al. (2020).

2.6. Hiệu suất tăng trưởng và sử dụng thức ăn

Vào cuối giai đoạn thí nghiệm, tất cả cá trong mỗi bể được tập hợp lại, đếm và cân theo nhóm. Các chỉ số hiệu suất tăng trưởng và thông số sử dụng thức ăn được tính toán theo (Dawood et al., 2016), như các phương trình sau:

– Tăng trọng lượng (WG; g) = W2 − W1;

– Tỷ lệ tăng trọng lượng (%) (WG%) = 100 (W2 − W1)/W1;

– Tốc độ tăng trưởng riêng (SGR; %/ngày) = 100 [Ln W2 (g) − Ln W1 (g)]/T,

trong đó W1 = trọng lượng ban đầu của cá, W2 = trọng lượng cuối cùng của cá, và T là thời gian nuôi (ngày);

– Lượng thức ăn tiêu thụ (FI) = tổng lượng thức ăn (g) cho cá trong suốt thời gian nuôi.

– Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) = lượng thức ăn tiêu thụ (FI)/ tăng trọng lượng (WG);

– Hiệu suất chuyển đổi thức ăn (FCE) = tăng trọng lượng sống (g) / lượng thức ăn khô tiêu thụ (g);

– Tỷ lệ hiệu quả protein (PER) = [tăng trọng lượng (WG) (g) ̸ lượng protein tiêu thụ (PI) (g)] × 100;

– Tỷ lệ sống của cá (%) = 100 (số lượng cá cuối cùng / số lượng cá ban đầu).

2.7. Phân tích hóa học sơ bộ

Vào cuối thí nghiệm cho ăn, các thành phần hóa học gần đúng của toàn bộ cơ thể cá được đánh giá theo phương pháp của (AOAC, 1998). Hàm lượng ẩm được đánh giá sau khi sấy khô trong lò ở 105 °C cho đến khi đạt trọng lượng khô không đổi. Hàm lượng protein thô (CP) được đo bằng thiết bị Micro-Kjeldahl, trong khi đó, hàm lượng lipid tổng được đánh giá bằng cách chiết xuất bằng ete dầu mỏ trong thiết bị Soxhlet trong 16 giờ. Hàm lượng tro được tính toán thêm từ sự giảm trọng lượng xảy ra sau khi đốt mẫu ở 550 °C trong 6 giờ trong lò nung. Năng lượng tổng (GE) được tính toán từ NRC (Council, 2011) là 16,7, 37,4 và 16,7 kJ/g lần lượt cho protein, lipid và carbohydrate.

2.8. Phân tích huyết học

Sau 8 tuần thử nghiệm cho ăn và 24 giờ nhịn ăn tiếp theo, máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi của năm con cá trong mỗi bể thí nghiệm. Với ba bể thí nghiệm cho mỗi nghiệm thức, tổng số mẫu để phân tích huyết học là 15 con cá cho mỗi nghiệm thức. Gây mê được thực hiện bằng tricaine methanesulfate (MS222; Sigma, St. Louis, MO, USA) ở nồng độ 150 mg/L, được đệm bằng natri bicarbonate để ổn định độ pH. Độ sâu của gây mê được đánh giá bằng cách quan sát sự mất thăng bằng, ngừng cử động mang và không phản ứng với việc véo đuôi (Rawling et al., 2009). Sau khi gây mê hoàn toàn, các mẫu máu được lấy bằng cách chọc tĩnh mạch đuôi và chuyển vào cả ống Eppendorf có heparin và không có heparin, như đã chỉ định.

Huyết tương và huyết thanh được tách bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 15 phút. Các thông số huyết học (thể tích hồng cầu lắng, tổng hemoglobin, hồng cầu, bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ái toan và bạch cầu ái kiềm) được phân tích trong huyết tương bằng máy phân tích lâm sàng bán tự động (Model 2000 Evolution, EMEG) với que thử của Bayer Diagnostics theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phân tích sinh hóa bao gồm đo quang phổ tổng cholesterol và triglyceride (máy phân tích SPOTCHEM™ EZ SP-4430) (Tatsumi, 2000), xác định màu glucose, tổng protein và men gan (Alanine transaminase (ALT), Aspartate aminotransferase (AST)) ở bước sóng 540 nm (Reitman và Frankel, 1957). Nồng độ creatinine trong huyết thanh được đánh giá theo phương pháp của (Henry, 1974), trong khi nồng độ urê (nitơ urê máu, BUN) được đánh giá theo (Coulombe và Favreau, 1963).

Sau khi lấy máu, cá được mổ xẻ để lấy nội tạng và gan. Các cơ quan này được cân và đo chiều dài riêng lẻ để tính toán ba chỉ số hình thái quan trọng:

1. Chỉ số thể trọng nội tạng (VSI) = (Trọng lượng nội tạng / Trọng lượng cá) × 100.
2. Chỉ số gan-thể trọng (HSI) = (Trọng lượng gan / Trọng lượng cá) × 100.

2.9. Khám nghiệm mô học

Cá được bắt bằng lưới và gây mê trong hộp nhựa chuyên dụng với dầu đinh hương (2–3 giọt trên mỗi lít nước) cho đến khi hoàn toàn bất tỉnh (2–3 phút), tuân thủ theo hướng dẫn ARRIVE. Sau khi gây mê, ba con cá từ mỗi bể thí nghiệm (n = 3 bể cho mỗi nhóm điều trị) được lấy mẫu, tổng cộng chín con cá cho mỗi nhóm điều trị được chọn để đánh giá hình thái ruột. Theo các quy trình đạo đức đã được phê duyệt, cá được gây chết bằng cách cắt cổ trước khi mổ. Sau đó, khoang bụng được rạch và toàn bộ đường ruột được tách cẩn thận. Phần giữa của đường ruột được mổ tiếp thành các đoạn. Phân tích ruột được tiến hành trên ba con cá từ mỗi bể cá (n = 9 con cá/mỗi nghiệm thức). Phân tích hình thái mô định lượng bằng máy tính được thực hiện trên các hình ảnh chụp từ mô ruột của cá bằng máy ảnh kỹ thuật số gắn vào kính hiển vi trường sáng (Nikon E − 200, Tokyo, Nhật Bản) ở độ phóng đại × 400. Tác dụng của việc bổ sung MO trong khẩu phần ăn uống được đánh giá bằng quan sát kính hiển vi quang học (LM) về các chỉ số sau: (1) chiều cao nhung mao (μm, từ đỉnh đến gốc nhung mao), (2) chiều rộng nhung mao (μm, tại đỉnh và chỗ nối giữa tuyến/nhung mao), (3) độ sâu của tuyến, (4) tỷ lệ chiều cao nhung mao/độ sâu của tuyến, và (5) độ dày của lớp cơ. Các phép đo được thực hiện bằng hệ thống phân tích hình ảnh vi tính (phần mềm Image J; Bethesda, MD, USA) (Schneider et al., 2012). Chiều cao nhung mao, độ sâu của tuyến và chiều rộng nhung mao tại chỗ nối giữa tuyến/nhung mao và đỉnh nhung mao được đo (giá trị trung bình được tính cho 15 nhung mao/mẫu, x10).

2.10. Phản ứng miễn dịch và hoạt động chống oxy hóa

Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh được đánh giá bằng phương pháp đã được mô tả trước đây (Demers và Bayne, 1997). Nồng độ lysozyme trong huyết thanh (μg/mL) được xác định bằng cách so sánh kết quả với đường cong chuẩn được tạo ra từ lysozyme lòng trắng trứng gà đông khô (Abreu et al., 2009 , Demers và Bayne, 1997).

Nồng độ immunoglobulin (IgM) trong huyết thanh được định lượng bằng bộ kit xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) IgM đặc hiệu cho cá (CUSABIO và CusAb, Hoa Kỳ), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Nghiên cứu này sử dụng vi khuẩn Aeromonas hydrophila (1,2 × 10⁸ CFU), được lấy từ Khoa Bệnh và Quản lý Cá tại Đơn vị Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản Sakha, Phòng thí nghiệm Trung ương Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản, Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp, Ai Cập. Hoạt động thực bào được đánh giá theo phương pháp mô tả bởi (Kawahara et al., 1991). Tóm lại, 50 mg dịch nuôi cấy A. hydrophila được trộn với 1 mL máu và ủ ở 25°C trong 5 giờ với sự lắc nhẹ. Sau đó, các tiêu bản máu được chuẩn bị, nhuộm bằng dung dịch Giemsa và kiểm tra dưới kính hiển vi. Tỷ lệ phần trăm đại thực bào đã nuốt tế bào vi khuẩn được xác định bằng cách phân tích 300 tế bào được chọn ngẫu nhiên.

Các chỉ số stress oxy hóa trong huyết thanh, bao gồm superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx) , được đo bằng phương pháp quang phổ sử dụng các phương pháp đã được thiết lập (Mccord và Fridovich, 1969 ; Aebi, 1984) và (Paglia và Valentine, 1967), tương ứng). Nồng độ malondialdehyde (MDA) được đánh giá thông qua phương pháp axit thiobarbituric (Ohkawa et al., 1979).

2.11. Biểu hiện gen

Để đánh giá tác dụng điều hòa của tinh dầu Moringa oleifera đối với sự biểu hiện của một số gen gan và ruột, mô gan và ruột được thu thập trong nitơ lỏng và sau đó được giữ ở -80 °C cho đến khi phân tích. Các mẫu được chuẩn bị để chiết xuất tổng RNA theo (Abdo et al., 2024a) và sử dụng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tổng RNA được chiết xuất từ các mẫu ruột và gan của ba con cá trên mỗi bể thí nghiệm (gộp lại thành một mẫu sinh học trên mỗi bể, dẫn đến n = 3 mẫu sinh học trên mỗi nghiệm thức) bằng thuốc thử easy-RED (iNtRON Biotechnology) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chất lượng RNA được xác minh bằng điện di gel agarose nhuộm ethidium bromide. DNA bổ sung được tổng hợp bằng Bộ dụng cụ tổng hợp cDNA sợi đầu tiên của Thermo Scientific (TOPscript™ RT DryMIX). Phân tích biểu hiện gen được thực hiện trên hệ thống PCR thời gian thực PikoReal™ 24 (Thermo Scientific) sử dụng bộ kit SYBR Green 2 × Lo-Rox (Applied Biotechnology, Ai Cập) để đánh giá gen vận chuyển oligopeptide (PepT1), gen mucin (Muc), các gen liên quan đến tăng trưởng (GHR1, IGF-1), các gen liên quan đến chất chống oxy hóa (CAT, GPx) và các gen liên quan đến miễn dịch (lysozyme và thành phần bổ thể 3 (C3)). Điều kiện khuếch đại bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95°C trong 30 giây, tiếp theo là 40 chu kỳ ở 95°C trong 10 giây và 60°C trong 30 giây, trong phản ứng 20 μL chứa 10 μL SensiFAST™ SYBR Master Mix (Bioline, Anh), 2 μL cDNA, 0,5 μM mỗi primer (với nhiệt độ bắt cặp đặc hiệu gen được liệt kê trong Bảng 2) và nước không chứa nuclease. Tất cả các phản ứng được thực hiện lặp lại hai lần, với biểu hiện mRNA tương đối được tính toán bằng phương pháp 2^(-ΔΔCt) được chuẩn hóa so với gen nội chuẩn β-actin và ef-1α và giá trị nhóm đối chứng. Sự thay đổi gấp bội của mỗi biểu hiện tương đối được tính toán theo (Livak và Schmittgen, 2001).

*Số liệu được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn trung bình gộp (SEM). Các giá trị có chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể (P  < 0,05). Các giá trị có cùng chữ cái không có sự khác biệt đáng kể (P  > 0,05).

2.12. Thử nghiệm stress amoniac

Sau thử nghiệm cho ăn, mười con cá có kích thước tương đương từ mỗi bể cá được đưa vào thử nghiệm stress amoniac cấp tính. Một hệ thống phơi nhiễm tĩnh được chuẩn bị bằng cách thêm amoni clorua (NH₄Cl) vào bể chứa nước đã khử clo để đạt nồng độ cuối cùng là 5 mg/L nitơ amoni tổng cộng (0,18 mg/L NH₃–N không ion hóa), với điều chỉnh pH và nhiệt độ dựa trên các quy trình đã được thiết lập (Magouz et al., 2021). Cá được phơi nhiễm trong điều kiện tĩnh, và tỷ lệ chết được theo dõi sau mỗi 10 phút cho đến khi đạt tỷ lệ chết 50% (5 con cá mỗi bể). Thời gian gây chết 50% (LT₅₀) được ghi lại. Thời gian gây chết 50% (LT₅₀) được tính toán bằng phương pháp của (Moe et al., 2004). Mẫu máu cơ bản trước khi thử thách được thu thập từ năm con cá không bị căng thẳng mỗi bể. Sau khi phơi nhiễm, máu được lấy từ năm cá thể sống sót mỗi bể để đánh giá các dấu ấn sinh học của căng thẳng. Nhiệt độ nước được duy trì ở mức 28 ± 0,5°C và độ pH ở mức 7,6 ± 0,1 trong suốt quá trình thử nghiệm. Các mẫu huyết tương được phân tích hàm lượng glucose và cortisol bằng máy phân tích tự động EMEG Model 2000 Evolution (Spinreact Co., Tây Ban Nha) với que thử của Bayer Diagnostics, theo các quy trình tiêu chuẩn.

2.13. Phân tích dữ liệu

Dữ liệu thu được từ thí nghiệm cho ăn—bao gồm hiệu suất tăng trưởng, thành phần cơ thể, các thông số huyết học và sinh hóa, và các phép đo hình thái ruột—được phân tích bằng phương pháp ANOVA một chiều để đánh giá ảnh hưởng của các mức MEO khác nhau trong khẩu phần ăn đối với cá rô phi . Sự khác biệt trung bình được so sánh bằng phép thử hậu kiểm Duncan ở mức ý nghĩa 5% (P < 0,05). Ngoài ra, phân tích hồi quy đa thức được tiến hành để kiểm tra xu hướng tuyến tính và bậc hai trong ảnh hưởng của MEO đến các biến FCR và SGR đo được. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS (phiên bản 22).

…Còn tiếp…

Theo Amr I. Zaineldin, Safaa E. Abdo, Gehan IE Ali, Aly S. Saif, Mohammed Rashed, Walid S. Abdo, Ehab Elsebaey, Mahmoud AO dawood

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513426000682

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem tiếp:

• Phần 1: Đánh Giá Tác Động Của Việc Bổ Sung Lá Ổi (Psidium guajava) Lên Hiệu Suất Tăng Trưởng, Tình Trạng Chống Oxy Hóa Và Các Thông Số Huyết Học Của Cá Rô Phi (Oreochromis niloticus)
• Phần 2: Đánh Giá Tác Động Của Việc Bổ Sung Lá Ổi (Psidium guajava) Lên Hiệu Suất Tăng Trưởng, Tình Trạng Chống Oxy Hóa Và Các Thông Số Huyết Học Của Cá Rô Phi (Oreochromis niloticus)
• Ứng Dụng Siêu Âm Để Xác Định Giới Tính Và Đánh Giá Khả Năng Sinh Sản Ở Cá Rô Phi