Phần 1: Tác Dụng Của Bột Sâm Đại Hành Eleutherine bulbosa Đối Với Khả Năng Sinh Sản, Hiệu Suất Tăng Trưởng, Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột Và Khả Năng Kháng Bệnh Của Ấu Trùng Cá Rô Phi (Oreochromis niloticus) Chống Lại Nhiễm Trùng Aeromonas hydrophila

Chú thích: Aeromonas hydrophila^Rf  = là chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh Rifampicin

Tóm tắt

Cá rô phi (Oreochromis niloticus) là loài thủy sản có giá trị quan trọng trên toàn cầu. Tuy nhiên, tình trạng khan hiếm nguồn giống chất lượng cao vẫn là một trong những trở ngại chính đối với việc nâng cao sản lượng. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả và xác định mức bổ sung tối ưu của bột Eleutherine bulbosa đối với khả năng sinh sản của cá bố mẹ, hiệu suất tăng trưởng, thành phần hệ vi sinh vật đường ruột và sức đề kháng của ấu trùng trước các tác động bất lợi từ môi trường cũng như sự nhiễm Aeromonas hydrophila^Rf.

Bốn khẩu phần ăn được thử nghiệm trong 30 ngày, gồm: 6,25 g/kg thức ăn (TA), 12,5 g/kg thức ăn (TB), 25 g/kg thức ăn (TC) và khẩu phần đối chứng không bổ sung E. bulbosa (TD), với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Sau giai đoạn thử nghiệm, ấu trùng được tiếp xúc với các yếu tố gây stress từ môi trường và được thử thách bằng A. hydrophila ^Rf ở nồng độ LC₅₀ và 10⁷ CFU/mL.

Kết quả cho thấy các chỉ tiêu huyết học và sinh hóa khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức (P < 0,05). Trong đó, chỉ số bạch cầu (WBC) và hoạt tính enzyme ALT, AST cao hơn ở nhóm TC và TD. Về khả năng chống oxy hóa, hoạt tính superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GPx) tăng, trong khi hàm lượng malondialdehyde (MDA) giảm ở các nhóm TA và TB. Các chỉ tiêu sinh sản cũng được cải thiện khi bổ sung E. bulbosa: nồng độ estradiol-17β, vitellogenin, chỉ số thành thục sinh dục (GSI), sức sinh sản và các đặc điểm mô học đều cao hơn có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) ở nhóm TA và TB so với nhóm đối chứng.

Bên cạnh đó, việc bổ sung E. bulbosa làm thay đổi thành phần hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng tăng độ đa dạng OTU và số lượng các chi vi sinh vật có lợi. Các chỉ tiêu tăng trưởng, bao gồm tỷ lệ tăng trọng (WGR), tăng trọng trung bình ngày (ADG) và hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR), được cải thiện đáng kể (P < 0,05) ở nhóm TA và TB. Ngược lại, nhóm TC cho thấy hiệu suất thấp hơn so với các nghiệm thức bổ sung ở mức thấp hơn. Đáng chú ý, ấu trùng sinh ra từ đàn cá bố mẹ được bổ sung E. bulbosa có tỷ lệ sống cao hơn và số lượng A. hydrophila ^Rf thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05).

Nhìn chung, kết quả nghiên cứu xác định mức bổ sung E. bulbosa tối ưu trong khoảng 10,2–13,8 g/kg thức ăn, góp phần cải thiện hiệu suất sinh sản của cá bố mẹ và sức khỏe của ấu trùng. Tuy nhiên, cần tiến hành thêm các nghiên cứu dài hạn để xác nhận những phát hiện này trong suốt một chu kỳ sinh sản hoàn chỉnh.

1. Giới thiệu

Nuôi trồng thủy sản là hoạt động nuôi dưỡng các sinh vật thủy sinh trong môi trường được kiểm soát nhằm cung cấp nguồn protein động vật với giá thành hợp lý, góp phần bảo đảm an ninh lương thực và thúc đẩy ổn định kinh tế tại các cộng đồng địa phương (Ashry và cộng sự, 2024; Lim và cộng sự, 2025; Van Doan và cộng sự, 2023). Trong số các loài thủy sản nuôi chủ lực, cá rô phi (Oreochromis niloticus) giữ vai trò quan trọng nhờ tiềm năng đáp ứng nhu cầu protein động vật ngày càng tăng trên toàn cầu (Abdel-Aziz và cộng sự, 2023; Sutthi và cộng sự, 2025). Tuy nhiên, sự phát triển của ngành nuôi trồng thủy sản vẫn phải đối mặt với nhiều thách thức, trong đó có tình trạng thiếu hụt nguồn giống chất lượng cao (Abdel-Tawwab và cộng sự, 2022; Jobling, 2011). Chất lượng cá giống chịu ảnh hưởng đáng kể bởi nhiều yếu tố, đặc biệt là khả năng sinh sản và tình trạng dinh dưỡng của cá bố mẹ. Thành phần nguyên liệu thức ăn quyết định chất lượng khẩu phần, từ đó tác động đến tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của cá nuôi. Trong quá trình sinh sản ở cá, dinh dưỡng là một trong những yếu tố ngoại sinh quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển của trứng. Khẩu phần ăn cung cấp các dưỡng chất cần thiết cho quá trình tổng hợp vitellogenin, qua đó tác động đến chất lượng cá bố mẹ, sự phát triển của trứng và khả năng tạo ra đàn ấu trùng chất lượng cao (Abdel-Tawwab và cộng sự, 2022; Mainassy và cộng sự, 2022). Bên cạnh đó, chất lượng cá giống được thả nuôi cũng là yếu tố quyết định đến hiệu quả sản xuất cá rô phi nói chung (Abdel-Tawwab và cộng sự, 2022). Một trong những bệnh phổ biến và gây thiệt hại đáng kể trong nuôi cá rô phi là bệnh nhiễm trùng huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila (MAS). Tác nhân này có thể gây nhiễm bệnh ở cá trong nhiều giai đoạn phát triển, từ cá bột đến cá trưởng thành. Nhiễm A. hydrophila có thể dẫn đến tỷ lệ chết từ 80–100% trong vòng 1–2 tuần, tạo ra mối đe dọa nghiêm trọng đối với tỷ lệ sống của cá giống và hiệu quả sản xuất trong nuôi trồng thủy sản (Casabianca và cộng sự, 2015; Semwal và cộng sự, 2023).

Thảo dược ngày càng được quan tâm trong nuôi trồng thủy sản nhờ tiềm năng cải thiện sức khỏe vật nuôi thông qua các cơ chế tự nhiên (Hussein và cộng sự, 2023; Van Doan và cộng sự, 2020; Wang và cộng sự, 2024). So với các chất phụ gia hóa học, nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sở hữu nhiều ưu điểm như nguồn cung dồi dào, chi phí thấp, ít tác dụng phụ và giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường (Tadese và cộng sự, 2022). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc bổ sung thảo dược vào thức ăn thủy sản có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng, đặc điểm mô học, trạng thái oxy hóa – khử, các chỉ tiêu sinh hóa, đáp ứng miễn dịch, quá trình chuyển hóa, biểu hiện gen liên quan đến hệ thống chống oxy hóa, khả năng tiêu hóa và sức đề kháng đối với các vi khuẩn gây bệnh so với khẩu phần không bổ sung nguyên liệu thực vật (Abdel-Tawwab và cộng sự, 2022; Eissa và cộng sự, 2024; El Basuini và cộng sự, 2024; El-Dakar và cộng sự, 2023; Van Doan và cộng sự, 2020). Bên cạnh đó, các hợp chất hoạt tính sinh học trong thảo dược còn có khả năng điều hòa thành phần và mức độ đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột ở cá (Zhang và cộng sự, 2022). Hệ vi sinh vật đường tiêu hóa (GI) giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình sử dụng chất dinh dưỡng, tăng trưởng và chức năng miễn dịch ở cá (Wang và cộng sự, 2018). Độ đa dạng và số lượng vi sinh vật là những chỉ số quan trọng phản ánh tình trạng sức khỏe đường ruột. Một cộng đồng vi sinh vật đa dạng có thể góp phần tăng cường khả năng kháng bệnh thông qua cơ chế cạnh tranh và đối kháng với các vi sinh vật gây hại (Stecher và Maier; Wang và cộng sự, 2018). Ngoài tác dụng cải thiện sức khỏe và chức năng đường ruột, việc bổ sung thảo dược vào khẩu phần ăn còn được chứng minh có khả năng nâng cao hiệu suất sinh sản ở cá (Guo và cộng sự, 2022). Tác dụng này có thể liên quan đến việc cải thiện sức khỏe cá bố mẹ và thúc đẩy quá trình tổng hợp vitellogenin. Sau đó, vitellogenin được vận chuyển vào trứng, cung cấp nguồn dưỡng chất cần thiết cho sự phát triển của phôi và ấu trùng, qua đó góp phần tạo ra nguồn cá giống chất lượng cao (Dhas và cộng sự, 2015; Mainassy và cộng sự, 2022). Đồng thời, việc duy trì tính toàn vẹn của tế bào gan trong giai đoạn sinh sản cũng góp phần cải thiện kết quả sinh sản của đàn cá bố mẹ (Eissa và cộng sự, 2024; Mainassy và cộng sự, 2022). Bên cạnh đó, miễn dịch truyền từ cá mẹ có thể hỗ trợ sự phát triển của cả miễn dịch đặc hiệu và miễn dịch không đặc hiệu ở cá con, góp phần bảo vệ thế hệ sau trước nguy cơ nhiễm Aeromonas hydrophila (Sukenda và cộng sự, 2017).

Eleutherine bulbosa là một loài cây thuốc phổ biến tại Indonesia, đã được nghiên cứu về tiềm năng ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt đối với các loài cá và tôm (Munaeni và cộng sự, 2020a, 2020d). Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh E. bulbosa có đặc tính kháng khuẩn, prebiotic và chống oxy hóa. Các thành phần prebiotic trong loài thực vật này, bao gồm inulin, fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS) và raffinose, đã được chứng minh có khả năng kích thích sự phát triển của các chủng vi khuẩn có lợi như Pseudoalteromonas piscicida 1Ub và Bacillus sp. NP5 (Munaeni và cộng sự, 2020b). Việc bổ sung bột E. bulbosa còn được ghi nhận có khả năng tăng cường hoạt tính enzyme tiêu hóa, mở rộng diện tích bề mặt nhung mao ruột, cải thiện khả năng tiêu hóa và hấp thu chất dinh dưỡng, thúc đẩy tăng trưởng, tăng cường đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng kháng bệnh của tôm thẻ chân trắng khi nhiễm Vibrio parahaemolyticus. Đáng chú ý, bột simplicia từ E. bulbosa cho thấy hiệu quả cao hơn so với chiết xuất từ loài thực vật này (Munaeni và cộng sự, 2020a, 2020d). Cho đến nay, chưa có nghiên cứu được công bố về việc sử dụng bột E. bulbosa trong khẩu phần ăn của cá rô phi bố mẹ. Theo Apines-Amar và Amar (2015) và Awad (2025), hiệu quả của các chất phụ gia thức ăn trong nuôi trồng thủy sản có thể thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc chất kích thích miễn dịch, liều lượng, phương thức sử dụng, thời gian bổ sung và loài thủy sản được nuôi. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung bột E. bulbosa đến độ đa dạng của hệ vi sinh vật đường ruột, hiệu suất tăng trưởng, khả năng chống oxy hóa, hiệu suất sinh sản của cá rô phi bố mẹ và sức đề kháng của ấu trùng.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Chuẩn bị bột Eleutherine bulbosa và các khẩu phần ăn thử nghiệm

Việc chuẩn bị bột E. bulbosa được tiến hành theo các phương pháp đã được mô tả trước đây (Munaeni và cộng sự, 2019 , 2020b). Củ E. bulbosa được làm sạch, thái lát mỏng và sấy khô trong lò ở 60 °C trong 48 giờ. Sau đó, nguyên liệu khô được nghiền và sàng để thu được bột mịn, được bảo quản ở -20 °C cho đến khi sử dụng. Thí nghiệm được bố trí theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên với bốn khẩu phần ăn có chứa các liều lượng bột E. bulbosa khác nhau , mỗi chế độ có ba lần lặp lại. Các khẩu phần ăn bao gồm 6,25 g/kg thức ăn (TA), 12,5 g/kg thức ăn (TB), 25 g/kg thức ăn (TC) và khẩu phần ăn đối chứng không bổ sung E. bulbosa (TD). Các khẩu phần ăn thử nghiệm được chuẩn bị bằng phương pháp phủ như đã mô tả trong các nghiên cứu trước đây (13). Bột E. bulbosa được trộn với 3% Carboxymethyl Cellulose (CMC) làm chất kết dính và hòa tan trong 10% nước cất, sau đó phun lên thức ăn thương mại chứa 30% protein thô. Thức ăn được phủ lớp này được sấy khô trong lò ở 50 °C trong 1 giờ, đóng gói trong hộp nhựa vô trùng và bảo quản ở 4 °C cho đến khi sử dụng. Thành phần dinh dưỡng gần đúng của các khẩu phần ăn thử nghiệm được phân tích theo phương pháp AOAC (AOAC , 1995), tại Phòng thí nghiệm Dinh dưỡng Cá, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Đại học IPB (Bảng 1).

^aThức ăn công nghiệp chứa 30% protein thô.

^bNFE (vật liệu chiết xuất không chứa nitơ).

^cGE (Tổng năng lượng); Bột E. bulbosa được sử dụng với liều lượng 6,25 g/kg (TA), 12,5 g/kg (TB), 25 g/kg (TC); nhóm đối chứng (TD).

2.2. Thiết kế thí nghiệm

Cá rô phi  bố mẹ khỏe mạnh được lấy từ Trại nuôi trồng thủy sản Kamiya Jaya (Thành phố Ternate, Bắc Maluku, Indonesia), với trọng lượng ban đầu trung bình là 288,58 ± 38,86 g/con. Cá bố mẹ được nuôi trong ao bê tông hình tròn (đường kính 4 m; sức chứa 12 tấn) với độ sâu nước 80 cm và sục khí liên tục. Cá được thích nghi trong hai tuần trước khi tiến hành thử nghiệm cho ăn và được cho ăn thức ăn thương mại chứa 30% protein thô trong suốt thời gian này. Sau khi thích nghi, cá bố mẹ được thả vào 12 lồng đáy (hapa) có gắn vật nặng và đặt bên trong ao hình tròn. Mỗi lồng có kích thước 1,5 × 0,5 × 0,5 m³ ^và được thả 5 con cá bố mẹ với tỷ lệ giới tính 2 con đực/3 con cái. Cho phép sinh sản tự nhiên để thu được ấu trùng. Cá bố mẹ dùng để sinh sản được nuôi riêng biệt với cá bố mẹ dùng cho các thông số thí nghiệm khác; Như vậy, tổng cộng 120 cá bố mẹ đã được sử dụng trong nghiên cứu này, bao gồm 48 cá đực và 72 cá cái. Khẩu phần ăn được áp dụng trong 30 ngày với tỷ lệ cho ăn 5% trọng lượng cơ thể mỗi ngày, chia thành hai lần cho ăn vào lúc 8:00 và 16:00. Các thông số chất lượng nước được theo dõi trong suốt thí nghiệm, với các phạm vi được ghi nhận như sau: nhiệt độ 27,5–30,1 °C, pH 7,6–7,8, oxy hòa tan 5,2–5,8 mg/L, amoniac 0,08–0,17 mg/L và nitrit 0,07–0,11 mg/L. Tất cả các quy trình thí nghiệm đều được Ủy ban Đạo đức Động vật của Khoa Y và Khoa học Sức khỏe, Đại học Khairun phê duyệt (Số phê duyệt 048/UN44/C.9/KEP/2025).

2.3. Quy trình phân tích

2.3.1. Estradiol và hormone vitellogenin

Mẫu huyết tương từ cá rô phi bố mẹ được gửi đến Phòng thí nghiệm Sinh lý học, Khoa Thú y, Đại học Syiah Kuala, Indonesia để phân tích hormone. Nồng độ hormone được đo bằng phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Nồng độ vitellogenin được phân tích bằng bộ kit ELISA vitellogenin cá (Mã số BZ-08060200-EB), trong khi nồng độ estradiol được xác định bằng bộ kit ELISA estradiol (Mã số EIA-2693, DRG International Inc., Hoa Kỳ). Độ hấp thụ được đo bằng máy đọc ELISA (máy đọc vi phiến đa chế độ, Bio-Rad) ở bước sóng 450 nm, và nồng độ được tính toán bằng phần mềm MPM 6. Tất cả các quy trình khác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.3.2. Hàm lượng chất chống oxy hóa, chỉ số sinh dục (GSI), khả năng sinh sản và phân tích mô học

Quá trình giải phẫu và thu thập mẫu mô gan, tuyến sinh dục của cá rô phi bố mẹ được tiến hành trên đá lạnh. Chỉ số gan-thể trọng (HSI) được xác định bằng tỷ lệ giữa khối lượng gan và khối lượng cơ thể (Ashry và cộng sự, 2024), trong khi chỉ số tuyến sinh dục (GSI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tuyến sinh dục và khối lượng cơ thể. Khả năng sinh sản tương đối được đánh giá theo phương pháp của Mainassy và cộng sự (2025), thông qua việc đếm số trứng được ấp trong khoang miệng của cá bố mẹ cái, quy đổi trên 100 g khối lượng cơ thể cho mỗi nghiệm thức. Chỉ tiêu này được tính theo công thức:

Khả năng sinh sản tương đối = (Số lượng trứng/Khối lượng cơ thể cá bố mẹ) × 100.

Các mẫu gan được rửa bằng dung dịch đệm phosphat (PBS), có thành phần gồm 8 g NaCl, 1,5 g Na₂HPO₄, 0,2 g KCl và 0,2 g KH₂PO₄ trong 1.000 mL nước cất. Sau đó, mẫu được đồng nhất hóa và ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 5 phút. Phần dịch nổi được thu thập và bảo quản ở −20 °C để phân tích các chỉ tiêu chống oxy hóa, bao gồm superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) và glutathione peroxidase (GPx).Hoạt tính SOD của gan được đo bằng bộ kit xét nghiệm Elabscience (E-BC-K020-M, phương pháp WST-1) và đọc ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc độ hấp thụ vi phiến (Bio-Rad). Phần trăm ức chế được tính như sau:Phần trăm ức chế (%) = 100 − [(ΔOD_control − ΔOD_sample / ΔOD_control) × 100]

Hoạt tính SOD (U/mL) được tính như sau:Hoạt tính SOD (U/mL) = phần trăm ức chế × 3,75

Nồng độ malondialdehyde (MDA) được xác định bằng cách sử dụng axit thiobarbituric (TBA) theo phương pháp đã được sửa đổi của (Garcia và cộng sự, 2005). Tóm lại, 0,5 mL dịch nổi gan hoặc dung dịch chuẩn được trộn với 2 mL axit clohydric (HCl) lạnh 0,25 N chứa 0,38% axit thiobarbituric (TBA), 15% axit trichloroacetic (TCA) và 0,5% butylated hydroxytoluene (BHT), sau đó ủ ở 80 °C trong 1 giờ. Sau khi làm nguội, các mẫu được ly tâm ở 3500 vòng/phút trong 10 phút, và độ hấp thụ được đo ở bước sóng 532 nm. 1,1,3,3-tetraethoxypropane (TEP) được sử dụng làm chất chuẩn.

Hoạt tính glutathione peroxidase (GPx) được xác định theo phương pháp cải tiến từ Lawrence và Burk (1976). Dịch nổi gan (200 μL) được phối trộn với 200 μL dung dịch đệm phosphat 0,1 M (pH 7,0) chứa glutathione khử (GSH, 10 mM), EDTA (0,1 mM) và glutathione reductase (2,4 U). Hỗn hợp được ủ ở 37 °C trong 10 phút. Tiếp theo, bổ sung 200 μL NADPH (1,5 mM) và tiếp tục ủ trong 3 phút, sau đó thêm 200 μL hydro peroxide (H₂O₂, 1,5 mM). Hoạt tính GPx được xác định thông qua sự suy giảm độ hấp thụ của NADPH tại bước sóng 340 nm, được theo dõi bằng máy quang phổ UV-Vis trong khoảng thời gian 1–2 phút.

Các tiêu bản mô học của gan và tuyến sinh dục được chuẩn bị bằng phương pháp đúc paraffin và nhuộm hematoxylin–eosin (H&E) theo quy trình của Munaeni và cộng sự (2020a). Mẫu mô gan và tuyến sinh dục được cắt thành các phần có kích thước 1 × 1 cm, độ dày 3–5 mm, sau đó cố định trong dung dịch Davidson từ 24–72 giờ. Tiếp theo, các mẫu được xử lý qua các công đoạn khử nước, làm trong, đúc paraffin, cắt lát và nhuộm màu. Cuối cùng, các tiêu bản mô học được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10×.

Phân tích định lượng mô học gan được thực hiện bằng phần mềm ImageJ theo phương pháp điều chỉnh từ Westerkamp và cộng sự (2015). Trước khi tiến hành phân tích, phần mềm được hiệu chuẩn và các vùng quan sát được xác định bằng cách thiết lập vùng quan tâm (region of interest, ROI). Năm trường quan sát có diện tích đồng nhất được lựa chọn ngẫu nhiên để phân tích. ROI kích thước 25 × 25 μm được sử dụng để định lượng tế bào gan (hp), trong khi ROI lớn hơn, kích thước 100 × 100 μm, được sử dụng để đánh giá tĩnh mạch trung tâm và không bào. Mật độ tế bào gan được xác định bằng số lượng tế bào trên mỗi đơn vị diện tích ROI (tế bào/μm²). Đường kính tĩnh mạch trung tâm (cv) được đo bằng micromet (μm), còn mức độ hình thành không bào (v) được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm, tính theo công thức:

Tỷ lệ không bào (%) = (Tổng diện tích không bào/Tổng diện tích mô) × 100.

Phương pháp định lượng mô học tuyến sinh dục được điều chỉnh từ Brown-Peterson và cộng sự (2011), cùng Nurhidayat và cộng sự (2017). Phân tích được thực hiện bằng phần mềm ImageJ nhằm phân đoạn và đánh giá kỹ thuật số các vùng mô buồng trứng. Hình ảnh mô học được kiểm tra, sau đó chia thành năm trường quan sát có kích thước đồng nhất và được lựa chọn ngẫu nhiên. Tại mỗi trường quan sát, các loại tế bào mầm được xác định và định lượng, bao gồm noãn bào đang tích lũy noãn hoàng (vt), nang trứng đang phát triển (f) và noãn bào trưởng thành (r). Việc phân loại tế bào dựa trên các đặc điểm hình thái đã được xác lập. Tỷ lệ của từng loại tế bào được tính theo phần trăm trên tổng số tế bào mầm quan sát được, theo công thức:

Tỷ lệ loại tế bào (%) = (Số lượng tế bào thuộc loại cụ thể/Tổng số tế bào mầm) × 100.

Các tỷ lệ này tiếp tục được quy đổi thành điểm bán định lượng nhằm mô tả mức độ phong phú tương đối của từng loại tế bào theo thang điểm: 0 = không xuất hiện; 1 = rất thấp (80%).

2.3.3. Huyết học và sinh hóa máu của cá rô phi bố mẹ

Ba cá thể cá ở mỗi nghiệm thức được lựa chọn ngẫu nhiên để lấy mẫu máu. Trước khi lấy máu, cá được gây mê bằng dầu đinh hương ở nồng độ 0,2 mL/L. Máu được thu từ tĩnh mạch đuôi bằng ống tiêm 1 mL có chứa dung dịch chống đông gồm trisodium citrate (30 mM), sodium chloride (338 mM), glucose (115 mM) và ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 10 mM), ở pH 7,0, nhằm thu nhận huyết tương. Đồng thời, mẫu máu không chứa chất chống đông được thu thập để tách huyết thanh.

Quy trình chuẩn bị huyết thanh được thực hiện theo phương pháp của Sutthi và cộng sự (2025). Các mẫu máu được bảo quản ở 4 °C trong 8 giờ, sau đó ly tâm ở tốc độ 5.000 × g trong 10 phút. Huyết thanh thu được được bảo quản ở −20 °C cho đến khi tiến hành các phân tích tiếp theo.

Các chỉ tiêu huyết học được xác định bao gồm tổng số hồng cầu, tổng số bạch cầu, nồng độ hemoglobin và công thức bạch cầu. Số lượng hồng cầu và bạch cầu được xác định bằng buồng đếm Neubauer theo phương pháp của Blaxhall và Daisley (1973), trong khi nồng độ hemoglobin được đo bằng phương pháp Sahli.

Các chỉ tiêu sinh hóa máu được phân tích bằng phương pháp đo màu enzym, sử dụng các bộ thuốc thử thương mại Glory® Diagnostic (Tây Ban Nha), bao gồm protein tổng số (GD-TP100), triglyceride (GD-TG100), glucose (GD-GL100) và cholesterol HDL (GD-HDLP80). Hoạt độ alanine aminotransferase (ALT; GPT-11100) và aspartate aminotransferase (AST; GOT-11100) được xác định bằng các bộ thuốc thử chẩn đoán ReiGed® (Ý), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.3.4. Hiệu suất tăng trưởng của đàn cá rô phi bố mẹ

Sau 30 ngày thử nghiệm cho ăn, cá được nhịn ăn 24 giờ trước khi lấy mẫu, và trọng lượng cơ thể được ghi lại để đánh giá hiệu suất tăng trưởng. Trọng lượng cơ thể ban đầu (W0 _, IBW), trọng lượng cơ thể cuối cùng (W30 _, FBW) và lượng thức ăn tiêu thụ (FI) trong suốt thời gian thí nghiệm (T = 30 ngày) đã được đo (Hussein và cộng sự, 2023). Các thông số hiệu suất tăng trưởng được tính toán như sau:

• Tăng trọng trung bình hàng ngày (ADG, g) = WG/30;
• Tăng cân (WG, g) = W ₃₀  − W ₀ ;
• Tốc độ tăng cân (WGR, %) = [(W ₃₀  − W ₀)/W ₀ ] × 100;
• Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) = FI/WG;
• Tỷ lệ sống (SR, %) = (số cá vào ngày thứ 30/số cá vào ngày thứ 0) × 100.

2.3.5. Sự đa dạng hệ vi sinh vật đường ruột của cá rô phi bố mẹ

Mẫu ruột được lấy ngẫu nhiên từ chín cá rô phi  bố mẹ cho mỗi nghiệm thức. Việc mổ xẻ và lấy mẫu ruột được thực hiện trên đá để giảm thiểu sự phân hủy DNA. Các mẫu ruột được bảo quản ngay lập tức trong dung dịch DNA/RNA Shield (50 mL; Zymo Research, R1100-50) cho đến khi ngập hoàn toàn. Phân tích hệ vi sinh vật được tiến hành tại PT. Genetika Science Indonesia, Tangerang, Banten, Indonesia. DNA bộ gen được chiết xuất bằng bộ kit ZymoBIOMICS DNA Miniprep (Zymo Research, D4300). Nồng độ và độ tinh khiết của DNA ban đầu được đánh giá bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Khuếch đại PCR được thực hiện bằng cách sử dụng polymerase DNA KOD Multi & Epi (Toyobo, KME-101). Sản phẩm PCR được hiển thị bằng điện di trên gel agarose, sau đó định lượng DNA chính xác bằng bộ kit Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Scientific). Quá trình khuếch đại nhắm mục tiêu vào các vùng siêu biến đổi V3–V4 của gen rRNA 16S của vi khuẩn bằng cách sử dụng các mồi phổ quát 341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′) và 806R (5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′). Việc chuẩn bị thư viện được thực hiện bằng cách sử dụng giao thức Chuẩn bị Thư viện Giải trình tự Hệ gen 16S cho nền tảng Illumina MiSeq. Các thư viện cuối cùng được giải trình tự trên nền tảng Illumina để tạo ra các trình tự đọc thô ghép cặp. Trình tự adapter và mồi được loại bỏ khỏi các trình tự đọc thô bằng cách sử dụng Cutadapt (Bellemain và cộng sự, 2010). Quy trình DADA2 được sử dụng để sửa lỗi giải trình tự, loại bỏ các trình tự đọc chất lượng thấp và loại bỏ các trình tự lai (Martin, 2011). Các biến thể trình tự khuếch đại (ASV) được phân loại theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở dữ liệu SILVA (silva_nr99_v138.2). Phân tích tiếp theo và trực quan hóa dữ liệu được thực hiện bằng RStudio (phiên bản R 4.2.3; https://www.R-project.org/), Krona Tools (https://github.com/marbl/Krona) và PICRUSt2 (https://github.com/picrust/picrust2). Dự đoán chức năng của cộng đồng vi sinh vật được tiến hành bằng PICRUSt2, và các hồ sơ chức năng dự đoán được chú thích vào cơ sở dữ liệu KEGG được trực quan hóa bằng ggpicrust2, hiển thị 30 con đường chức năng hàng đầu.

2.3.6. Sức đề kháng của ấu trùng đối với các tác động từ môi trường và nhiễm trùng Aeromonas hydrophila.

Các thử nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh của ấu trùng bao gồm khả năng chịu đựng stress môi trường và khả năng kháng nhiễm Aeromonas hydrophila. Đối với thử nghiệm stress môi trường, ấu trùng được nuôi trong các bể không sục khí liên tục trong bảy ngày. Đối với thử nghiệm nhiễm khuẩn, ấu trùng được duy trì trong cùng điều kiện môi trường và tiếp xúc với vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp của Espirito Santo và cộng sự (2020), cùng Ma’ruf và Ernawati (2025).

Thí nghiệm gồm bốn nghiệm thức, bao gồm một nghiệm thức đối chứng, với ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Riêng thử nghiệm nhiễm khuẩn có bổ sung một nghiệm thức đối chứng âm tính không tiếp xúc với A. hydrophila. Ấu trùng 5 ngày tuổi được sinh ra từ cá rô phi bố mẹ có chế độ ăn bổ sung các mức bột E. bulbosa khác nhau, được phân bổ ngẫu nhiên vào các bể thí nghiệm. Mỗi bể có thể tích 1 L và chứa 10 ấu trùng, tương ứng với tổng số 30 ấu trùng cho mỗi nghiệm thức.

Thử nghiệm nhiễm khuẩn được tiến hành bằng phương pháp ngâm ấu trùng 5 dph trong môi trường nuôi cấy chứa vi khuẩn gây bệnh. Chủng A. hydrophila sử dụng trong thí nghiệm được đánh dấu bằng rifampicin ở nồng độ 50 μg/mL và ký hiệu là A. hydrophila Rf. Nồng độ vi khuẩn gây nhiễm được xác định dựa trên thử nghiệm xác định nồng độ gây chết trung vị (LC₅₀), với mức gây nhiễm được thiết lập ở 10⁷ CFU/mL. Tỷ lệ sống của ấu trùng được theo dõi hằng ngày trong bảy ngày sau khi gây nhiễm.

Trong suốt thời gian thí nghiệm, các thông số chất lượng nước được duy trì trong các khoảng sau: nhiệt độ 24,0–29,2 °C; pH 7,5–7,6; oxy hòa tan (DO) 4,5–5,2 mg/L; amoniac 0,00–0,02 mg/L; và nitrit (NO₂⁻) 0,00–0,05 mg/L.

Tổng số A. hydrophila Rf được xác định vào ngày thứ ba sau khi gây nhiễm. Ba ấu trùng từ mỗi nghiệm thức được nghiền đồng nhất trong 0,9 mL dung dịch đệm phosphat (PBS), sau đó dịch nghiền được trải đều trên môi trường thạch Tryptone Soy Agar (TSA) có bổ sung rifampicin và ủ ở 37 °C. Sau 24 giờ ủ, số lượng khuẩn lạc được đếm để xác định mật độ vi khuẩn. Mỗi nghiệm thức được phân tích với ba lần lặp lại.

2.4. Phân tích dữ liệu

Tất cả dữ liệu đều được kiểm tra tính chuẩn hóa và tính đồng nhất phương sai trước khi phân tích và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) được thực hiện, tiếp theo là kiểm định khoảng đa biến Duncan để xác định sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức. Mức ý nghĩa thống kê được đặt ở P  < 0,05. Dữ liệu mô học được phân tích mô tả, bán định lượng và định lượng. Phân tích hồi quy đa thức bậc hai được áp dụng để xác định liều lượng bột E. bulbosa tối ưu cho tốc độ tăng trọng (WGR), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) và tỷ lệ sống (SR), với mô hình phù hợp nhất được chọn dựa trên hệ số xác định (R²).

…Còn tiếp…

Theo Waode Munaeni, Nursanti Abdullah, Muhammad Gustilatov

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468550X26000936

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Phần 1: Cao Lương Có Thể Thay Thế Hoàn Toàn Ngô Trong Khẩu Phần Ăn Của Cá Rô Phi
• Phần 2: Cao Lương Có Thể Thay Thế Hoàn Toàn Ngô Trong Khẩu Phần Ăn Của Cá Rô Phi
• Ứng Dụng Siêu Âm Để Xác Định Giới Tính Và Đánh Giá Khả Năng Sinh Sản Ở Cá Rô Phi