Tóm tắt

Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) được coi là mầm bệnh vừa xuất hiện đang tấn công ngành công nghiệp tôm trên toàn thế giới. Nó là một loại ký sinh trùng nội bào có liên quan đến hội chứng chậm phát triển và hội chứng phân trắng ở tôm. Mặc dù tác động của EHP đối với ngành công nghiệp tôm đã được biết rõ, nhưng nhiều khía cạnh của sự tương tác giữa vật chủ và mầm bệnh vẫn còn hạn chế. Một hạn chế lớn trong nghiên cứu EHP là thiếu phương pháp đáng tin cậy để sản xuất một lượng lớn chất gây cảm nhiễm nhanh và có thể tái sử dụng. Nghiên cứu này được thực hiện để so sánh các phép thử khác nhau bao gồm tiêm cơ, cho ăn, sống chung, tiêm vào gan tụy (HP) và tiêm ngược vào ống tiêu hóa.

Kết quả cho thấy tiêm gan tụy và tiêm ngược vào ống tiêu hóa là hai phương pháp hứa hẹn để lây nhiễm bệnh cho tôm nhanh chóng và tạo ra chất nhiễm truyền theo cách có thể tái sản xuất bắt đầu với một lượng chất cấy nhất định. Do đó, việc tiêm gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa đã được chọn cho một nghiên cứu mở rộng. Kết quả mô bệnh học cho thấy EHP sinh sôi nảy nở trong các tế bào biểu mô của gan tụy ở tôm thử nghiệm thông qua việc tiêm trực tiếp chất cấy vào gan tụy và xử lý ngược lại. Phù hợp với kết quả mô bệnh học, dữ liệu real-time PCR cho thấy lượng EHP trong tôm thử nghiệm tăng lên đáng kể với phương pháp tiêm gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa. Hơn nữa, kết quả mô bệnh học và định lượng cation chỉ ra rằng tiêm gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa là hai phương pháp mới có thể được sử dụng trong các nghiên cứu tác động EHP và nhanh chóng tạo ra chất cấy truyền EHP đặc hiệu.

1/ Giới thiệu

Kể từ năm 2001, hội chứng tăng trưởng chậm (SGS) hoặc hội chứng chậm phát triển đã trở thành vấn đề trong việc nuôi tôm sú ở Thái Lan (Chayaburakul và cộng sự, 2004). Nhiều tác nhân gây bệnh có liên quan đến hội chứng tăng trưởng chậm (Chayaburakul và cộng sự, 2004). Mặc dù hội chứng tăng trưởng chậm không gây chết tôm trong ao nuôi thương phẩm, nhưng tác động của hội chứng này ở mức độ toàn cầu là rất đáng kể. Người ta ước tính rằng ngành công nghiệp tôm ở Thái Lan đã mất 300 triệu đô la Mỹ do hội chứng tăng trưởng chậm vào năm 2002 (Chayaburakul và cộng sự, 2004). Năm 2009, mầm bệnh vi bào tử Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) được tìm thấy trên tôm sú P. monodon có dấu hiệu của hội chứng tăng trưởng chậm trong các ao nuôi ở Thái Lan (Tourtip và cộng sự, 2009). Kể từ đó, EHP đã được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Malaysia và Venezuela (Rajendran và cộng sự, 2016; Tang và cộng sự, 2017; Tang và cộng sự, 2016).

Các loài Decapod bị nhiễm bởi hơn 20 loài microsporidian, trong đó hai loài EHP và Agmasoma penaei là những loài phổ biến được báo cáo là gây thiệt hại kinh tế cho tôm (Sokolova và cộng sự, 2015; Thitamadee và cộng sự, 2016). EHP là một loại ký sinh trùng nội bào có bốn giai đoạn sống nội bào trong các tế bào bị nhiễm bệnh (Tourtip và cộng sự, 2009). Bào tử trưởng thành có hình bầu dục với vách dày đặc có nhân, đĩa gắn, một không bào phía sau và 5-6 sợi cực đóng vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm của bào tử (Aldama-Cano và cộng sự, 2018; Tourtip và cộng sự, 2009). Agmasoma penaei, tác nhân gây bệnh “tôm sữa/ tôm bông gòn” ở tôm, sử dụng cá làm vật chủ trung gian trong vòng đời của chúng (Flegel và cộng sự, 1992). Có ý kiến cho rằng có thể kiểm soát A. penaei bằng cách loại bỏ cá khỏi ao nuôi tôm. Tuy nhiên, không giống như A. penaei, EHP không cần vật chủ trung gian và có thể hoàn thành toàn bộ vòng đời của mình trong đường tiêu hóa của tôm. EHP được truyền trực tiếp từ tôm sang tôm qua đường thức ăn và gây nhiễm thông qua phân, ăn thịt đồng loại hoặc do tiếp xúc với nước bị ô nhiễm (Salachan và cộng sự, 2017; Tangprasittipap và cộng sự, 2013). Những đặc điểm này làm cho việc kiểm soát mầm bệnh gặp khó khăn khi ao đã nhiễm bệnh.

Mặc dù EHP không gây ra tỷ lệ chết đáng kể ở tôm, nhưng nó ảnh hưởng đến sản lượng tôm do gây chậm phát triển và do có thể có liên quan đến hội chứng phân trắng (Ha và cộng sự, 2010; Rajendran và cộng sự, 2016). Ngoài ra, EHP làm tăng tính nhạy cảm của tôm với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) (Aranguren và cộng sự, 2017). Vì vậy, nghiên cứu cơ chế lây truyền EHP trở nên cần thiết để hiểu khả năng gây bệnh và xác định sức đề kháng hoặc khả năng chống chịu của một số dòng tôm. Tuy nhiên, một hạn chế lớn trong nghiên cứu về EHP là số lượng lớn chất nhiễm truyền có sẵn để thực hiện thử nghiệm bị hạn chế. Một phương pháp thử nghiệm là cho đàn tôm SPF khỏe sống chung đàn tôm đã nhiễm EHP, như được mô tả bởi Salachan và cộng sự. (2017). Mặc dù đồng cư trú có thể được sử dụng để truyền nhiễm EHP vào đàn SPF, tuy nhiên việc sử dụng phương pháp này để kiểm tra định kỳ một số lượng lớn các dòng di truyền rất khó do không có khả năng định lượng chính xác số lượng bào tử EHP được giải phóng vào nước và thời gian cần thiết để phát hiện EHP ở tôm SPF.

Để phát triển một phương pháp chuẩn hóa, chúng tôi đã so sánh hai phương pháp được công bố trước đây (thử nghệm bằng đường thức ăn và đồng cư trú) (Aranguren và cộng sự Năm 2017; Salachan và cộng sự, 2017) và ba phương pháp mới (tiêm cơ, tiêm gan tụy và tiêm ngược vào ống tiêu hóa) để xác định phương pháp hữu ích nhất trong việc tạo ra một lượng lớn chất cấy EHP trong thời gian ngắn. Sử dụng mô học H&E và định lượng PCR, chúng tôi đã chứng minh rằng việc tiêm chất nhiễm truyền EHP trực tiếp vào gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa là hai phương pháp mới có thể được sử dụng trong các nghiên cứu cảm nhiễm EHP để nhanh chóng tạo ra một lượng lớn chất nhiễm truyền EHP đặc hiệu.

2/ Vật liệu và phương pháp

2.1. Tôm giống

Tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) sạch bệnh (SPF) được nhập từ một nhà cung cấp ở Mỹ. Những con giống này đã được sàng lọc các bệnh theo danh sách Tổ chức thú y thế giới OIE và các bệnh không trong danh sách, bao gồm cả EHP trước khi thử nghiệm. Nhà cung cấp Hoa Kỳ đã tiến hành một chương trình giám sát trong ít nhất 2 năm với các mẫu để sàng lọc theo chuẩn USDA. Các con giống có kết quả sàng lọc âm tính với tất cả các mầm bệnh, bao gồm cả EHP.

2.2. Thu chất cấy Enterocytozoon hepatopenaei

Các tôm post nhiễm EHP được sử dụng trong nghiên cứu này có nguồn gốc từ Thái Lan và được chuyển đến Phòng thí nghiệm Bệnh học Nuôi trồng Thủy sản tại Đại học Arizona dưới dạng tôm sống. Sau khi kiểm tra, các con giống sạch bệnh trong danh sách IOE và ngoài danh sách bệnh, tôm chỉ dương tính với EHP. Sau đó, cho tôm thẻ chân trắng SPF sống chung với tôm nhiễm EHP.

Chất cấy EHP được thu như sau: gan tụy (HP) của năm con tôm nhiễm EHP được thu thập và đồng nhất trong nước muối đệm photphat 1X (PBS) pH 7,4. Chất đồng nhất được pha loãng 1: 4 bằng dung dịch nước muối vô trùng 2% và ly tâm trong 1 phút ở 200 vòng / phút. Phần nổi phía trên được thu, pha loãng 1:10 với nước muối vô trùng, và sử dụng ngay lập tức. Phần nổi còn lại được lưu trữ tại 4°C hoặc -80^oC (có và không có 20% glycerol).

2.3. Thử nghiệm sinh học Enterocytozoon hepatopenaei

Đối với nghiệm thức cho “sống chung”, 50 con tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (trọng lượng trung bình 2,5–3,5 g) được nuôi cùng với 50 con tôm dương tính với EHP.

Đối với nghiệm thức cảm nhiễm qua đường ăn, 50 con tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (trung bình trọng lượng 0,5–0,75 g) được chuyển vào một bể 90L và cho ăn với mô bị nhiễm EHP mỗi ngày một lần trong 4 ngày liên tiếp. Mỗi ngày, gan tụy của hai cá thể sống bị nhiễm EHP được cắt nhỏ và cho tôm ăn. Một nhóm khác gồm 11 con tôm được cho ăn bằng gan tụy nhiễm EHP trong 3 ngày liên tục. Các gan tụy bị nhiễm EHP đã được bảo quản trong glycerol; ở -80°C và được rã đông trước khi cho ăn.

Đối với những nghiệm thức tiêm (cả tiêm cơ và tiêm gan tụy), tổng số 81 con tôm thẻ chân trắng sạch bệnh (trọng lượng trung bình 2,5–3,5 g) đã được chia vào 05 bể 90L (10–20 con / bể). Tôm trong bốn bể được tiêm EHP ở đốt bụng thứ 3 (xem Bảng 2 cho danh sách bốn phương pháp thử nghiệm tiêm cơ) và tất cả tôm trong bể cuối cùng được tiêm EHP trực tiếp vào gan tụy

Đối với nghiệm thức tiêm ngược vào ống tiêu hóa qua đường hậu môn, 11 con tôm (trọng lượng trung bình 2,5–3,5 g) được thả trong bể 90-L. Tôm được thả trong bể 1 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu và bỏ đói qua đêm để đảm bảo rằng chất cấy đi đến được gan tụy của mỗi con tôm thử nghiệm. Thủ thuật tiêm ngược được thực hiện theo một quy trình đã được công bố trước đây (Aranguren và cộng sự, 2010). Mỗi con tôm được tiêm 100 μl chất cấy chứa EHP qua lỗ hậu môn bằng cách sử dụng micropipette có gắn đầu bơm 100 µl. Đầu tip được đưa vào vào hậu môn và chất cấy được tiêm thông qua đầu bơm và lên đường ruột của mỗi con tôm. Trước khi tiêm, chất cấy được trộn với thuốc nhuộm để cho phép xác nhận trực quan về việc phân tán của chất nhiễm truyền trong hệ tiêu hóa. Tương tự như vậy, trong các nghiệm thức đối chứng âm, 10–20 con tôm SPF/ bể được cho ăn / tiêm mô gan tụy đồng nhất có nguồn gốc từ động vật khỏe mạnh.

2.4 Lấy mẫu và xét nghiệm PCR

Tôm từ mỗi thử nghiệm sinh học được thu thập ở 14, 30 và 60 ngày sau khi cấy (dpi) để phát hiện EHP bằng PCR. Tôm từ mỗi nghiệm thức bị mổ lấy gan tuỵ, gan tụy được xử lý và phân lập DNA bằng cách sử dụng bộ DNeasy (QIAGEN, Đức) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ DNA của mỗi mẫu được điều chỉnh đến 20 ng / µl trước khi xét nghiệm PCR. Một cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự rRNA 18S (AF186250.1) của tôm thẻ chân trắng bằng cách sử dụng Primer3 (v.0.4.0) (Koressaar và Remm, 2007; Untergasser và cộng sự, 2012). Các trình tự đoạn mồi được sử dụng để phát hiện EHP trước đây đã được công bố (Tang và cộng sự, 2015, Bảng 1). Các thông số khuếch đại cho PCR là 95°C trong 3 phút. tiếp theo là 35 chu kỳ 95 ° C trong 30 giây, 65 ° C trong 30 giây, 72 ° C trong 30 giây và chu kỳ kéo dài 72 ° C trong 5 phút. (Tang và cộng sự, 2015).

Bảng 1. Trình tự nucleotit của mồi và đầu dò được sử dụng trong khuếch đại EHP và gen tôm bằng phương pháp PCR.

Gen chủ đích	Mồi/ đầu dò	Chuỗi (5′-3 ′)	Đoạn vật liệu di truyền	Nguồn
18S rRNA	EHP-510F EHP-510R	GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA	510	Tang và cộng sự, (2015)
18S rRNA	18S-F 18S-R	AATGGCTATCACGGGTAACG ATGCTTTCGCAGTAGGTCGT	630	Nghiên cứu này *
SSU rDNA	F157 R157 TaqMan Probe	AGTAAACTATGCCGACAA AATTAAGCAGCACAATCC FAM-TCCTGGTAGTGTCCTTCCGT-TAMRA	157	Liu và cộng sự. (2018)

Được thiết kế bởi Primer3 (v.0.4.0) dựa trên trình tự rRNA 18S của Penaeus vannamei (AF186250.1).

2.5. Thử nghiệm sinh học Enterocytozoon hepatopenaei mở rộng

Dựa trên kết quả của các thí nghiệm ban đầu, tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm gan tụy đã được sử dụng cho một thí nghiệm quy mô lớn. Để chuẩn bị chất nhiễm truyền, 6 con tôm sạch bệnh và 30 con tôm nhiễm EHP đã được thực hiện PCR thời gian thực để phát hiện EHP theo Liu và cộng sự (2018). Gan tụy từ sáu con tôm dương tính với EHP đã được sử dụng để chuẩn bị chất nhiễm truyền EHP. Ngoài ra, gan tụy từ năm con tôm sạch bệnh được sử dụng để chuẩn bị chất cấy cho đối chứng âm. Việc chuẩn bị chất nhiễm truyền EHP được thực hiện như mô tả ở trên.

2.5.1. Thử nghiệm tiêm ngược ống tiêu hóa

Tám mươi con tôm (trọng lượng trung bình 5,0–5,6 g) được nuôi trong hai bể 1000-L (40 con / mỗi bể). Phương pháp được thực hiện trên tôm từ một bể bằng cách sử dụng 100 µl chất nhiễm truyền EHP cho mỗi con tôm, như đã mô tả trước đó. Tương tự như vậy, tất cả tôm từ bể đối chứng âm tính đều được xử lý chia tiêm ngược với 100 µl chất cấy âm tính.

2.5.2. Thử nghiệm tiêm gan tụy

Tám mươi con tôm (trọng lượng trung bình 5,0–5,6 g) được nuôi trong hai bể 1000 L (40 con / mỗi bể). Tôm từ một bể được tiêm chủng EHP trực tiếp vào gan tụy bằng cách sử dụng 100 µl chất nhiễm truyền cho mỗi con tôm. Tất cả tôm từ bể đối chứng âm đều được tiêm gan tụy bằng cách sử dụng 100 µl chất cấy âm.

Mười con tôm từ mỗi nghiệm thức, tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm gan tụy, được thu thập ở 14 và 60 ngày sau khi cấy để định lượng EHP bằng phương pháp PCR thời gian thực. Để đánh giá mô bệnh học, các mẫu được thu thập ở 14, 30 và 60 ngày sau khi cấy. Phần đầu ngực được chia đôi theo mặt bụng. Một nửa số đầu ngực đã được xử lý được bảo quản trong dung dịch cố định mẫu của Davidson và nửa còn lại được đông lạnh để phân tích định lượng bằng PCR thời gian thực. DNA được phân lập từ mô gan tụy của mỗi con tôm như được mô tả ở trên và được định lượng bằng cách sử dụng PCR thời gian thực theo Liu và cộng sự (2018).

Một nửa còn lại của đầu ngực được bảo quản trong dung dịch cố định mẫu của Davidson được xử lý và nhuộm màu bằng Hematoxylin & Eosin (H&E) theo các phương pháp tiêu chuẩn (Lightner, 1996). Các phiến kính nhuộm H&E được kiểm tra dưới ánh sáng của kính hiển vi (Leica, Đức). Mức độ tổn thương mô được phân loại từ G0- G4 dựa trên một công bố trước đây (Lightner, 1996).

2.6. Phân tích thống kê

Số bản sao EHP thu được từ phân tích định lượng được chuyển đổi thành giá trị log10 trước khi thực hiện phân tích thống kê bằng SPSS v16.0. Kiểm định t-Student được thực hiện và giá trị P<0,05 có ý nghĩa thống kê

3/ Kết quả

3.1. So sánh các phương pháp thử nghiệm EHP

Ban đầu, chúng tôi so sánh năm phương pháp thử nghiệm EHP khác nhau bao gồm tiêm cơ, sống chung, cho ăn, tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm gan tụy. Sống chung, cho ăn mô nhiễm EHP, tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm chất nhiễm truyền trực tiếp vào gan tụy(Hình 1, Bảng 2). Dữ liệu PCR cho thấy cường độ của các đoạn DNA trong các mẫu có nguồn gốc từ thử nghiệm cho ăn và sống chung là cao hơn so với tiêm gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa. Điều này cho thấy mức độ lây nhiễm có thể thay đổi, đặc biệt là theo phương pháp tiêm ngược ống tiêu hóa. Tiêm cơ không gây nhiễm EHP khi chất truyền nhiễm được bảo quản ở 4 ° hoặc -80 ° C và có hoặc không có glycerol.

Tương tự, phương pháp cho ăn mô đông lạnh nhiễm EHP không dẫn đến gây nhiễm EHP. Việc chung sống và cho ăn các mô EHP tươi dẫn đến việc truyền bệnh ở tôm thẻ chân trắng sạch bệnh ở 30 ngày. Điều quan trọng cần nhấn mạnh là tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm gan tụy đã tạo ra sự lây nhiễm có thể phát hiện được bằng PCR và mô bệnh học sau 14 ngày (Hình 1, Bảng 2).

3.2. Xét nghiệm sinh học Enterocytozoon hepatopenaei mở rộng

Các mẫu sinh thiết từ 30 con tôm bị nhiễm EHP được làm real-time PCR để phát hiện EHP. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu đều dương tính với EHP (dữ liệu không được hiển thị). Tỷ lệ sống sót chung cho các phương pháp tiêm ngược ống tiêu hóa EHP và tiêm EHP vào gan tụy tương ứng là 77,5% và 75%. Tỷ lệ sống sót đối với các phương pháp âm tính với tiêm ngược ống tiêu hóa và tiêm gan tụy lần lượt là 90% và 67,5%.

3.2.1. Thử nghiệm tiêm ngược vào ống tiêu hóa

 Mô bệnh học của tôm được thử nghiệm bằng phương pháp tiêm ngược ống tiêu hóa cho thấy một số giai đoạn của EHP (tức là plasmodium và bào tử) (Hình 2A – C) ở 14, 30 và 60 sau thời gian cấy. Cường độ tổn thương tế bào được phân loại ở G2 trong các mẫu được kiểm tra. Khoảng 40% tôm ở 30 ngày cũng có biểu hiện hoại tử gan tụy do nhiễm trùng (SHPN). Đáng chú ý là các mẫu thu hoạch ở 14 và 60 sau cấy không hiển thị bất kỳ dấu hiệu nào của tổn thương hoại tử gan tụy do nhiễm trùng. Không có con tôm nào từ nghiệm thức đối chứng âm tính (tiêm ngược với chất cấy có nguồn gốc từ tôm sạch bệnh) cho thấy bất kỳ dấu hiệu mô bệnh học nhiễm EHP (Hình 2G – H).

Dữ liệu PCR định lượng cho thấy tất cả các mẫu được thu thập ở 14 và 60 sau cấy đều dương tính với EHP. Giá trị Log10 của số bản sao EHP trên mỗi nanogram của tổng gen DNA cao hơn đáng kể ở mẫu 60 sau cấy so với mẫu 14 sau cấy (P< 0.05) (5,39 ± 0,39 so với 6,39 ± 0,17) (Hình 3A). Vi bào tử không được phát hiện ở tôm được tiêm với chất cấy từ gan tụy tôm sạch bệnh.

3.2.2. Thử nghiệm tiêm gan tụy

Mô bệnh học của mô HP bằng phương pháp nhuộm H&E cho thấy cả plasmodium và bào tử (Hình 2D – E). Các tổn thương SHPN đã được quan sát thấy ở một số tôm được thu thập (Hình 2F). Tỷ lệ SHPN trong các mẫu thu thập ở 14, 30 và 60 dpi lần lượt là 10%, 40% và 80%.

Điều thú vị là cấp SHPN ở tôm bị nhiễm bệnh chủ yếu ở cấp G4. Các mẫu từ nghiệm thức âm tính không cho thấy bất kỳ dấu hiệu bệnh lý nào của nhiễm EHP (Hình 2G – H)

Sử dụng PCR định lượng, các mẫu thu thập ở 14 và 60 ngày sau cấy từ việc tiêm gan tụy cho kết quả dương tính với EHP. Không có con tôm nào từ nghiệm thức đối chứng âm có kết quả dương tính với EHP. Dữ liệu định lượng cho thấy giá trị Log10 của số bản sao EHP trên mỗi nanogram DNA bộ gen được chiết xuất trong các mẫu thu thập ở 14 và 60 dpi lần lượt là 4,43 ± 0,28 và 6,55 ± 0,08. Phân tích thống kê cho thấy tải lượng EHP tăng lên đáng kể theo thời gian (Hình 3B) (P <0,05).

Hình 1. Phát hiện phát hiện EHP bằng PCR ở tôm thẻ chân trắng Penaeus sau khi cảm nhiễm bằng các phương pháp khác nhau. (A) Tiêm cơ bằng cách sử dụng tươi tiêm cơ, (B) Tiêm cơ sử dụng chất cấy được bảo quản ở 4 ° C, (C) Tiêm cơ sử dụng chất cấy đông lạnh (-80 ° C), (D) Tiêm cơ bằng cách sử dụng chất cấy có glycerol đông lạnh -80^oC, (E) phương pháp cho ăn với chất cấy đông lạnh có glycerol, (F) cho ăn với chất cấy tươi, (G) chất cấy tươi được tiêm trực tiếp vào gan tụy, (H) tiêm ngược với chất cấy tươi, (I) sống chung.

Bảng 2. Tóm tắt kết quả xét nghiệm sinh học Enterocytozoon hepatopenaei sử dụng các phương pháp thử thách khác nhau.

Phương pháp thử nghiệm sinh học	Số lượng động vật được thả	Kết quả PCR			Phần trăm bị nhiễm
		14 dpi	30dpi	60dpi	14 dpi	30dpi	60dpi
Các thử nghiệm sinh học ban đầu Sống chung Thử nghiệm bằng thức ăn	50   50	Tích cực   0/2 0/3	Tích cực   3/3 3/3	Tích cực   2/2   2/2	0%   0%	100%   100%	100%   100%
Thử nghiệm tiêm Tiêm gan tụy với nguyên liệu tươi Tiêm ngược ống tiêu hóa	11   10	2/2   1/2	2/2   1/2	2/2   1/2	100%   50%	100%   50%	100%   50%
Tiêm cơ Chất cấy được bảo quản trong tủ lạnh Chất cấy được bảo quản glycerol đông lạnh Chất cấy đông lạnh Chất cấy tươi	20   20   20 10	0/3   0/3   0/3 0/3	0/3   0/3   0/3 0/3		0%   0%   0% 0%	0%   0%   0% 0%	0%   0%   0% 0%
Thử nghiệm cho ăn Nguyên liệu bảo quản glycerol đông lạnh	11	0/2	0/2	0/2	0%	0%	0%

Hình 2. Mô bệnh học của mô gan tụy (HP) của tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei bị cảm nhiễm với EHP bằng cách sử dụng các đường phân phối chất cấy khác nhau (Độ phóng đại 100 ×). (A – C) Mô bệnh học HP của tôm được cảm nhiễm thông qua thiết kế ngược, (D – F) Mô bệnh học HP của tôm được cảm nhiễm thông qua việc tiêm chất cấy trực tiếp vào HP, (G – I) mô bệnh học của HP từ tôm không bị cảm nhiễm. Các mũi tên màu đen cho biết các tế bào có chứa bào tử EHP; các ngôi sao màu trắng cho biết plasmodium và SPF = tác nhân gây bệnh tự do cụ thể.

Hình 3. Định lượng EHP bằng qPCR ở tôm tiếp xúc với các con đường vận chuyển chất cấy khác nhau. (A) Tôm thử nghiệm thông qua thiết kế ngược, (B) tôm cảm nhiễm qua tiêm chất cấy trực tiếp vào HP. Số bản sao của EHP được hiển thị dưới dạng giá trị cơ sở nhật ký 10. Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SE Phân tích thống kê được thực hiện bằng phép thử t-test Student. Dấu hoa thị (*) chỉ ra sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nghiệm thức (P <0,05).

Thảo luận

Kể từ năm 2009, Enterocytozoon hepatopenaei ngày càng được chú ý khi mức độ thiệt hại kinh tế do EHP trong các ao nuôi thương phẩm ngày càng tăng (Thitamadee và cộng sự, 2016). Hiện nay, EHP là một trong những mối quan tâm lớn nhất đối với nông dân mọi quốc gia sản xuất tôm nơi dịch bệnh đã được phát hiện (Aranguren và cộng sự, 2019; Rajendran và cộng sự, 2016; Tang và cộng sự, 2016; Thitamadee và cộng sự, 2016). Căn bệnh này đã được chú ý hơn vì EHP được phát hiện có liên quan đến hội chứng phân trắng (WFS) trong các ao nuôi thương phẩm (Aranguren và cộng sự, 2019; Ha và cộng sự, 2010; Tang và cộng sự, 2016), mặc dù căn nguyên của hội chứng phân trắng vẫn chưa được xác định. Hơn nữa, EHP được phát hiện là một yếu tố nguy cơ của AHPND (Aranguren và cộng sự, 2017). Đây là điều cần được quan tâm đặc biệt vì ở nhiều quốc gia có AHPND, EHP hiện đã được phát hiện.

EHP gây ra bệnh nhiễm trùng mãn tính ở thẻ chân trắng và tác động của bệnh, không giống như nhiều tác động gây bệnh khác như VPAHPND hoặc WSSV, trở nên rõ ràng vào cuối giai đoạn nuôi thương phẩm. Do đó, các nghiên cứu trong PTN liên quan đến EHP thường tốn nhiều thời gian hơn các nghiên cứu liên quan đến VP_AHPND hoặc WSSV, trong đó tỷ lệ chết của tôm nhiễm bệnh bắt đầu trong vòng chưa đầy một tuần. Các nghiên cứu liên quan đến EHP còn phức tạp hơn do thiếu phương pháp để sản xuất số lượng lớn chất nhiễm truyền trong một khoảng thời gian tương đối ngắn; một khó khăn trong sàng lọc di truyền của tôm thẻ chân trắng để xác định khả năng kháng EHP hay sức chịu đựng nó. Trong nghiên cứu này, ban đầu chúng tôi so sánh các con đường di chuyển khác nhau của mầm bệnh bằng cách sử dụng mô nhiễm EHP mới được thu thập hoặc các mô đã được bảo quản ở 4 ° C hoặc -80 ° C để tìm ra phương pháp có thể được sử dụng thường xuyên để phát triển một phương pháp thử nghiệm EHP mạnh mẽ. Các kết quả ban đầu chỉ ra rằng hai phương pháp, tiêm chất truyền nhiễm EHP trực tiếp vào gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa của chất nhiễm truyền EHP, có thể gây cảm nhiễm trong vòng 2 tuần sau thí nghiệm. Từ hai phương pháp cho phép sản xuất một lượng chất nhiễm truyền đã biết, hai phương pháp đã được thử nghiệm thêm bằng cách sử dụng số lượng động vật nhiều hơn để xác nhận kết quả của bộ thí nghiệm đầu tiên.

Đáng chú ý là việc tiêm cơ EHP không tạo ra sự lây nhiễm EHP ở thử nghiện tôm của bất kể phương pháp bảo quản (tức là chất cấy tươi hoặc chất cấy đông lạnh được bảo quản sử dụng 20% glycerol). Không giống như EHP, việc phân phối vi khuẩn bằng cách tiêm cơ dẫn đến kết quả lâm sàng dấu hiệu của AHPND (Joshi và cộng sự, 2014). Mặc dù cả EHP và VP_AHPND là mầm bệnh đường ruột có liên quan đến nhiễm trùng đường ruột (Kolling và cộng sự, 2012 cung cấp chất cấy EHP thông qua tiêm cho cơ có thể không đến mô. Được biết rằng mầm vi khuẩn rất đặc hiệu cho mô (ví dụ, Langdon và Thorne, 1992; Terry et al., 2007) hiếm khi phát triển trong các mô “không đặc hiệu”.

Các kết quả từ thử nghiệm “sống chung” phù hợp với kết quả từ một nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng EHP có thể theo lây truyền theo chiều ngang qua môi trường sống chung (Salachan và cộng sự, 2017), mặc dù Salachan và đồng nghiệp báo cáo phát hiện EHP ở 14 ngày sau cấy so với hiện tại nghiên cứu khi EHP được phát hiện ở 30 ngày sau cấy. Sự khác biệt về thời gian phát hiện của EHP ở nghiệm thức sống chung có thể là do mức độ chất cấy có trong nước tại thời điểm thử nghiệm. Phương pháp “sống chung” khó tuân theo trong khi các nghiên cứu khía cạnh nhất định của mầm bệnh EHP do liều lượng EHP tiêm vào tôm rất khó để đánh giá chính xác trong các thí nghiệm này.

Tôm được cảm nhiễm qua đường thức ăn bằng cách sử dụng chất nhiễm truyền tươi đã được kiểm tra nhạy cảm với EHP, nhưng chất cấy được đông lạnh ở -80 ° C không gây ra sự nhiễm EHP. Điều này cho thấy rằng việc lưu trữ chủng EHP cho các nghiên cứu trong tương lai không phải là một lựa chọn khả thi, không giống như nhiều loại virus tôm, chất truyền nhiễm virus được lưu trữ ở -80 ° C cho các thí nghiệm trong tương lai. Các quan sát tương tự đã được ghi lại ở vi bào tử của Nosema algerae và N. locusta khi đông lạnh bào tử dẫn đến mất khả năng sống, bào tử không thể bắt đầu lây nhiễm theo Undeen và Frixione (1991) và Whitlock và Johnson (1990).

Thử thách tiêm ngược và tiêm EHP vào gan tụy đã tạo ra sự lây nhiễm thành công và có thể được sử dụng như một phương pháp can thiệp để thử nghiệm tôm với một lượng chất cấy đã biết.

Tiêm ngược vào ống tiêu hóa đã được sử dụng để tái tạo sự lây nhiễm ở hai mầm bệnh đường ruột khác của tôm bao gồm VP_AHPND và vi khuẩn viêm tụy hoại tử (NHP-B) (Aranguren và cộng sự, 2010; Tran và cộng sự, 2013).

Đáng chú ý là có lẽ do căng thẳng gây ra bởi tiêm ngược đường ống tiêu hóa, hoại tử gan tụy do nhiễm trùng đã gây ra ở động vật được tiêm EHP cũng như ở động vật được tiêm giả 30 ngày sau cấy. Tuy nhiên, các động vật dường như phục hồi 60 ngày sau cấy vì không có hoại tử gan tụy do nhiễm trùng được quan sát bởi H & E trong các mẫu thu thập ở 60 ngày sau cấy. Gần đây, chúng tôi đã báo cáo kết quả nhiễm EHP ở gan tụy làm bong tróc các tế bào biểu mô để lộ một phần màng đáy bên dưới của ống cho vi khuẩn cơ hội (Aranguren và cộng sự, 2019).

Theo hiểu biết của chúng tôi, đây là báo cáo đầu tiên về sự lây lan của sự lây nhiễm EHP thông qua việc tiêm chất cấy vào gan tụy và bằng cách tiêm ngược ống tiêu hóa. Hiện tại vẫn chưa rõ tại sao việc tiêm trực tiếp chất cấy vào gan tụy lại gây ra nhiễm trùng EHP, nhưng chúng tôi suy đoán rằng khi tiêm chất cấy trực tiếp vào gan tụy sẽ kích hoạt các bào tử ngay lập tức và giúp hình thành sự lây nhiễm. Chúng tôi suy đoán việc tiêm chất cấy trực tiếp vào gan tụy sẽ kích hoạt các bào tử EHP và bắt đầu trong quá trình đào thải. Khả năng của chúng tôi trong việc tạo ra sự lây nhiễm EHP ở tôm sạch bệnh bằng cách đưa chất nhiễm truyền vào gan tụy mở ra một con đường mới để tăng sinh EHP bắt đầu với số lượng chất nhiễm truyền có hạn và cảm nhiễm tôm với một lượng chất cấy nhất định. Điều này sẽ cho phép cảm nhiễm một số lượng lớn động vật tiềm tàng trong một thời gian tương đối ngắn. Nó sẽ giúp chúng tôi vượt qua một nút thắt trong việc sàng lọc đàn tôm thẻ chân trắng để xem có khả năng kháng EHP hay không. Chúng tôi nhận thấy rằng tổn thương tế bào trong các ống gan tụy nghiêm trọng hơn ở tôm được tiêm gan tụy so với những tôm được thử nghiệm thông qua tiêm ngược ống tiêu hóa. Trên thực tế, mức độ lây nhiễm ở tôm được tiêm gan tụy là cấp G4 trong thang điểm từ 0 đến 4 so với cấp G2 đối với tiêm ngược. Tỷ lệ sống cao hơn trong điều trị theo phương pháp tiêm ngược so với tiêm gan tụy, cho thấy rằng tiêm gan tụy có thể gây chết. Những phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây khi tiêm vào gan tụy gây chết tôm (Cruz-Flores và cộng sự, 2019; Kerdmusik và cộng sự, 2018). Mặc dù tỷ lệ chết sẽ không thành vấn đề khi mục đích dự định là tạo ra một lượng lớn chất cấy, nhưng nếu mục đích của thử nghiệm cảm nhiễm là để sàng lọc động vật về khả năng kháng EHP, tỷ lệ chết khi tiêm chất cấy vào gan tụy có thể cản trở mục tiêu của phương pháp để sàng lọc tôm kháng EHP.

Enterocytozoon hepatopenaei là một loại ký sinh trùng nội bào có vòng đời bao gồm một số giai đoạn / dạng sống, bao gồm một plasmodium và bào tử trưởng thành (Rajendran và cộng sự, 2016; Tourtip và cộng sự, 2009). Sự hiện diện của plasmodia và bào tử trong các tế bào biểu mô của gan tụy ở tôm từ cả hai phương pháp thử nghiệm cho thấy rằng cả hai phương pháp đã thử nghiệm đều có thể tránh được sự lây nhiễm EHP.

Phù hợp với các quan sát mô bệnh học, giá trị Log10 của số bản sao EHP trong các nghiệm thức tiêm ngược và tiêm gan tụy (từ 14 ngày sau cấy đến 60 ngày sau cấy) tăng tương ứng 1 và 2-log. Sự gia tăng mật độ EHP đáng kể ở tôm được thử nghiện qua hai con đường khác nhau cho thấy rằng sự lây nhiễm EHP đã sinh ra qua cả hai phương pháp mặc dù tiêm gan tụy có vẻ hiệu quả hơn tiêm ngược ống tiêu hóa

Điều đáng chú ý là kết quả mô bệnh học từ xét nghiệm sinh học EHP thông qua tiêm gan tụy cho thấy tỷ lệ hoại tử gan tụy do nhiễm trùng trong gan tụy cao hơn so với tôm được thử nghiệm bằng phương pháp tiêm ngược ống tiêu hóa. Phát hiện này cung cấp hỗ trợ cho một báo cáo trước đây đã mô tả EHP là một yếu tố nguy cơ đối với hoại tử gan tụy do nhiễm trùng (Aranguren và cộng sự, 2017); Có khả năng là các vết thương tạo ra ở gan tụy khi tiêm có thể tạo điều kiện cho vi khuẩn cơ hội như Vibrio spp. để tấn công.

Tóm lại, chúng tôi đã so sánh năm phương pháp thử nghiệm khác nhau để tái tạo EHP trên tôm thẻ chân trắng; trong đó gồm hai phương pháp, tiêm trực tiếp vào gan tụy và tiêm ngược ống tiêu hóa chưa được mô tả trước đây. Trong số các phương pháp thử nghiệm, có bốn phương pháp gây nhiễm trên tôm sạch bệnh thành công. Tiêm gan tụy dường như gây ra sự gia tăng của EHP ở mức cao hơn so với tiêm ngược ống tiêu hóa. Vì hai phương pháp mới được mô tả này, mô bệnh học của mô gan tụy cho thấy các dạng khác nhau của plasmodium và bào tử trưởng thành trong tế bào biểu mô của ống gan tụy. Mật độ của EHP tăng dần đáng kể theo thời gian khi quá trình lây nhiễm tiến triển, cho thấy khả năng lây nhiễm thành công qua cả hai phương pháp lây truyền mầm bệnh. Việc tiêm chất truyền nhiễm vào gan tụy dẫn đến mức độ nhiễm trùng cao hơn so với phương pháp tiêm ngược ống tiêu hóa. Điều này được xác định bằng mô bệnh học và định lượng PCR. Do đó, tiêm vào gan tụy là một phương pháp mới và cải tiến cho việc thử nghiệm EHP và cung cấp một số lợi ích so với các phương pháp đã biết trước đây, bao gồm khả năng tăng chất truyền nhiễm bắt đầu với một liều lượng nhất định và cho phép cảm nhiễm với một lượng EHP đã biết.

Nhóm tác giả: Hung Nam Mai, Roberto Cruz-Flores, Luis Fernando Aranguren Caro, Brenda Noble White, Arun K. Dhar

Biên dịch: Yến Ly – Công ty TNHH PTTS Bình Minh.

Từ khóa: Enterocytozoon hepatopenaei, EHP, Tôm, thử nghiệm sinh học, phương pháp reverse gavage (bơm dịch tiết ngược từ đường hậu môn tôm), gan tụy, sống chung.

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

• Thực trạng nhiễm IHHNV trong ngành tôm ở Peru và Ecuador
• Thức ăn thay thế Artemia được ra mắt ở Ấn Độ
• Các Nhà Sản Xuất Và Xuất Khẩu Tôm Ở Bangladesh Kêu Gọi Nuôi Tôm Thẻ Chân Trắng Thương Phẩm