Sự Phân Hủy Hạn Chế Giúp Tăng Cường Khả Năng Phát Hiện Vibrio AHPND Trong Tôm Bằng Phương Pháp PCR

Xét nghiệm PCR có thể được sử dụng để phân biệt các chủng gây bệnh APHND.

Trong những năm gần đây, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) đã được ghi nhận tại nhiều quốc gia nuôi tôm trên thế giới. Các nghiên cứu hiện nay cho thấy những chủng Vibrio parahaemolyticus gây AHPND có thể tồn tại trong phần trước của đường tiêu hóa tôm với mật độ rất thấp, dưới ngưỡng phát hiện của phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR), và chưa gây ra biểu hiện bệnh lý. Vì vậy, việc phát hiện những cá thể mang mầm bệnh nhưng chưa xuất hiện triệu chứng bằng PCR phụ thuộc đáng kể vào quy trình xử lý mẫu sau khi tôm được thu từ ao hoặc bể nuôi, bởi các bước xử lý này có thể làm thay đổi độ nhạy của xét nghiệm.

Mồi PCR

Từ năm 2013, kỹ thuật PCR đã được ứng dụng để phát hiện vi khuẩn V. parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND). Trong hai năm gần đây, các cặp mồi PCR cải tiến nhắm đặc hiệu vào các đoạn DNA thuộc gen mã hóa độc tố Pir đã được phát triển tại phòng thí nghiệm của Tiến sĩ Timothy Flegel ở Thái Lan và Tiến sĩ Donald Lightner tại Arizona, Hoa Kỳ. Bên cạnh đó, hiện nay cũng đã có nhiều bộ kit PCR thương mại hỗ trợ chẩn đoán AHPND.

Một nghiên cứu của nhóm tác giả đã đánh giá hiệu quả của phương pháp PCR cải tiến trong việc phát hiện V. parahaemolyticus có khả năng gây AHPND trên những con tôm không biểu hiện triệu chứng và vẫn có vẻ khỏe mạnh trong các ao nuôi chưa ghi nhận dịch bệnh. Nghiên cứu được thực hiện bằng cách để mẫu tôm chết và bắt đầu phân hủy trong vài giờ trước khi được bảo quản bằng ethanol, nhằm xác định liệu phương pháp này có giúp tăng khả năng phát hiện mầm bệnh hay không.

Các thông số nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng ba cặp mồi PCR để phát hiện vi khuẩn và các gen liên quan đến bệnh AHPND. Trong đó, cặp mồi Vpldh phản ứng với trình tự DNA nằm trong gen mã hóa hemolysin phụ thuộc lecithin, là chỉ dấu đặc hiệu cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Cặp mồi AP4 là phương pháp PCR lồng ghép có độ nhạy cao hơn, được phát triển dựa trên thử nghiệm AP3 trước đó của Donald V. Lightner Flegel. Phương pháp AP3 phát hiện các gen ToxA và ToxB tương đồng với Pir, tương tự như cặp mồi VpPirAB do Han và các cộng sự công bố. Những gen này mã hóa các protein độc tố, là nguyên nhân trực tiếp gây ra bệnh AHPND ở tôm.

Các mẫu tôm được thu thập ngẫu nhiên bằng cách quăng lưới tại bốn ao thuộc một trang trại ở Mỹ Latinh, nơi trước đó đã ghi nhận hiện tượng tôm chết rải rác. Tuy nhiên, tại thời điểm lấy mẫu, không quan sát thấy hiện tượng tôm chết trong các ao.

Ở mỗi ao nuôi, một mẻ tôm được thu thập và ký hiệu lần lượt là O, P, Q và R. Từ mỗi mẻ, tôm được chia thành hai nhóm để tiến hành lấy mẫu và phân tích. Nhóm 1 (O1, P1, Q1 và R1) gồm số lượng lớn tôm được xử lý ngay sau khi thu bằng phương pháp tiêm để gây chết nhanh, sau đó bảo quản trong cồn 95%.

Nhóm 2 (O2, P2, Q2 và R2) được thu gom rồi để bên ngoài ao cho đến khi chết tự nhiên. Các mẫu thuộc nhóm này được giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 4–5 giờ để xảy ra quá trình phân hủy trước khi được xử lý bằng cách tiêm và ngâm trong cồn 95%.

Trong bốn ao được lấy mẫu, hai ao nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và hai ao còn lại nuôi tôm sú (Penaeus monodon). Các ao được thả giống ở những thời điểm khác nhau nên kích thước tôm giữa các ao không đồng đều, mặc dù tất cả đều ở giai đoạn tôm non. Số lượng tôm ở từng loài và theo từng phương pháp xử lý được trình bày trong Bảng 1.

Xử lý trong phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm PCR, mỗi cá thể tôm được xử lý như một mẫu độc lập. Đối với các cá thể có kích thước nhỏ hơn thuộc các nhóm O1-2, P1-2 và Q1-2, phần đầu được tách khỏi đuôi, mắt được loại bỏ và chỉ giữ lại phần thân chính của đầu để tiếp tục xử lý phục vụ xét nghiệm PCR.

Đối với các cá thể lớn hơn thuộc nhóm R1-2, từng con được mổ tách riêng. Dạ dày và tuyến gan tụy được lấy ra, sau đó xử lý và phân tích như những mẫu riêng biệt cho xét nghiệm PCR. DNA chiết xuất từ mỗi cá thể tôm sau đó được phân tích bằng ba bộ mồi khác nhau.

Kết quả

Như trình bày trong Bảng 2, các mẫu tôm thuộc Nhóm 1 (O1, P1, Q1 và R1) được cố định ngay khi còn sống. Kết quả PCR cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với Vpldh dao động từ 3,3% đến 16,7%, trong khi không ghi nhận bất kỳ mẫu nào dương tính với VpPirAB hoặc AP4.

Ngược lại, ở Nhóm 2 (O2, P2, Q2 và R2), nơi tôm được để phân hủy trước khi tiến hành cố định, tỷ lệ mẫu dương tính với Vpldh tăng rõ rệt, dao động từ 25% đến 100%. Đồng thời, tỷ lệ dương tính với VpPirAB ghi nhận ở các nhóm lần lượt là 0%, 12,5% và 100%, còn tỷ lệ dương tính khi sử dụng mồi AP4 lần lượt đạt 0%, 37,5% và 100%.

Giải thích

Dữ liệu xét nghiệm PCR đã cho thấy ba điểm quan trọng. Trước hết, kết quả từ bộ mồi Vpldh xác nhận rằng Vibrio parahaemolyticus không gây AHPND là thành phần phổ biến trong hệ vi sinh của ao nuôi tại trang trại, do vi khuẩn này được phát hiện ở một số mẫu tôm thu từ cả bốn ao khảo sát.

Tiếp theo, ở Nhóm 1, không có mẫu tôm nào từ bốn ao cho kết quả PCR dương tính với các bộ mồi VpPirAB hoặc AP4. Điều này cho thấy những con tôm được lấy mẫu và xử lý ngay sau khi thu thập không chứa Vibrio parahaemolyticus gây AHPND, hoặc nếu có thì mật độ của vi khuẩn nằm dưới ngưỡng phát hiện của các bộ mồi PCR được sử dụng.

Cuối cùng, ở Nhóm 2, quá trình phân hủy mẫu trước khi bảo quản bằng ethanol đã làm tăng tỷ lệ mẫu cho kết quả PCR dương tính đối với cả ba bộ mồi. Đáng chú ý, sự phân hủy này còn làm tăng độ nhạy của xét nghiệm trong việc phát hiện Vibrio parahaemolyticus gây AHPND, khi có hai trong số bốn mẫu ao được xác định dương tính.

Thứ tư, nghiên cứu này cho thấy bộ mồi AP4 có độ nhạy nhỉnh hơn đôi chút so với bộ mồi VpPirAB trong việc phát hiện AHPND do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra.

Kết quả PCR được cải thiện có thể được giải thích một cách đơn giản là quá trình phân hủy của xác tôm đã tạo ra nguồn dinh dưỡng thuận lợi cho vi khuẩn phát triển. Nhờ đó, số lượng vi khuẩn trong mô tôm tăng lên, làm gia tăng sinh khối và lượng DNA hiện diện. Khi có đủ DNA đích, các mồi PCR sẽ dễ dàng khuếch đại hơn, từ đó làm tăng khả năng phát hiện và cho kết quả dương tính.

Các khuyến nghị

Xét nghiệm PCR là một công cụ hiệu quả giúp phân biệt các chủng AHPND do vi khuẩn gây ra với các chủng Vibrio parahaemolyticus không độc lực. Đối với tôm chưa xuất hiện triệu chứng nhưng cần kiểm tra sự hiện diện của chủng gây bệnh, các nhà nghiên cứu khuyến cáo nên lấy riêng dạ dày và gan tụy của từng con, sau đó cấy mẫu vào môi trường nuôi vi khuẩn thích hợp trong khoảng 5–12 giờ trước khi bảo quản bằng ethanol. Bên cạnh đó, sau khi thu mẫu từ ao, tôm nên được giữ riêng để phân hủy tự nhiên tối thiểu 5 giờ rồi mới tiến hành cố định bằng ethanol. Việc thực hiện các bước xử lý ban đầu này trước khi bảo quản sẽ giúp tăng đáng kể độ nhạy của phương pháp PCR trong phát hiện chủng Vibrio parahaemolyticus liên quan đến bệnh AHPND.

Theo Nathene L. Antonio, BS và James A. Brock, DVM Hank Bauman

Nguồn: https://www.globalseafood.org/advocate/limited-decomposition-enhances-pcr-detection-of-ahpnd-vibrio-in-shrimp/

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Ký Sinh Trùng Làm Tăng Khả Năng Nhiễm Flavobacterium columnare Ở Cá Rô Phi
• Tích Hợp Sản Xuất Thức Ăn Chăn Nuôi Vào Hoạt Động Sản Xuất Cá Hoặc Tôm
• Phân Tích Phiên Mã mRNA và RNA Vòng Cho Thấy Việc Bổ Sung Lactiplantibacillus Plantarum Đông Khô Vào Khẩu Phần Ăn Giúp Tăng Cường Trí Nhớ Miễn Dịch Của Tôm Thẻ Chân Trắng (Penaeus vannamei) Chống Lại Mầm Bệnh