Tóm tắt

Bệnh nhiễm vi bào tử trùng (HPM) do Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra, ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng và phát triển của tôm thẻ chân trắng và đang làm tăng thiệt hại kinh tế cho người nuôi tôm. Kết quả từ nghiên cứu chuyển hóa trước đây của chúng tôi cho thấy 24 chất chuyển hóa, bao gồm axit linolenic (LNA), đã giảm đáng kể ở tôm nhiễm EHP so với các nhóm khỏe mạnh. Nghiên cứu này nhằm đánh giá liệu LNA có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng và tình trạng miễn dịch của tôm nhiễm EHP hay không. Tôm nhiễm EHP được cho ăn theo khẩu phần ăn LNA (0, 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg) trong 30 ngày. Kết quả cho thấy chiều dài cơ thể và trọng lượng của tôm ở nhóm khẩu phần ăn 2,4 g LNA/kg tăng đáng kể so với các nhóm còn lại. Số lượng bào tử của EHP đã giảm đáng kể ở nhóm khẩu phần ăn 1,2, 2,4 và 4,8 LNA g/kg so với nhóm không có khẩu phần ăn LNA. Trong một nghiên cứu sâu hơn, 2 gen liên quan đến tăng trưởng (axit farnesoic Omethyltransferase và protein điều hòa ecdysteroid) đã giảm đáng kể khi tôm được cho ăn với khẩu phần ăn 2,4 g LNA/kg, trong khi carboxylesterase 1, một loại hormone esterase của tôm lại tăng lên. Nó cho thấy rằng LNA có thể cải thiện năng suất tăng trưởng của tôm nhiễm EHP. Quan trọng hơn, ba gen miễn dịch (protein giống như peritrophin-44, lysozyme và cathepsin C) ở tôm đã tăng đáng kể sau khi bổ sung khẩu phần ăn LNA. Ngoài ra, hoạt tính của enzyme superoxide dismutase và catalase trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng đã tăng lên rõ rệt sau khi bổ sung LNA với các nồng độ khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng LNA thích hợp trong thức ăn (khẩu phần ăn 2,4 g / kg) có thể cải thiện tốc độ tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng và tăng cường khả năng miễn dịch không đặc hiệu và hoạt động chống oxy hóa. Kết quả từ nghiên cứu này chỉ ra rằng LNA có thể được sử dụng như một chất điều hòa chuyển hóa tiềm năng để kiểm soát HMP do EHP gây ra và ngăn ngừa quá trình trao đổi chất của tôm thẻ chân trắng với các bệnh truyền nhiễm.

1/ Giới thiệu

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), một tác nhân gây ra bệnh vi bào tử trùng (HPM), đã được đặc trưng và đặt tên theo tôm sú Penaeus monodon (xem Tourtip và cộng sự, 2009), và sau đó cũng được quan sát thấy khi nuôi tôm thẻ Penaeus vannamei (xem Tangprasittipap và cộng sự, 2013). Nghiên cứu cho thấy rằng nhiễm EHP tác động đáng kể đến quá trình sinh trưởng ở tôm. Cho đến nay, nghiên cứu của EHP đã tập trung vào việc phát triển các xét nghiệm phát hiện mới, nghiên cứu bộ gen so sánh, mô bệnh học và cơ chế lây nhiễm (Haroenlak và cộng sự, 2016; Santhoshkumar và cộng sự, 2017; Wiredu Boakye và cộng sự, 2017; Karthikeyan và Sudhakaran, 2019). Phương pháp điều trị bệnh HPM đóng vai trò quan trọng trong việc giảm thiệt hại kinh tế khi nuôi tôm. Tuy nhiên, không có báo cáo nào về việc nghiên cứu này.

Một loạt các ngành khoa học ‘omics’ (ví dụ: transcriptomics, proteomics, metabolomics) đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu về sự tăng trưởng và phát triển ở các loài thủy sản, khả năng miễn dịch bẩm sinh, quá trình tiến hóa và ảnh hưởng độc học với thành công cực kỳ cao (Santos và cộng sự, 2010; Alfaro và Young, 2018). Transcriptomics và proteomics lần lượt nghiên cứu về những gì đang xảy ra trong sinh vật và những gì thúc đẩy quá trình hình thành tế bào(Mishra, 2011; McGettigan, 2013; Olsen và Mann, 2013). Trong khi, các chất chuyển hóa (nghiên cứu về các phân tử nhỏ) cho thấy tổng quan tốt hơn về đặc điểm của sinh vật, vì các chất chuyển hóa nhạy cảm nhất với những thay đổi của môi trường, cho chúng ta cái nhìn sâu sắc về những gì đang diễn ra ở mức độ tế bào và quá trình trao đổi chất (Patti và cộng sự, 2012; Alfaro và Young, 2018). Ngoài ra, nghiên cứu được sử dụng để xác định các chất chuyển hóa chính và con đường đánh dấu sinh học ở các loài thủy sản bị nhiễm khuẩn gây bệnh. Sau đó, các dấu ấn sinh học ngoại sinh có thể điều chỉnh quá trình trao đổi chất và cải thiện khả năng chống lại sự lây nhiễm các mầm bệnh khác nhau của các loài thủy sản (Ji và cộng sự, 2013; Guo và cộng sự, 2014; Zhao và cộng sự, 2015). Ví dụ, N-acetylglucosamine ngoại sinh và L-proline có dấu hiệu cải thiện khả năng sống sót của cá rô phi chống lại bệnh nhiễm trùng do Streptococcus gây ra (xem Cheng và cộng sự, 2014; Zhao và cộng sự, 2015). Kết quả trước đó cho thấy việc nhiễm EHP làm tăng đáng kể 25 chất chuyển hóa ở tôm, trong khi 24 chất chuyển hóa khác bao gồm axit linolenic (LNA), myo-inositol và N-acetyl-D-galactosamine, giảm đáng kể ở nhóm tôm nhiễm EHP so với nhóm khỏe mạnh (Ning và cộng sự, 2019). Do đó, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng một hoặc nhiều chất chuyển hóa ngoại sinh khác biệt có thể cải thiện tình trạng chậm phát triển của tôm do EHP gây ra.

LNA (18: 3n-3), một loạt axit béo không bão hòa đa chuỗi n-3  (PUFA), chủ yếu có nguồn gốc từ dầu thực vật như dầu mè và dầu hạt lanh. Nó thúc đẩy động vật phát triển, tăng cường khả năng miễn dịch và hoạt động chống oxy hóa, cải thiện chất lượng thịt và giảm lipid máu (Wu và Chen, 2012; Chen và cộng sự, 2014). Bogut và cộng sự nhận thấy rằng việc bổ sung axit linolenic 1% vào khẩu phần ăn tiêu chuẩn của cá da trơn có lợi cho các chỉ số tăng trưởng và chất lượng thịt của cá (Bogut và cộng sự, 2002). Một nghiên cứu khác cho thấy LNA và axit linoleic (LA) ở mức khẩu phần 2% theo tỷ lệ 3:1 có lợi cho việc tăng trọng và đáp ứng miễn dịch tế bào không đặc hiệu của cá mú non (Wu và Chen, 2012). Ngoài cá ra, LNA cũng góp phần vào sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm (Kanazawa và cộng sự, 1979; Merican và Shim, 1997; Glencross và cộng sự, 2002). Tuy nhiên không có nghiên cứu nào cho thấy LNA có thể được sử dụng như một chất điều hòa chuyển hóa để cải thiện các triệu chứng lâm sàng của HPM do EHP gây ra ở tôm thẻ chân trắng. Trong nghiên cứu này, dựa trên dữ liệu chuyển hóa trước đó (Ning và cộng sự, 2019), LNA đã được chọn thêm vào khẩu phần ăn nhằm nghiên cứu ảnh hưởng của chúng đối với P. vannamei. Sau khi cho ăn LNA trong 30 ngày, tôm thẻ chân trắng được kiểm tra hiệu suất tăng trưởng, tình trạng miễn dịch và hoạt động chống oxy hóa. Nghiên cứu này không chỉ cung cấp chất điều hòa chuyển hóa để ngăn ngừa và điều trị HMP do EHP gây ra, mà còn cung cấp những thông tin mới về ngăn ngừa các bệnh truyền nhiễm do sự trao đổi chất trên vật chủ.

2/ Vật liệu và phương pháp

2.1 Xét nghiệm PCR để phát hiện EHP từ mẫu tôm

 Tôm chậm phát triển (chiều dài cơ thể trung bình 9,57 ± 0,82 cm; trọng lượng cơ thể trung bình 5,78 ± 1,22 g) có biểu hiện nhiễm vi bào tử trùng microsporidia được lấy từ tôm thương phẩm ở Rudong, thành phố Nam Thông, tỉnh Giang Tô, Trung Quốc. Để xác định rằng tôm chậm phát triển là do EHP gây ra, chúng tôi đã sử dụng các mồi cụ thể, EHP-510-F và EHP-510- R (Bảng 1) từ bộ gen EHP (Tang và cộng sự, 2015) bằng kỹ thuật phản ứng khuếch đại gen (PCR). Tách chiết DNA trong gan tụy từ 20 con tôm được chọn ngẫu nhiên đã được chuẩn bị bằng kit tách chiết DNA EasyPure (TransGen, Trung Quốc). Hai mươi mẫu đã được kiểm tra thêm về độ tinh khiết và nồng độ bằng máy đo quang phổ (Thermo, Hoa Kỳ). Quá trình khuếch đại PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 μL, chứa 12,5 μL PrimeSTAR Max Premix (Takara, Nhật Bản), 0,2 μM mỗi mồi và 1 μL DNA chiết xuất (100 ng μL^-1). Việc khuếch đại được thực hiện với các thông số theo chu kỳ sau: biến tính ban đầu ở 98ºC trong 3 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ 98ºC trong 5 giây, 55ºC trong 15 giây và 72ºC trong 30 giây và lần cuối cùng kéo dài ở 72ºC trong 10 phút. Và sau đó, các sản phẩm PCR được phân tích trong gel agarose 1,2% có chứa ethidium bromide. Bằng cách sử dụng hệ thống tài liệu gel (Bio-rad, Hoa Kỳ), DNA được khuếch đại dưới ánh sáng tia UV và được giải trình tự bởi Công ty Công nghệ sinh học Springen ở Nam Kinh.

2.2 Thử nghiệm cho ăn

Khẩu phần ăn thử nghiệm cơ bản đã được mua bởi Công ty Tong Wei (Tứ Xuyên, Trung Quốc). Dầu hạt lanh được mua từ công ty TNHH  thương mại điện tử Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) và có hàm lượng LNA là 50%. Khẩu phần ăn thử nghiệm đã được chuẩn bị theo Kiran và công sự (2019). Tóm lại, khẩu phần ăn thử nghiệm cơ bản được phủ với 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g / kg LNA cho mỗi lần phun và sau đó được phủ một lớp chất kết dính thức ăn để ngăn chặn sự rò rỉ LNA vào nước bể tôm. Khẩu phần ăn đối chứng cũng được phủ một lớp keo tương đương. Tất cả các thành phần đã được trộn kỹ. Các khẩu phần ăn thành phẩm được bảo quản ở nhiệt độ -20ºC cho đến khi sử dụng.

2.3 Hệ thống nuôi tôm

Tôm nhiễm EHP (chiều dài cơ thể trung bình 9,57 ± 0,82 cm; trọng lượng cơ thể trung bình 5,78 ± 1,22 g) được nuôi trong điều kiện sục khí liên tục ở nhiệt độ 26 ± 2ºC và độ mặn 10‰ trong bảy ngày trước khi thí nghiệm. 360 con tôm được nuôi trong 12 bể (mỗi bể 100cả, mỗi bể đặt một lượng lưới nhất định làm nơi ẩn náu để giảm việc tôm thử nghiệm ăn thịt lẫn nhau, với độ sâu 0,5 m, được chia thành 4 nhóm và mỗi nhóm 3 bể. Tôm được cho ăn theo bốn khẩu phần ăn có chứa các nồng độ LNA khác nhau (khẩu phần ăn 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g / kg) hai lần mỗi ngày vào lúc 8:30 và 16:30 trong 30 ngày. Tỷ lệ cho ăn hàng ngày là 3-6% trọng lượng cơ thể và được điều chỉnh theo phản ứng cho ăn trước đó.

2.4 Thu thập mẫu và đo lường số vi bào tử trùng EHP

Vào cuối thí nghiệm cho ăn, chiều dài và trọng lượng cơ thể của 30 con tôm được chọn từ mỗi nhóm đã được đo. Gan tụy nhanh chóng được cắt bỏ, đông lạnh trong đá khô và được bảo quản ở nhiệt độ -78ºC cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau đó, gan tụy từ tôm được sử dụng để chuẩn bị tách chiết DNA. Sau khi tách chiết DNA bằng kit tách chiết DNA EasyPure (TransGen, Trung Quốc), thử nghiệm PCR thời gian thực tuyệt đối (Liu và cộng sự, 2016) đã được sử dụng để phát hiện số lượng vi bào tử trùng EHP trong gan tụy. Thử nghiệm được thực hiện ở thể tích 10 μL, với 5 μL hỗn hợp SYBR Premix Ex Taq™ Kit (Vazyme, Trung Quốc), 0,5 μL của mỗi mồi cụ thể (ENF185-qF và ENF185-qR theo trình tự SSU rDNA của tôm EHP (Liu và cộng sự, 2016, Bảng 1), 1 μL DNA và 3 μL ddH2O trong hệ thống PCR thời gian thực StepOnePlus™ (hệ thống ứng dụng sinh học, Hoa Kỳ) theo quy trình sau: biến tính ban đầu ở 95ºC trong 30 giây; tiếp theo là 40 chu kỳ khuếch đại (95ºC trong 10 giây, 60ºC trong 45 giây và 72ºC trong 30 giây). Các khuếch đại được thực hiện trong một đĩa 96 giếng, và mỗi mẫu có ba lần lặp lại kỹ thuật. Ba lần thử nghiệm sinh học đã được lặp lại.

2.5 Biểu hiện gen và hoạt động của các enzym chống oxy hóa

Tổng số RNA được chiết xuất từ gan tụy của 30 con tôm được chọn lọc bằng thuốc thử RNAiso™Plus (Takara, Nhật Bản) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chất lượng RNA được đánh giá bằng điện di trên gel agarose 1,0% và nồng độ RNA được xác định bằng độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm trên máy đo quang phổ. Tổng số RNA đã được phiên mã ngược thành cDNA bằng Bộ thuốc thử PrimeScript™ RT (Takara, Nhật Bản). Các gen miễn dịch khác nhau (protein peritrophin-44 (P44L), lysozyme, cathepsin C (CatC)) và các gen liên quan đến tăng trưởng (axit farnesoic O-methyltransferase (FaMeT), protein điều hòa ecdysteroid (ERP) và carboxylesterase 1 (JHEC1)) đã được thử nghiệm với PCR thời gian thực định lượng (qPCR) bằng mồi cụ thể tương ứng của chúng (Bảng 1). Sau đó, một đường cong nóng chảy của amplicon đã được kiểm tra để xác định độ đặc hiệu của bộ khuếch đại. Gen rRNA 18S được sử dụng như một gen tham chiếu nội bộ tế bào. Mức độ phiên mã tương đối của các gen khác nhau được tính theo phương pháp 2- ΔΔCT (Livak và Schmittgen, 2001).

Đối với xét nghiệm enzym chống oxy hóa, protein được định lượng theo phương pháp Coomassie Brilliant Blue được đo bằng kit định lượng protein tổng thể (Giang Thành, Trung Quốc). Hoạt động của enzym gan tụy superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT) được đo lần lượt ở bước sóng 450 nm và 405 nm, bằng thiết bị đọc xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme tự động (ELISA) (Synergy H1M, BioTek, Hoa Kỳ) và kit xét nghiệm phát hiện enzyme chống oxy hóa (SOD và CAT) (Giang Thành, Trung Quốc). Một đơn vị hoạt tính SOD được định nghĩa là lượng dịch chiết xuất mô ức chế 50% tốc độ giảm xanthine ở nhiệt độ 25ºC, và một đơn vị hoạt tính CAT được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác sự phân hủy 1,0 μmol  H2O2  mỗi phút. Hàm lượng malonaldehyde (MDA) trong gan tụy được xác định bằng máy đọc ELISA tự động (Synergy H1M, BioTek, Hoa Kỳ) ở bước sóng 532 nm với kit phát hiện MDA (Giang Thành, Trung Quốc).

Bảng 1:

Các mồi được sử dụng cho xét nghiệm PCR và PCR thời gian thực trong thí nghiệm.

2.6 Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu thu được được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD và sự khác biệt giữa các nhóm đối chứng và nhóm điều trị được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai một chiều (ANOVA) kết hợp với kiểm định Duncan với chương trình phân tích thống kê SPSS phiên bản 13.0 (SPSS Inc., Hoa Kỳ). Giá trị p <0,05 được coi là dấu hiệu thống kê và giá trị p <0,01 được coi là có ý nghĩa quan trọng.

3/ Kết quả

3.1 Phát hiện tôm nhiễm EHP

Trong một ao nuôi tôm thương phẩm ở Rudong, thành phố Nam Thông, tỉnh Giang Tô, Trung Quốc, tôm được phát hiện có tốc độ tăng trưởng còi cọc mà không làm tăng tỷ lệ chết rõ rệt và tôm chỉ to bằng 1/3 so với tôm bình thường cùng độ tuổi. Tôm trong ao này được cho là đã bị nhiễm EHP. Các mồi EHP-510-F và EHP-510-R từ bộ gen EHP được chọn để thực hiện xét nghiệm PCR bằng cách sử dụng DNA được tách chiết từ tôm còi cọc (Tang và cộng sự, 2015). Như thể hiện trong Hình 1, kết quả PCR cho thấy một dải rõ ràng ở kích thước dự kiến là 510 bp. Do đó, kết quả PCR cho thấy tôm chậm tăng trưởng hơn trong các ao bị nhiễm EHP.

Hình 1. Xét nghiệm PCR để phát hiện EHP ở tôm thẻ P. vannamei phát triển còi cọc. Sản phẩm sau khuếch đại PCR (chính xác là 510 bp) thu được bằng cách sử dụng mồi đặc hiệu EHP. 1–20, mẫu dương tính; NTC: kiểm soát không theo mẫu.

3.2 Năng suất tăng trưởng của tôm

Để chứng minh ảnh hưởng của LNA đối với năng suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng, chiều dài và trọng lượng cơ thể đã được kiểm tra sau khi thử nghiệm cho ăn. Như trong Hình 2A, chiều dài cơ thể trung bình của tôm lần lượt là 9,8, 10,1, 10,8 và 9,9 cm ở các nhóm 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg. So với nhóm đối chứng (khẩu phần ăn 0 g/kg), chiều dài cơ thể của tôm tăng lên đáng kể ở nhóm ăn 2,4 g/kg (p < 0,001), và không có sự thay đổi đáng kể nào ở nhóm đối chứng có khẩu phần ăn 1,2 và 4,8 g/kg. Trọng lượng tôm trung bình lần lượt là 6,4, 7,0, 9,0 và 6,0 g ở các nhóm 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg (Hình 2B). Phù hợp với chiều dài cơ thể, trọng lượng tôm tăng rõ rệt trong nhóm khẩu phần ăn 2,4 g/kg so với nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy rằng việc bổ sung 2,4 g LNA/kg vào khẩu phần ăn đã cải thiện năng suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng.

 

Hình 2. Ảnh hưởng của LNA đến năng suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng. Chiều dài cơ thể (A) và trọng lượng cơ thể (B) đã được kiểm tra sau khi thử nghiệm sinh học cho ăn. ***p< 0,001

3.3 Số lượng vi bào tử trùng EHP ở tôm

Để làm sáng tỏ thêm ảnh hưởng của LNA đối với các vi bào tử trùng EHP ở tôm, phương pháp PCR thời gian thực tuyệt đối đã được thực hiện trên gan tụy từ các nhóm cho ăn khác nhau lần lượt là 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg. Kết quả PCR theo thời gian thực tuyệt đối cho thấy số lượng vi bào tử trùng EHP ở tôm lần lượt là 32.977/ng, 4932/ng, 2137/ng và 8295/ng DNA ở các nhóm 0, 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg (Hình 3). Kết quả cho thấy việc bổ sung LNA ở các nồng độ khác nhau có thể làm giảm đáng kể số lượng vi bào tử trùng của EHP trong tôm thẻ chân trắng P. vannamei (p < 0,001). Trong số đó, thêm 2,4 g LNA/kg vào khẩu phần ăn là nồng độ tốt nhất để ức chế sự nhân lên của vi bào tử trùng EHP.

Hình 3. PCR thời gian thực tuyệt đối để phát hiện EHP sau khi cho ăn với nồng độ LNA khác nhau ở tôm nhiễm EHP. p < 0,001.

3.4 Biểu hiện gen liên quan đến tăng trưởng và miễn dịch

Mức độ phiên mã mRNA của 6 gen được đo bằng xét nghệm qPCR, bao gồm 3 gen liên quan đến tăng trưởng (FaMeT, ERP và JHEC1) và 3 gen miễn dịch (P44L, lysozyme, CatC). Kết quả qPCR cho thấy mức độ phong phú về số lượng của enzym FaMeT và chỉ số ERP giảm ở nhóm 2,4 g / kg so với nhóm đối chứng (Hình 4A và B). Trong khi đó, mức độ biểu hiện của JHEC1 trong nhóm khẩu phần ăn 2,4 g / kg đã tăng lên đáng kể (Hình 4C). Như trong Hình 5, mức phiên mã của P44L, lysozyme và CatC đã được điều chỉnh đáng kể sau khi được cho ăn với các nồng độ LNA khác nhau. Những kết quả này chỉ ra rằng việc bổ sung LNA có thể cải thiện sự tăng trưởng và khả năng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng.

Hình 4. Mức độ biểu hiện của FaMeT (A), ERP (B) và JHEC1 (C) sau khi được cho ăn với nồng độ LNA khác nhau trong tôm thẻ chân trắng P. vannamei bị nhiễm EHP. Gen rRNA 18S được sử dụng làm gen tham chiếu. Các thanh dọc đại diện cho ± trung bình S.E. Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa việc bổ sung nhóm LNA so với nhóm đối chứng (chế độ ăn 0 g / kg). * p < 0,05, *** p < 0,001.

Hình 5. Mức phiên mã của P44L (A), lysozyme (B) và CatC (C) sau khi được cho ăn với nồng độ LNA khác nhau ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei bị nhiễm EHP. Gen rRNA 18S được sử dụng làm gen tham chiếu. Các thanh dọc đại diện cho ± trung bình S.E. Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa việc bổ sung nhóm LNA so với nhóm đối chứng (chế độ ăn 0 g / kg). ** p < 0,01, *** p < 0,001.

3.5 Hoạt động của các enzym chống oxy hóa

Theo kết quả trong Hình 6A-C, 30 ngày sau khi tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung LNA, hoạt tính Cu/Zn-SOD, Mn-SOD và CAT tăng đáng kể ở nhóm 1,2, 2,4 và 4,8 g/kg so với nhóm đối chứng (khẩu phần ăn 0 g/kg). Trong khi đó, Hình 6D cho thấy các thông số thiệt hại do oxy hóa, chẳng hạn như hàm lượng MDA thấp hơn đáng kể trong nhóm khẩu phần ăn 2,4 g / kg so với nhóm đối chứng (khẩu phần ăn 0 g / kg). Kết quả cho thấy việc bổ sung LNA trong khẩu phần ăn làm tăng đáng kể hoạt động của các enzym chống oxy hóa và giảm tác hại của quá trình oxy hóa ở nồng độ thích hợp.

Hình 6. Ảnh hưởng của các nồng độ LNA khác nhau đến các hoạt động của enzym trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Hoạt động A, Cu/Zn-SOD; B, Mn-SOD; C, CAT và hoạt động D, MDA.

4/ Kết luận

Bệnh HPM do EHP gây ra là một loại bệnh rất nghiêm trọng, đã gây ra thiệt hại lớn trong nghề nuôi tôm thẻ chân trắng. Cho đến nay, cơ chế gây bệnh của EHP đã được khám phá toàn diện thông qua phương pháp nghiên cứu proteomics và công nghệ chuyển hóa metabolomic tiên tiến. Dữ liệu trước đây cho thấy LNA (một chất chuyển hóa phân tử nhỏ) đã giảm đáng kể ở tôm sau khi nhiễm EHP (Ning và cộng sự, 2019). LNA đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy tôm phát triển, tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh và khả năng hoạt động chống oxy hóa (Wu và Chen, 2012; Chen và cộng sự, 2014). Vì vậy, trong nghiên cứu này, LNA được nghiên cứu như một chất phụ gia thức ăn nuôi tôm và tác dụng của nó trong việc làm giảm các triệu chứng HPM do EHP gây ra.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung LNA trong khẩu phần ăn đầy đủ giúp cải thiện đáng kể năng suất tăng trưởng của cá, nhưng việc bổ sung LNA quá nhiều có thể gây ra tác dụng phụ, có thể là do stress oxy hóa (Ji và cộng sự, 2011; Chen và cộng sự, 2016). Trong nghiên cứu này, chiều dài và trọng lượng của tôm tăng đáng kể ở nhóm khẩu phần ăn 2,4 g/kg so với nhóm đối chứng (khẩu phần ăn 0 g/kg), trong khi hai nhóm còn lại (khẩu phần ăn 1,2 và 4,8 g/kg) cũng tăng nhưng không đáng kể. Một khuynh hướng tương tự cũng xuất hiện ở tôm càng sông Macrobrachium nipponense, với sự gia tăng hàm lượng LNA trong khẩu phần ăn, tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ tăng trọng của tôm đã tăng lên và sau đó giảm xuống (Luo và cộng sự, 2017). Ngoài PUFA, các axit béo chuỗi ngắn như butyrate và polyhydroxybutyrate (PHB) cũng có thể làm tăng khả năng tăng trưởng của các loài thủy sản. Một số bài báo đã cho thấy axit butyrate làm tăng trọng lượng và hiệu suất ở cá (De Wet và Viljoen, 2012; Zheng, 2009), thúc đẩy sức khỏe đường ruột, cải thiện một số axit amin thiết yếu sẵn có và các dẫn xuất nucleotide (Robles và cộng sự, 2013), để tăng cường sự hấp thụ hợp chất carotenoids (Chow và cộng sự, 2017). Một nghiên cứu của Situmorang và cộng sự (2016) cho thấy sự tăng trọng của ấu trùng cá rô phi sông Nile đã tăng lên rõ rệt sau 28 ngày cho ăn với hợp chất poly hydroxybutyric (PHB). Khả năng tăng trưởng cũng đã được báo cáo ở tôm thẻ P. vannamei khi được bổ sung 1% PHB đã được hòa tan (Kiran và cộng sự, 2019). Những kết quả này cho thấy LNA (nồng độ tối ưu là khẩu phần ăn 2,4 g LNA/kg) tương tự như các axit béo chuỗi ngắn để cải thiện năng suất tăng trưởng của tôm nhiễm EHP.

 Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy rằng việc bổ sung các nồng độ LNA khác nhau có thể làm giảm đáng kể các vi bào tử trùng EHP trong tôm thẻ chân trắng, đặc biệt, bổ sung 2,4 g LNA/kg vào khẩu phần ăn là nồng độ tốt nhất để ức chế sự gia tăng sinh trưởng của EHP. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng EHP có thể ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các protein tăng trưởng ở tôm như FAMeT, ERP và JHEC1,và nó có thể ức chế sự tăng trưởng của tôm (Ning và cộng sự, 2019). FAMeT, một loại enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp sinh học hormone điều tiết sự lột xác, tham gia vào bước cuối cùng của quá trình tổng hợp methyl farnesoate (MF), chuyển hóa axit farnesoic (FA) thành MF (Duan và cộng sự, 2014). Kết quả cho thấy FAMeT bị giảm mạnh trong nhóm khẩu phần ăn 2,4 g LNA/kg và quá trình tổng hợp MF bị chậm lại ở tôm nhiễm EHP. Bên cạnh đó, JHEC1, một carboxylesterase đặc biệt, có liên quan đến sự phân hủy của MF (Mackert và cộng sự, 2008; Lee và cộng sự, 2011). Trong nghiên cứu này, JHEC1 đã được điều chỉnh theo nhóm khẩu phần ăn 2,4 g LNA/kg và cho thấy sự thoái hóa nhanh chóng của MF khi tôm nhiễm EHP. Những kết quả này cho thấy thêm rằng FAMeT được điều chỉnh thấp và JHEC1 được điều chỉnh tăng dẫn đến việc giảm hàm lượng MF và do đó nâng cao khả năng tăng trưởng của tôm nhiễm EHP. Hơn nữa, nồng độ ecdysteroid cao có thể thúc đẩy hiệu quả quá trình lột xác ở động vật giáp xác và côn trùng, nhưng thời gian lột xác sẽ bị trì hoãn sau khi nồng độ ecdysteroid giảm (He và cộng sự, 2013). Như chúng ta đã biết, ERP và ecdysteroid có tác dụng điều tiết tiêu cực trong quá trình lột xác. Khi nồng độ ecdysteroid cao, chỉ số ERP bị ức chế và gia tăng khi ecdysteroid bị thiếu hụt (Keller, 1992; Lee và cộng sự, 1995). Kết quả của việc điều chỉnh giảm ERP trong nhóm khẩu phần ăn 2,4g LNA/kg cho thấy rằng việc điều chỉnh tăng ecdysteroid thúc đẩy quá trình lột xác và cải thiện năng suất tăng trưởng của tôm bị nhiễm EHP. Những kết quả này chỉ ra rằng nồng độ LNA thích hợp trong khẩu phần ăn có thể thúc đẩy tăng trưởng thông qua việc điều phối cân bằng hormone tăng trưởng ở tôm nhiễm EHP.

Động vật không xương sống, bao gồm cả tôm, thiếu một hệ thống phản ứng miễn dịch thích nghi thực sự và khả năng miễn dịch bẩm sinh, đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vật chủ chống lại sự xâm nhập của các mầm bệnh (Musthaq và Kwang, 2014). Các protein miễn dịch ở tôm như P44L, lysozyme và CatC đóng vai trò đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đối với EHP (Ning và cộng sự, 2019). Gen peritrophin từ con cà ra (cua long) Eriocheir sinensis được biết là có liên quan đến quá trình kháng thuốc và tiêu diệt V. parahaemolyticus (Huang và cộng sự, 2015). Lysozyme, một chất xúc tác cuối cùng của phản ứng chuỗi miễn dịch không đặc hiệu, có thể chống lại sự lây nhiễm của ký sinh trùng, vi khuẩn và vi rút (Morishima và cộng sự, 1992; Wu và cộng sự, 2016). Protein cathepsin (một protease quan trọng) đã được tìm thấy có liên quan đến khả năng miễn dịch bẩm sinh ở cua trong những năm gần đây (Li và cộng sự, 2010; Li và cộng sự, 2011). Trong nghiên cứu này, sau khi được cho ăn bổ sung LNA, số lượng của P44L, lysozyme và CatC đã được điều chỉnh rõ rệt, cũng như số lượng vi bào tử trùng EHP đã giảm đáng kể. Điều này cho thấy nồng độ LNA thích hợp có thể tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh để chống lại sự lây nhiễm EHP ở tôm. Mặt khác, sự cân bằng giữa việc sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và khả năng chống oxy hóa đóng một vai trò quan trọng đối với sức khỏe của cơ thể, và sự chênh lệch của nó góp phần gây ra nhiều bệnh. Chất chống oxy hóa có thể bảo vệ các mô khỏi tổn thương oxy hóa do dư thừa gốc tự do ROS. Hàm lượng PUFA cao có thể kích hoạt các enzym chống oxy hóa (Cowey và cộng sự, 1983; Roem và cộng sự, 1990). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hoạt động SOD của cá Pelteobagrus vachelli (lai giữa cá bò và cá mầm) được tăng cường đáng kể khi cho ăn theo khẩu phần ăn giàu LNA (Li và cộng sự, 2016). Trong nghiên cứu này, hoạt động của SOD và CAT ở tôm nhiễm EHP đã tăng lên đáng kể khi bổ sung LNA vào khẩu phần ăn. MDA phản ánh trực tiếp mức độ peroxy hóa lipid, hàm lượng MDA cao hơn dẫn đến độc tính tế bào cao hơn, đẩy nhanh quá trình phá hủy của tế bào và mô (Buege và Aust, 1978). Hàm lượng MDA trong nhóm khẩu phần ăn 2,4g/kg thấp hơn nhóm đối chứng. Kết quả cho thấy LNA thích hợp có thể kích hoạt các enzym chống oxy hóa và đẩy nhanh quá trình thoái hóa MDA, cho thấy nó có thể cải thiện khả năng chống oxy hóa và giảm thiệt hại các tế bào và mô ở tôm nhiễm EHP.

Tóm lại, hàm lượng LNA thích hợp trong khẩu phần ăn có thể nâng cao khả năng tăng trưởng của tôm nhiễm EHP và tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh và khả năng chống oxy hóa. Hàm lượng LNA tối ưu đối với tôm nhiễm EHP là khẩu phần ăn 2,4 g/kg theo công thức và điều kiện thử nghiệm. Thử nghiệm này không chỉ cung cấp một chất điều hòa chuyển hóa tiềm năng để điều trị HPM ở tôm thẻ chân trắng, mà còn mở rộng phạm vi nghiên cứu kiểm soát các bệnh truyền nhiễm.

Nhóm tác giả: Mingxiao Ning, Jingxiu Bi, Wei Sun, Xiaojun Xie, Yanlan Huang, Wei Gu, Wen Wang, Yi Qiao, Ge Jiang, Hui Shen, Qingguo Meng

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

Từ khóa: Penaeus vannamei, Enterocytozoon hepatopenaei, axit Linolenic, chất điều hòa chuyển hóa.

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

• Liệu Những Đột Phá Về Gen Có Thổi Luồng Sinh Khí Mới Vào Nghề Nuôi Sú Và Tôm Càng Xanh Hay Không?
• Nhu Cầu Astaxanthin Tự Nhiên Trong Thức Ăn Thủy Sản Ngày Càng Tăng
• Phụ Phẩm Tái Chế Từ Thức Ăn Chăn Nuôi Có Tiềm Năng Dinh Dưỡng Trong Nuôi Trồng Thủy Sản