Phần 1: Silkrose Của Bombyx mori Ngăn Ngừa Hiệu Quả Bệnh Vibrio Ở Tôm He Thông Qua Việc Kích Hoạt Khả Năng Miễn Dịch Bẩm Sinh

Tóm tắt

Trước đây chúng tôi đã xác định các polysacarit hoạt tính sinh học mới từ Bactrocera cucurbitae và Antheraea yamamai kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh trong các đại thực bào RAW264 ở chuột. Tuy nhiên, xét về tiềm năng ứng dụng trong nuôi tôm, đã có những vấn đề liên quan đến sự sẵn có trong loài côn trùng này. Tuy nhiên, hiện tại chúng tôi đã xác định được một loại polysacarit từ Bombyx mori kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh trong tế bào RAW264 và tôm He. Polysacarit tinh khiết này, được gọi là silkrose của B. mori (silkrose-BM), có trọng lượng phân tử là 1.150.000 và tạo ra một đỉnh đối xứng duy nhất trên HPLC. 8 trong số chín monosacarit cấu thành của silkrose-BM đồng thời với dipterose của B. cucurbitae (dipterose-BC) và silkrose của A. yamamai (silkrose-AY). Sự khác biệt chính được tìm thấy trong tỷ lệ mol của các monosacarit. Silkrose-BM có hiệu lực thấp hơn khoảng 500 lần so với silkrose-AY (lần lượt là EC ₅₀ : 2,5 và 0,0043 μg/mL) trong thử nghiệm sản xuất nitrit oxit (NO) sử dụng tế bào RAW264. Tuy nhiên, sản lượng NO tối đa đối với silkrose-BM và AY tương đương và cao hơn so với lipopolysacarit của Escherichia coli. Tỷ lệ sống của tôm He (Litopenaeus vannamei và Marsupenaeus japonicus) sau khi nhiễm Vibrio penaecida đã được cải thiện đáng kể bằng cả khẩu phần ăn Silkrose-BM và nhộng B. mori. Điều này cho thấy rằng silkrose ngăn ngừa hiệu quả bệnh vibrio ở tôm He thông qua việc kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh.

1. Giới thiệu

Côn trùng vẫn là một nguồn tài nguyên thiên nhiên có tiềm năng lớn. Tuy nhiên, phần lớn chúng lại chưa được sử dụng. Chúng là nguồn cung cấp các hoạt chất sinh học khả thi và hấp dẫn. Chúng cũng là nguồn thực phẩm bền vững cho con người cũng như thức ăn cho động vật trên cạn và dưới nước. Gần đây, chúng tôi đã xác định được các polysaccharid có hoạt tính sinh học mới từ nhộng của ruồi dưa (Bactrocera cucurbitae) và sâu tơ sồi Nhật Bản (Antheraea yamamai). Các polysacarit có tính axit này, được gọi là dipterose và silkrose, bao gồm chín monosacarit và kích hoạt sản xuất oxit nitric (NO) và biểu hiện của các cytokine tiền viêm và interferon β thông qua con đường thụ thể toll-4 (TLR4)/yếu tố hạt nhân-κB (NF-κB) trong đại thực bào chuột RAW264.

Tôm là một trong những sản phẩm thủy sản được giao dịch nhiều nhất xét về giá trị thương mại. Nuôi tôm là một ngành nuôi trồng thủy sản đang phát triển nhanh chóng với sản lượng toàn cầu đạt 7.351.350 tấn vào năm 2015. Tuy nhiên, sản lượng tôm và biến động giá có liên quan đến sự bùng phát của các bệnh vi sinh vật. Vibrio là một trong những bệnh phổ biến nhất trên toàn thế giới ở động vật có vỏ và cá có vây. Chi Vibrio bao gồm các vi khuẩn hình que cong gram âm tạo thành hệ vi khuẩn bình thường trong môi trường nước như vùng nước ven biển và cửa sông. Độc lực Vibrio spp. đã gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng bằng cách gây ra chết hàng loạt ở họ tôm He bao gồm cả tôm sú (Penaeus monodon), tôm sú Nhật Bản (Marsupenaeus japonicus) và tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Đáng chú ý, Vibrio parahaemolyticus là tác nhân gây bệnh bùng phát gần đây- bệnh tôm chết sớm/hoại tử gan tụy cấp (EMS/AHPND) trên tôm He nuôi đầu tiên ở Trung Quốc (2009), sau đó là ở Việt Nam (2010), Malaysia (2011), Thái Lan (2012) và Mexico (2013). Tại Nhật Bản, bệnh vibriosis phổ biến từ cuối những năm 1980 đến đầu những năm 1990 khi nuôi thâm canh M. japonicus. Bất chấp những nỗ lực cải thiện hệ thống nuôi và kiểm soát dịch bệnh, bệnh vibrio vẫn đang diễn ra ở Nhật Bản vào thời điểm hiện tại và các phương pháp phòng ngừa hiệu quả vẫn còn hạn chế. Các kỹ thuật tiêm phòng truyền thống được sử dụng ở động vật có xương sống không được áp dụng cho các loài giáp xác do chúng thiếu tế bào lympho B và T. Tuy nhiên, sự tồn tại của bộ nhớ miễn dịch đặc hiệu (còn được gọi là mồi miễn dịch cụ thể) trong các tế bào miễn dịch bẩm sinh như tế bào máu gần đây đã được đề xuất ở Động vật chân đốt. Ngoài ra, việc tiêm vắc-xin bằng vi-rút gây hội chứng đốm trắng bất hoạt bằng formalin (WSSV) hoặc vỏ bọc của nó (rVP26, rVP28) đã được báo cáo là cải thiện tỷ lệ sống của tôm He. Trong trường hợp này, các chất có hoạt tính sinh học như silkrose và dipterose có thể kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh của động vật có vỏ sẽ được dự đoán là có hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại bệnh vibriosis.

Tuy nhiên, giả sử rằng chúng có thể được áp dụng thực tế trong nuôi trồng thủy sản, B. cucurbitae và A. yamamai  gặp vấn đề về tính sẵn có. B. cucurbitae gây hại cho cây trồng nông nghiệp và đã được loại bỏ khỏi các đảo phía tây nam của Nhật Bản bằng cách sử dụng kỹ thuật côn trùng vô trùng. Tơ A. yamamai là một ngành công nghiệp địa phương và truyền thống ở Nhật Bản nhưng sản lượng của nó rất hạn chế. Tuy nhiên, Bombyx mori là một loài bướm tằm thuần hóa được phân loại theo phân loại là thành viên của siêu họ Bombycoidea, cũng như A. yamamai, và được nuôi trên toàn thế giới để lấy tơ từ kén của nó. Sản lượng tơ toàn cầu tiếp tục tăng và đạt 192.692 tấn vào năm 2016. Điều này thúc đẩy chúng tôi khám phá tiềm năng của nhộng B. mori trong việc phòng chống dịch bệnh trong nuôi tôm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả một loại polysacarit hoạt tính sinh học mới của nhộng B. mori có thể bảo vệ tôm He khỏi bệnh vibrio.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tinh chế các polysacarit hoạt tính sinh học

Các polysacarit hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ côn trùng đã được tinh chế như mô tả trước đây. Nhìn chung, polysacarit thô thu được từ nhộng B. mori dạng bột khô bằng cách chiết xuất nước và kết tủa ethanol được phân đoạn và tinh chế bằng phương pháp lọc gel và sắc ký trao đổi anion trên hệ thống sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC). Cột HiPrep 26/60 Sephacryl S-500HR (GE Healthcare, Chicago, IL) và cột HiPrep DAEA FF 16/10 (GE Healthcare) lần lượt được sử dụng để lọc gel và sắc ký trao đổi anion. Các polysacarit hoạt tính sinh học được làm giàu bằng kết tủa etanol sau khi thu thập các phần dương trong thử nghiệm sản xuất NO. Nồng độ polysacarit tinh khiết được xác định bằng phương pháp axit phenol-sulfuric với tiêu chuẩn D-glucose được sử dụng để xác định tổng lượng đường.

2.2. Xác định trọng lượng phân tử của polysacarit hoạt tính sinh học

Trọng lượng phân tử của các polysacarit tinh khiết được xác định bằng sắc ký lọc gel sử dụng hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) như đã mô tả trước đây. Tóm lại, 1 mg/mL polysacarit tinh khiết được hòa tan trong dung dịch đệm phốt phát 0,2 M (pH 7,5) được áp dụng cho cột sắc ký loại trừ kích thước Showdex SB-807 HQ (Showa Denko KK, Tokyo, Nhật Bản) sau khi lọc bằng bộ lọc 0,22-μm. Cột được duy trì ở 35°C. Các mẫu ứng dụng được rửa giải bằng dung dịch đệm phốt phát 0,2 M (pH 7,5) ở tốc độ dòng 0,5 mL/phút và được phát hiện bằng máy dò chỉ số khúc xạ. Hiệu chuẩn sơ bộ cột được tiến hành bằng cách sử dụng các pullulan có trọng lượng phân tử khác nhau (pullulan P-5, P-10, P-20, P-50, P-100, P-200, P-400, P-800 và P-2500). Trọng lượng phân tử được tính từ đường chuẩn pullulan.

2.3. Xác định thành phần monosacarit

Việc xác định thành phần monosacarit của polysacarit kích thích miễn dịch đã được thực hiện như mô tả trước đây. Tóm lại, polysacarit đã phân lập (100 μg) được thủy phân bằng axit trifluoroacetic 2 M ở 100°C trong 16 giờ. Các sản phẩm thủy phân sau đó được làm bay hơi bằng dòng N₂ và được chuyển đổi thành alditol axetat bằng cách khử NaBH₄ liên tiếp và acetyl hóa với Ac₂O-pyridin (1:1, v/v) theo phương pháp được mô tả bởi Sassaki và cộng sự. Phân tích GC-MS được thực hiện trên hệ thống sắc ký khí được trang bị cột mao quản HP-5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) được kết nối với máy quang phổ khối. Helium được sử dụng làm khí mang.

2.4. Thử nghiệm sản xuất NO

Các đại thực bào RAW264 ở chuột đã được sử dụng trong thử nghiệm sản xuất NO và được lấy từ Ngân hàng tế bào (Trung tâm tài nguyên sinh học Riken, Tsukuba, Nhật Bản) và được nuôi cấy trong môi trường thiết yếu tối thiểu (MEM) được bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò, 0,1 mM axit amin không thiết yếu, penicillin 100 U/mL và streptomycin 100 μg/mL. Các tế bào được giữ ở 37°C trong môi trường ẩm 5% CO₂. Trong thử nghiệm, 10⁵ tế bào được cấy trong mỗi giếng của đĩa 96 giếng và nuôi cấy trong 2,5–3 giờ. Một loạt pha loãng chiết xuất nhộng hoặc polysacarit tinh khiết đã được áp dụng cho các giếng sau đó được nuôi cấy trong 24 giờ ở 37°C. Nồng độ nitrit trong phần nổi phía trên của môi trường nuôi cấy được đo bằng bộ thuốc thử Griess (Promega, Madison, WI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.5. Chuẩn bị viên khô

Các thành phần của khẩu phần ăn cơ sở cho L. vannamei và M. japonicus được liệt kê trong Bảng  S3 và S4. Nguyên liệu khô được trộn đều, bổ sung dầu cá, cuối cùng trộn với nước trước khi tạo viên bằng máy làm mì HR2365/1 (Philips, Hà Lan). Các thành phần được trộn đều một lần nữa khi thêm dầu và nước. Sau khi tạo hạt, các viên được sấy khô hoàn toàn trong không khí ở 60°C trong 1–3 ngày. (Lưu ý: các viên M. japonicus được hấp trong 10 phút trước khi sấy khô trong không khí để thúc đẩy quá trình biến tính của bột mì và gluten và do đó ngăn không cho các viên này hòa tan trong nước khi cho ăn.) Silkrose tinh khiết hoặc nhộng B. mori đã khử chất béo và ở dạng bột được lơ lửng trong nước, sau đó trộn với các thành phần khác.

Thành phần của silkrose-BM trong khẩu phần thí nghiệm lần lượt là 0, 0,0125, 0,25 và 5 μg/g. Nhộng B. mori dạng bột được trộn vào các khẩu phần ăn cơ sở ở các mức hàm lượng ước tính là 0,874, 8,74 và 87,4 μg/g silkrose-BM trong các nhóm khẩu phần ăn nhộng B. mori 0,001%, 0,01% và 0,1%. Không có thành phần nào được thay thế khi thêm silkrose hoặc nhộng B. mori tinh khiết, vì lượng bổ sung rất nhỏ (bằng hoặc ít hơn 5 μg/g hoặc 0,1%) và ảnh hưởng dinh dưỡng của silkrose hoặc nhộng B. mori được coi là không đáng kể.

2.6. Nghiên cứu cảm nhiễm

L. vannamei được Trung tâm Công nghệ sinh học biển Oita của Nissui (Oita, Nhật Bản) hảo tâm trao tặng. M. japonicus là quà tặng từ Công ty TNHH Higashimaru (Kagoshima, Nhật Bản) và Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản tại Viện Nghiên cứu Nông, Lâm nghiệp và Thủy sản tỉnh Ehime (Uwajima, Nhật Bản).

Tôm được nuôi bằng khẩu phần thí nghiệm (5% trọng lượng cơ thể/ngày) trong 1 tháng (L. vannamei) hoặc 2 tuần (M. japonicus) được sử dụng trong nghiên cứu cảm nhiễm. Trong giai đoạn trước cảm nhiễm, tôm được nuôi trong bể tròn 250 L. Một bể duy nhất được phân bổ cho mỗi nhóm nghiên cứu. Số lượng tôm đã đăng ký được chỉ định trong Bảng  S1 và S2. Nước biển lọc cát tự nhiên được cung cấp bởi một hệ thống chảy qua. Đối với nuôi tôm thẻ chân trắng L. vannamei, nước được cấp từ phía trên bể và thoát nước từ đáy bể. Đối với nuôi M. japonicus, đáy bể có lót cát nền và nước được cấp từ đáy bể. Nhiệt độ nước được giữ ở 28°C (L. vannamei) hoặc 18–22°C (M. japonicus).

Chủng vi khuẩn cảm nhiễm (Vibrio penaecida IAYKG13–1) đã được mô tả trước đây. Để chuẩn bị cảm nhiễm, nguồn vi khuẩn được tiêm vô trùng vào nước dùng và nuôi cấy trong 2 ngày ở 28°C với sự khuấy trộn mạnh mẽ. Đối với nhiễm L. vannamei, 16 mL huyền dịch vi khuẩn được thêm vào 2 L nước biển nhân tạo 50% trong đó tôm được ngâm trong 1 giờ ở 28°C. Sau khi nhiễm bệnh, tôm được nuôi trong 50% nước biển nhân tạo ở 28°C trong các bể 10L trùng lặp được trang bị hệ thống lọc không khí dưới nước. Đối với M. japonicus, 40 mL huyền phù vi khuẩn được thêm vào 5 L nước biển trong đó tôm được ngâm trong 1 giờ và sau đó được nuôi trong các bể 45 L trùng lặp có hệ thống lọc đáy. Nhiệt độ nước được duy trì ở mức 18–22 °C trong suốt quá trình nghiên cứu đối với M. japonicus.

Số lượng vi khuẩn trong các chất cảm nhiễm được đếm bằng cách cấy trên môi trường thạch nước biển. Khẩu phần ăn thử nghiệm (3–5% đối với trọng lượng cơ thể/ngày) được sử dụng trong giai đoạn sau cảm nhiễm. Các giai đoạn cảm nhiễm kết thúc sau 2–5 ngày sau khi tôm đối chứng ngừng chết.

2.7. Phân tích dữ liệu

Các đường cong hồi quy thu được từ các phép đo trùng lặp sản xuất NO đối với chiết xuất nhộng và polysacarit tinh khiết bằng cách sử dụng đường cong phù hợp với công thức sau trên phần mềm ImageJ:

y = d +(a − d)/(1+(x / c)^b)

Trong đó: x là độ pha loãng của dịch chiết nhộng (pha loãng log₁₀) hoặc nồng độ của silkrose-BM (log₁₀  μg/mL) và y là nồng độ của NO (μmol/L).

Hàm lượng tơ tằm-BM trong nhộng được ước tính như sau:

Silkrose − BM contentin nhộng (mg/g) =EC₅₀ của chiết xuất nhộng (pha loãng lần (mL/g))×EC₅₀ của Silkrose−BM(mg/mL)/1000

Trong nghiên cứu cảm nhiễm, phương pháp Kaplan-Meier và kiểm tra thứ hạng log với hiệu chỉnh Bonferroni đã được sử dụng để phân tích các đường cong sinh tồn (p  < 0,05). Thử nghiệm Jonckheere-Terpstra (hai đầu, p  < 0,05) và thử nghiệm so sánh nhiều lần Steel Dwass (p  < 0,05) như một bài kiểm tra post hoc được sử dụng để phân tích trọng lượng cơ thể của tôm.

3. Kết quả

3.1. Phân lập polysaccharid có hoạt tính sinh học từ nhộng Bombyx mori

Để xác nhận tiềm năng của nhộng B. mori trong việc kích hoạt miễn dịch bẩm sinh, trước tiên chúng tôi đã kiểm tra mức độ hoạt động sản xuất NO trong các đại thực bào RAW264 ở chuột sau khi bổ sung chiết xuất thô từ nhộng khô. Phản ứng liều lượng của nhộng B. mori theo cách tương tự như của A. yamamai (Hình 1). Nồng độ hiệu quả 50% (EC₅₀) của nhộng B. mori và nhộng A. yamamai lần lượt là độ pha loãng 34,966 và 191,474 lần.

Hình 1. Hoạt động sản xuất NO được kích thích bằng cách bổ sung nhộng B. mori (hình tròn) và A. yamamai (hình tam giác) vào môi trường nuôi cấy tế bào RAW264.

Sau khi thu được các polysacarit thô của nhộng B. mori bằng cách chiết xuất nước và kết tủa ethanol, các phần dương trong xét nghiệm sản xuất NO được thu thập sau khi lọc gel và sắc ký trao đổi anion trên hệ thống sắc ký lỏng protein nhanh (FPLC). Polysacarit hòa tan trong nước tinh khiết của B. mori được phát hiện là một phân tử đồng nhất xuất hiện dưới dạng một đỉnh đối xứng duy nhất trên HPLC được trang bị cột lọc gel dành riêng cho kích thước (Hình 2). Trọng lượng phân tử của polysacarit tinh khiết là 1.150.000 được xác định bằng HPLC bằng cách sử dụng các pullulan có trọng lượng phân tử khác nhau (Bảng 1). 9 monosacarit đã được xác định trong polysacarit tinh khiết của B. mori bằng GC-MS (Hình 3) và tỷ lệ mol của chúng được chỉ ra trong Bảng 2. Tám trong số các monosacarit này được tìm thấy là phổ biến với các loại trong số các polysacarit có hoạt tính sinh học của A. yamamai và B. cucurbitae, nhưng khác nhau về tỷ lệ mol. Chúng tôi gọi loại polysacarit mới được xác định này là silkrose của B. mori ‘ (silkrose-BM) sau khi chúng tôi phát hiện ra silkrose từ nhộng A. yamamai trước đây.

Theo Muhammad Fariz Zahir Ali, Indri Afrani Yasin, Takashi Ohta, Atsushi Hashizume, Ido Atsushi, Takayuki Takahashi, Chiemi Miura & Takeshi Miura

Nguồn: https://www.nature.com/articles/s41598-018-27241-3

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

• Phần 1: Việc Mất Cân Bằng Môi Trường Ao Nuôi Và Cân Bằng Nội Môi Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột Có Liên Quan Đến Sự Bùng Phát Bệnh Mờ Đục (TDP) Trên Hậu Ấu Trùng Tôm Thẻ Chân Trắng
• Phần 2: Việc Mất Cân Bằng Môi Trường Ao Nuôi Và Cân Bằng Nội Môi Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột Có Liên Quan Đến Sự Bùng Phát Bệnh Mờ Đục (TDP) Trên Hậu Ấu Trùng Tôm Thẻ Chân Trắng
• Các Mô Hình Nuôi Tôm Ở Châu Á Và Mỹ Latinh