Lagenidium thermophilum Được Phân Lập Từ Trứng Và Ấu Trùng Của Tôm Sú Tại Thái Lan

Tóm tắt

Một trường hợp nhiễm nấm đã được tìm thấy trên trứng và ấu trùng của Tôm sú Penaeus monodon tại một trại giống ở tỉnh Chachensao, Thái Lan vào tháng 8 năm 2000. Nấm phân lập từ trứng và ấu trùng đã nhiễm nấm được nghiên cứu về các đặc điểm hình thái và sinh học. Khi nó được chuyển từ môi trường nuôi PYGS sang nước biển nhân tạo, sợi nấm phát triển nên các ống “giải phóng” và một bào nang (để hình thành bào tử) ở đầu mỗi ống đó. Tính đặc trưng của sinh sản vô tính ở nấm là bào tử di chuyển được trong nước biển sau khi bào nang tách ra khỏi ống “giải phóng”. Dựa trển các đặc điểm hình thái này, nhóm tác giả đã xác định được đây là loài nấm Lagenidium thermophilum. Một vài đặc điểm hình thái của NJM 0031 được lựa chọn phân lập được so sánh với đặc điểm của các loài khác trong họ Lagenidium phân lập từ một số giáp xác. Kết quả cho thấy, chủng NJM 0031 có những đặc tính tương tự với đặc tính của nhóm L. thermophilum ATCC 200318 phân lập từ loại cua rừng Scylla serrata. Việc phân lập này đã chứng minh tính gây bệnh lên tôm sú được phơi nhiễm nhân tạo. Đây là bài báo cáo đầu tiên của việc lây nhiễm của L.thermophilum trên tôm sú ở Thái Lan.

Ấu trùng tôm sú Penaeus monodon được sản xuất tại nhiều trại giống ở tỉnh Chachensao, Thái Lan. Việc nhiễm nấm thường được tìm thấy trong trứng và ấu trùng. Khi việc lây nhiễm xảy ra ở trại giống, nó được xem như bệnh truyền nhiễm khó giải quyết, vì nó gây ra tỷ lệ chết cao ở ấu trùng. Hiện vẫn chưa có báo cáo khoa học nào về nhiễm nấm ở tôm sú tại Thái Lan. Vào tháng 8 năm 2000, một đợt nhiễm nấm xảy ra ở trứng và ấu trùng của tôm sú P. monodon khi mới nở ở tỉnh Chachensao, Thái Lan. Bài báo này mô tả việc xác định loại nấm gây bệnh được phân lập từ trứng và ấu trùng trên.

Nguyên liệu và phương pháp

Phân lập và nhận diện

Trứng (hình 1) và Zoae (hình 2) của tôm sú P.monodon nhiễm nấm được phân lập trực tiếp từ môi trường PYGS (0.125% peptone, 0.125T chiết xuất men, 0.3% đường glucose, 1.2% thạch agar, và 37.6g đĩa nước biển nhân tạo (Aqua-Ocean, Thuốc thú y Nhật, Tokyo, Nhật Bản), và sau đó được bổ sung thêm streptomycin sulfate và ampicillin vào môi trường để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và được ủ ở 25^oC. Mỗi khuẩn lạc nấm được chuyển sang môi trường PYGS mới để tạo môi trường tinh khiết. Vì tất cả các phân lập được đánh giá là cùng một loại nấm, nên chủng phân lập NJM 0031 được chọn ngẫu nhiên từ tổ hợp phân lập này, và được sử dụng cho những thử nghiệm tiếp theo.

Đối với những quan sát về mặt hình thái, giống phân lập được nuôi trong môi trường PYGS ở 25^oC trong 4 ngày, và một phần sợi nấm trong PYGS được rửa sạch bằng nước biển nhân tạo, sau đó chuyển vào trong nước biển nhân tạo và ủ ở 25^oC trong vòng 36 giờ. Nấm được nhận diện theo phương pháp của Sparrow (1960), Bian và cộng sự (1979), và Karling (1981). Lagenidium Callinectes ATCC 24963, L. Callinectes NJM 8989, L. thermophilum ATCC 200318 và L. myophilum ATCC 66280 – các tác nhân gây bệnh trên giáp xác được sử dụng để làm các phép so sánh trong thử nghiệm sinh học và sinh lý (Bảng 1).

Bảng 1. Nguồn các dòng Lagenidium được sử dụng trong nghiên cứu này.

Loài	Dòng	Địa phương	Vật chủ	Năm
L. thermophilum	NJM 0031	Chachensao, Thái Lan	P. monodon	2000
L. thermophilum	NJM 9338 (ATTCb 200318)	Bali, Indonesia	Scylla serrata	1993
L. Callinectes	ATCC 24973	Bắc Carolina, Mỹ	Callinectes sapidus	1973
L. Callinectes	NJM 8989	Okayama, Nhật Bản	Portunus trituberculatus	1986
L. myophilum	NJM 8601 (ATCC 66280)	Ishikawa, Nhật Bản	Pandalus borealis	1988

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng.

NJM 0031 phân lập, Lagenidium callinectes ATCC 24973, L. callinectes NJM 8989, L. thermophilum ATCC 200318 và L. myophilum ATCC 66280 là cấy trong đĩa thạch PYGS và ủ ở 25^oC trong 10 ngày để tạo thành quần thể khuẩn lạc lớn. Sử dụng mũi khoen lấy số 2 (5.5mm diam) để lấy một khối thạch từ rìa của quần thể đang phát triển và được cấy vào giữa đĩa thạch PYGS. Mỗi đĩa được ủ trong các mức nhiệt độ khác nhau (5,10,15,20,25,30,35,40,45^oC). Kích cỡ khuẩn lạc được đo mỗi 2 ngày một lần trong vòng 10 ngày sau khi nuôi cấy.

Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên tăng trưởng.

Năm chủng phân lập giống nhau được nuôi trong môi trường đĩa PYGS và mỗi phần khuẩn lạc được nuôi cấy vào trước đó lên tâm của đĩa thạch PYG (PYGS không chứa nước biển nhân tạo) chứa nhiều nồng độ NaCl khác nhau (0, 0.5, 1, 2, 3, 5%) và được ủ ở nhiệt độ tối ưu cho mỗi dòng phân lập. Các bán kính khuẩn được đo 2 ngày một lần trong vòng 14 ngày sau khi cấy.

 Thử nghiệm lây nhiễm.

Khả năng gây bệnh của chủng phân lập NJM 0031 lên Zoea và Mysis của tôm sú được đánh giá thông qua sự tiếp xúc với bào tử. Hai mươi ấu trùng được cho vào trong đĩa petri với 30ml nước biển. Số lượng bào tử trong nước biển được điều chỉnh ở mức 1×10⁴, 1×10³, 1×10² bào tử/mL. Trong nhóm đối chứng, đĩa petri với 30ml nước biển chứa duy nhất 20 ấu trùng. Để giảm sự lây nhiễm của vi khuẩn, mỗi 200µg/ml streptomycin sulfate và ampicillin được bổ sung vào nước biển. Mỗi ấu trùng được kiểm tra dưới kính hiển vi mỗi 24h trong vòng 2 ngày sau khi tiếp xúc với bào tử nấm. Mỗi thử nghiệm được thực hiện ở 30^oC và không cho ăn.

Kết quả.

Nhận diện.

Chủng phân lập NJM 0031 có màu trắng, phẳng và dạng sợi trên thạch PYGS, và sợi nấm sinh dưỡng không phân tách với nhiều giọt dầu nguyên sinh chất, phân nhánh không đều và chiều rộng 15–30 mm trong môi trường PYGS (Hình 3). Sự hình thành bào tử đã được quan sát trong khoảng 36 giờ sau khi sợi nấm được chuyển vào nước biển nhân tạo đã tiệt trùng.

 Trong quá trình bào tử hình thành, ống “giải phóng” được phát triển dần dần từ sợi nấm (Hình 4) và các khối nguyên sinh chất với các giọt dầu nhỏ hơn di chuyển vào các bào nang được hình thành ở đầu các ống “giải phóng” (Hình 5). Các ống thẳng, đường kính 7–10µm. Mỗi khối nguyên sinh được kết nối với một “mạch” nguyên sinh chất. Sau khi tất cả các nguyên sinh chất đã được đưa vào bào nang, nó được chia vào các bào tử hoàn toàn trong vòng 15 phút, các bào tử “dạng bơi” đã được quan sát khoảng 25 phút và sự giải phóng bào tử xảy ra vào khoảng 30 phút. Trước khi bào tử giải phóng, các bào nang được tách ra khỏi ống “giải phóng” (Hình 6a – d). Sau bào tử được giải phóng, bào nang sẽ không bền. Các bào nang trưởng thành có hình cầu đến hình cầu phụ, đường kính 30–40 µm. Các bào tử có 2 roi bơi, hình quả lê đến hình khối cầu nhỏ, chỉ có một chu kỳ sinh sản, trung bình 13 x 9 µm (Hình 7). Sau khi bơi trong vài giờ, bào tử được bao lại. Các bào tử được bao bọc là hình cầu không có lông roi, trung bình đường kính 10 µm (Hình 8). Không có cơ quan sinh dục nào được quan sát thấy.

Hình 6. Giải phóng bào tử của L. thermophilum NJM 0031.

• a. bào nang hình thành ở đầu ống giải phóng
• b. sự giải phóng bào tử xảy ra sau khi bào nang được tách ra khỏi ống giải phóng (mũi tên);
• c-d. tất cả các bào tử đồng loạt giải phóng khi bào nang vỡ (mũi tên);
• d. bào nang không bền

Hình 7. Bào nang đang bơi. Các mũi tên chỉ 2 roi bơi.

Hình 8. Các bào tử được bao bọc

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên tăng trưởng.

Kết quả được thể hiện trong Bảng 2. Chủng phân lập NJM 0031 phát triển ở 15 đến 35^oC với nhiệt độ tối ưu ở 30^oC. L. callinectes ATCC 24973 đã phát triển ở mức 15 đến 25^oC, tốt nhất ở 25^oC. L. callinectes NJM 8989 phát triển ở 15 đến 25^oC, tốt nhất ở 20^oC. L. thermophilum ATCC 200318 phát triển ở 20 đến 40°C, tốt nhất ở 30°C. L. myophilum ATCC 66280 phát triển ở 5 đến 30^oC, tốt nhất ở 15 đến 30^oC. Nhiệt độ tốt cho sự tăng trưởng của chủng NJM 0031 gần như tương tự với L.thermophilum ATCC 200318.

Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên tăng trưởng.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.

Chủng NJM 0031, L. thermophilum ATCC 200318 và L. myophilum ATCC 66280 có thể phát triển trên thạch PYG có chứa từ 0 đến 5.0% NaCl. L. callinectes ATCC 24973 và L.callinectes NJM 8989 có thể phát triển trên thạch PYG chứa 0,5 đến 5,0% NaCl. Sự phát triển của chủng phân lập NJM 0031 và L.thermophilum ATCC 200318 gần như là như nhau, không phân biệt nồng độ NaCl.

Thử nghiệm phơi nhiễm

Chủng phân lập NJM 0031 cho thấy khả năng gây bệnh đối với giai đoạn zoeae và mysis ở tôm sú (Bảng 4). Các sợi nấm đặc không có vách ngăn đã được quan sát thấy ở zoea và mysis chết dưới kính hiển vi. Các tỉ lệ tích lũy ở zoeae và mysis tiếp xúc với 10⁴ bào tử / mL lần lượt là khoảng 40 và 85% ở 48 giờ hậu phơi nhiễm. Trong nhóm kiểm soát, không có sự lây nhiễm nào xảy ra ở cả hai giai đoạn zoeae và mysis.

Bảng 4. Khả năng gây bệnh của chủng phân lập NJM 0031 đối với zoeae và mysis tôm sú trong thử nghiệm cho nhiễm nhân tạo.

Số lượng bào tử cảm nhiễm (bào tử/ml)	Zoea		Mysis
	24a	48	24	48
10×104	20b	40	40	85
10×103	5	5	30	45
10×102	0	0	5	5
Đối chứng	0	0	0	0

a : Số giờ sau cảm nhiễm

b : Tỉ lệ chết tích lũy (%)

Thảo luận

Hiện tại, các loại nấm trong bốn chi, Lagenidium, Haliphthoros, Halocrusticida và Atkinsiella, thuộc đến lớp Peronosporomycetes (Oomycetes) được biết đến như mầm bệnh ở động vật giáp xác biển (Roza và Hatai, 1999, Hatai và cộng sự, 2000). Lớp Peronosporomycetes bây giờ được chuyển từ hệ Fungi sang hệ mới được xây dựng Stramenopila (Chromista) dựa trên phân tích phát sinh loài phân tử. Tuy nhiên, sự lây nhiễm gây ra bởi một số thành viên của Peronosporomycetes ở động vật giáp xác biển vẫn được phân loại là nhiễm nấm trong lĩnh vực bệnh đối với động vật có vỏ.

Chủng phân lập NJM 0031 với bào tử hai roi là endobiotic (nội sinh) và holocarpic (thể thực), và được sản xuất bào nang trên đầu ống. Do đó, nấm được xếp vào chi Lagenidium (Lagenidiales, Peronosporomycetes) dựa trên những đặc điểm hình thái. Nấm trong chi Lagenidium đã được phân lập từ các loại nhựa cây thủy sinh khác nhau (Bảng 5). Giải phóng bào tử của chủng NJM 0031 đặc trưng xảy ra sau khi bào nang được tách khỏi các ống “giải phóng” (Hình 6a-d). Dựa trên trên phương thức giải phóng bào tử này, chủng NJM 0031 được xác định là L. thermophilum được báo cáo bởi Nakamura và cộng sự. (1995). Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nấm và L. thermophilum phân lập ATCC 200318 cũng tương tự.

Trong nghiên cứu này, L.thermophilum ATCC 200318 có thể phát triển ở 20–40^oC. Tuy nhiên, Nakamura và cộng sự. (1995) báo cáo rằng L. thermophilum ATCC 200318 có thể phát triển ở 15–45^oC với mức tối ưu là 30–40^oC. L. callinectes ATCC 24973 và NJM 8989 có thể phát triển ở 15–25^oC với tối ưu là 20^oC. L. myophilum ATCC 66280 tăng trưởng ở 5^oC. Kết quả là, người ta cho rằng những kết quả có liên quan chặt chẽ đến khí hậu nơi mỗi chủng đã được phân lập. Chủng phân lập NJM 0031 và L. thermophilum ATCC 200318 phát triển trên thạch PYG chứa 0–5,0% NaCl, nhưng kém ở 0% NaCl. L. myophilum ATCC 66280 cũng có thể phát triển trên thạch PYG có chứa 0–5,0% NaCl, nhưng sự tăng trưởng rõ ràng là khác nhau từ phân lập NJM 0031 và L. thermophilum ATCC 200318. Nó phát triển nhanh chóng trên tất cả các phạm vi độ mặn của PYG thạch. Như các phân lập ATCC 24973 và NJM 8989 của L. callinectes không thể phát triển trên thạch PYG chứa 0% NaCl, người ta cho rằng chúng là loại nấm biển bắt buộc. Sự lây nhiễm nhân tạo đã chứng minh rằng chủng NJM 0031 gây bệnh cho zoeae và mysis ở tôm sú. Khả năng gây bệnh của phân lập NJM 0031 đến mysis cao hơn so với zoeae. Nakamura và cộng sự. (1995) cũng cho biết L. thermophilum cho thấy khả năng gây bệnh cho zoeae của cua bơi Portunus trituberculatus bằng cách cho nhiễm nhân tạo.

Bảng 5. Nấm trong chi Lagenidium đã được báo cáo trước đây là mầm bệnh cho động vật thủy sinh.

Loài	Tham khảo	Vật chủ	Giai đoạn
1.     L. giganteum	Couch (1935)	Muỗi, daphnia, copepods	ấu trùng – –
2.     L. Callinectes	Couch (1942)	Cua xanh Callinectes sapidus	Trứng
3.     L. scyllae	Bian và cộng sự (1979)	Cua rừng nước mặn Scylla serrata	Trứng và ấu trùng
4.     L.myophilum	Hatai và Lawhavinit (1988) Nakamura và cộng sự (1994)	Tôm phía Bắc Pandalus borealis Tôm “coonstripe” Pandalus hypsinotus	Con trưởng thành     Con trưởng thành
5.     L. thermophilum	Nakamura và cộng sự (1995)	Cua rừng nước mặn Scylla serrata	Trứng và ấu trùng
6.     L.sp.	Lightner và Fontaine (1973)	Tôm thẻ trắng Đại Tây Dương Penaeus setiferus	Ấu trùng

Bốn loài trong chi Lagenidium đã được được báo cáo là mầm bệnh của một số loài giáp xác. L. callinectes lần đầu tiên được báo cáo là một loại nấm gây bệnh trên trứng cua xanh Callinectes sapidus (Couch, 1942), và sau đó được tìm thấy trong trứng và ấu trùng của nhiều loài cua khác nhau và tôm (Crisp và cộng sự, 1989). L. scyllae được báo cáo là ký sinh trùng trên trứng và ấu trùng của cua rừng ngập mặn Scylla serrata ở Philippines (Bian và cộng sự, 1979). L. myophilum lần đầu tiên được mô tả như một mầm bệnh của tôm miền bắc Pandalus borealis ở Nhật Bản (Hatai và Lawhavinit, 1988), và cả từ tôm xoắn Pandalus hypsinotus (Nakamura và cộng sự, 1994). L. thermophilum lần đầu tiên được mô tả như một mầm bệnh của trứng và ấu trùng của cua rừng ngập mặn Scylla serrata ở Indonesia (Nakamura et al., 1995). Hai đặc điểm chính của L. thermophilum được báo cáo bởi Nakamura et al. (1995) là như sau; bào nang đã được tách ra khỏi ống trước khi bào tử được giải phóng, và nhiệt độ cho sự phát triển là 30°C. Chủng phân lập NJM 0031 hiện tại cũng có các đặc điểm tương tự khi so sánh với L. thermophilum ATCC 200318 được báo cáo bởi Nakamura và cộng sự. (1995). Các loài đã được phân lập từ Thái Lan và Indonesia. Nó có nghĩa là loài này là thích nghi tốt với các vùng nhiệt đới. Đây là báo cáo đầu tiên về phân lập L. thermophilum từ tôm sú P. monodon ở Thái Lan.

Theo Kishio Hatai

Nguồn:https://www.researchgate.net/publication/240804861_Lagenidium_thermophilum_Isolated_from_Eggs_and_Larvae_of_Black_Tiger_Shrimp_Penaeus_monodon_in_Thailand

Biên dịch: Thùy Linh – Công ty TNHH PTTS Bình Minh

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

• UAE Thành Lập Hệ Thống Nuôi Tôm RAS Đầu Tiên Tại Khu Vực
• Rabobank Nhận Thấy Ngành Nuôi Trồng Thủy Sản Có Triển Vọng Mạnh Mẽ Sau Covid
• ASC Công Bố Tiêu Chuẩn Mới Cho Tôm Nuôi Trong Hệ Thống RAS