Phần 1: Đánh Giá Chiết Xuất Protein Từ Ấu Trùng Sâu Bột Vàng (Tenebrio molitor) Như Một Chất Bảo Vệ Chống Đông Lạnh Cho Tôm Thẻ Chân Trắng Đông Lạnh

Tóm tắt

Nghiên cứu này đánh giá khả năng ứng dụng chiết xuất protein từ ấu trùng sâu bột vàng (Tenebrio molitor) (YMPE) như một chất bảo vệ lạnh nhãn sạch cho tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) đông lạnh, đồng thời làm rõ cơ chế tác động của hợp chất này. Kết quả phân tích protein đã xác định được 12 peptide tương đồng với protein chống đông, chứa các motif liên kết băng được bảo tồn (TCTxSxxCxxAx), cho thấy tiềm năng bảo vệ lạnh của YMPE. Trong giai đoạn tối ưu hóa liều lượng, tôm được xử lý với 0,5% YMPE đạt mức tăng trọng lượng cao nhất (5,57%) và hàm lượng nước có thể đóng băng thấp nhất (59,67%) (P < 0,05). Hiệu quả bảo vệ lạnh của YMPE tiếp tục được đánh giá thông qua năm chu kỳ đông lạnh – rã đông và được so sánh với nước cất và hỗn hợp phosphat. Kết quả cho thấy YMPE làm giảm đáng kể sự suy giảm chất lượng sản phẩm bằng cách cải thiện khả năng giữ nước, duy trì chức năng protein thông qua hoạt tính Ca²⁺-ATPase cao hơn và hạn chế sự rò rỉ enzyme lysosome so với nhóm đối chứng (P < 0,05). Phân tích cấu trúc vi mô cho thấy YMPE giúp giảm hiện tượng đứt gãy sợi cơ, thể hiện qua số lượng khoảng trống giữa các sợi cơ giảm. Về cơ chế tác động, YMPE có thể phát huy hiệu quả bảo vệ chống đông thông qua nhiều cơ chế kết hợp, bao gồm ức chế quá trình tái kết tinh băng và hình thành ma trận protein bảo vệ. Mặc dù hiệu quả thấp hơn hỗn hợp phosphat, YMPE vẫn cải thiện đáng kể tất cả các chỉ tiêu chất lượng so với nhóm đối chứng. Những kết quả này cho thấy tiềm năng của chiết xuất protein từ côn trùng như một giải pháp thay thế có nguồn gốc sinh học cho các phụ gia phosphat trong chế biến hải sản, đồng thời tạo cơ sở cho các ứng dụng công nghiệp trong tương lai.

1. Giới thiệu

Ngành công nghiệp chế biến hải sản, đặc biệt là chế biến tôm, giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế Thái Lan. Năm 2023, Thái Lan đã xuất khẩu 131.410 tấn tôm và các sản phẩm từ tôm với tổng giá trị khoảng 1.335 triệu USD, trong đó tôm ướp lạnh và đông lạnh chiếm 42,33% tổng giá trị xuất khẩu (Bộ Thương mại Thái Lan, 2024). Tuy nhiên, các sản phẩm tôm đông lạnh thường gặp tình trạng giảm khối lượng và suy giảm chất lượng sau khi rã đông, bao gồm những biến đổi không mong muốn về kết cấu, màu sắc và hương vị. Những thay đổi này chủ yếu bắt nguồn từ quá trình hình thành và tái kết tinh của các tinh thể đá trong suốt thời gian bảo quản và vận chuyển lạnh (Qiao và cộng sự, 2022). Để hạn chế các vấn đề trên, các hợp chất phosphat và bicacbonat đã được sử dụng rộng rãi trong chế biến tôm. Tuy nhiên, việc sử dụng các hợp chất này ngày càng bị kiểm soát chặt chẽ do các quy định từ những thị trường nhập khẩu lớn như Liên minh Châu Âu và Canada, trong đó tổng hàm lượng phosphat được giới hạn ở mức 0,5% (tính theo P₂O₅) (Liên minh Châu Âu, 2013; Bộ Y tế Canada, 2021). Bên cạnh đó, việc sử dụng phosphat ở mức cao có thể làm giảm chất lượng cảm quan của sản phẩm, gây ra các đặc tính không mong muốn như kết cấu nhớt và vị chát (Rattanasatheirn và cộng sự, 2008). Những hạn chế này cho thấy nhu cầu tìm kiếm các giải pháp thay thế vừa an toàn, tự nhiên vừa hiệu quả trong chế biến tôm.

Protein chống đông (AFP) là các phân tử sinh học tự nhiên được tìm thấy ở thực vật, côn trùng và cá, có khả năng làm giảm điểm đóng băng của nước thông qua việc liên kết với bề mặt tinh thể băng, từ đó ức chế quá trình hình thành và phát triển của các tinh thể băng (Bar-Dolev et al., 2016). Bọ cánh cứng bột vàng (Tenebrio molitor Linnaeus), một trong những loài côn trùng ăn được được tiêu thụ phổ biến nhất, được xem là nguồn giàu AFP. Ở giai đoạn ấu trùng, loài này biểu hiện hoạt tính chống đông đặc biệt cao (Tyshenko, 2011). AFP từ T. molitor là các protein giàu threonine và cysteine, có cấu trúc xoắn thuận tay phải chặt chẽ và đồng đều (Kristiansen, 2020), đồng thời duy trì tính ổn định ở nhiệt độ lên đến 66 °C và trong khoảng pH từ 6 đến 12,5 (Bar et al., 2008). Sự sắp xếp của các gốc threonine dọc theo chuỗi protein tạo điều kiện cho khả năng liên kết mạnh với tinh thể băng thông qua tương tác với cả mặt đáy và mặt lăng trụ của tinh thể. Nhờ đó, AFP có thể làm chậm quá trình hình thành băng cũng như sự phát triển của các tinh thể băng (Ramya & Ramakrishnan, 2016; Zachariassen et al., 2011).

Các nghiên cứu trước đây cho thấy việc ngâm các loại rau củ như dưa chuột, cà rốt, bí ngòi và hành tây trong protein chiết xuất từ sâu bột vàng trước khi cấp đông có thể làm tăng đáng kể lực phá vỡ của sản phẩm so với các mẫu không được xử lý (Song và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, việc sử dụng chiết xuất protein sâu bột vàng như một chất bảo vệ chống đông lạnh trong các sản phẩm thủy sản có nguồn gốc cơ thịt, đặc biệt là tôm, vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi. Phương pháp ngâm là một kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp và được áp dụng phổ biến trong chế biến thủy sản. Phương pháp này cho phép các hợp chất chức năng hình thành một lớp bảo vệ trên bề mặt sản phẩm, từ đó có thể hạn chế sự biến tính protein trong quá trình cấp đông và bảo quản lạnh đông. Vì vậy, giả thuyết được đặt ra là chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE), chứa các peptide có đặc tính tương tự protein chống đông, có khả năng làm giảm tổn thương cơ do quá trình đông lạnh thông qua việc ức chế sự tái kết tinh của các tinh thể đá.

Mặc dù các chất bảo vệ lạnh có nguồn gốc tự nhiên đang ngày càng thu hút sự quan tâm, phần lớn các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào các chất thủy phân gelatin cá, polysaccharide hoặc các hợp chất có nguồn gốc thực vật. Trong khi đó, tiềm năng ứng dụng của các protein có nguồn gốc từ côn trùng trong hệ thống bảo quản hải sản vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Đặc biệt, mặc dù các protein chống đông (AFP) từ T. molitor đã được chứng minh có khả năng liên kết mạnh với tinh thể băng, nhưng vai trò chức năng của chúng trong hệ cơ tôm vẫn chưa được xác định rõ. Bên cạnh đó, những hiểu biết về cơ sở phân tử của hoạt tính bảo vệ lạnh do các chiết xuất protein có nguồn gốc từ côn trùng mang lại, cũng như ảnh hưởng của chúng đến sự ổn định của protein cơ trong các chu kỳ đông lạnh – rã đông, hiện vẫn còn rất hạn chế.

Do đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả của chiết xuất protein từ sâu bột vàng (YMPE) như một chất bảo vệ lạnh có nguồn gốc tự nhiên cho tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) đông lạnh. Cụ thể, nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng của YMPE đến khả năng giữ nước, quá trình biến tính protein (bao gồm hoạt tính α-glucosidase, hoạt tính β-N-acetyl-glucosaminidase, hoạt tính Ca²⁺-ATPase, tính kỵ nước bề mặt và sự hình thành liên kết disulfide), cũng như các đặc tính cấu trúc và cấu trúc vi mô của cơ tôm trong các chu kỳ đông lạnh – rã đông lặp lại, đồng thời so sánh với hỗn hợp phosphate thông thường. Bên cạnh đó, các peptide có đặc tính tương tự protein chống đông trong YMPE đã được xác định bằng phương pháp proteomics shotgun nhằm làm rõ các cơ chế phân tử tiềm năng liên quan đến tác dụng bảo vệ lạnh của hợp chất này. Kết quả nghiên cứu cung cấp những hiểu biết mới về khả năng ứng dụng protein có nguồn gốc từ côn trùng như một giải pháp thay thế nhãn sạch cho các chất bảo vệ lạnh gốc phosphate đang được sử dụng phổ biến trong chế biến hải sản.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Hóa chất

Tất cả các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết dùng trong phân tích và được mua từ Sigma-Aldrich Chemical (St. Louis, MO, Hoa Kỳ).

2.2. Chuẩn bị bột sâu bột vàng

Sâu bột vàng sống có chiều dài từ 25–35 mm được thu mua từ một trang trại địa phương tại Hat Yai, Songkhla, Thái Lan. Trước khi xử lý, sâu bột được nhịn ăn trong 24 giờ, sau đó được sàng qua lưới có kích thước 20 mesh để loại bỏ phân. Tiếp theo, sâu bột đã làm sạch được ủ ở 4 °C trong 24 giờ nhằm kích thích sự tích lũy protein chống đông, rồi được đông lạnh ở -18 °C trong 48 giờ để tiêu diệt hoàn toàn. Sau khi chết, sâu bột được nghiền thành bột và bảo quản ở -18 °C trong thời gian tối đa 3 tháng trước khi được sử dụng để chuẩn bị dịch chiết protein từ sâu bột vàng.

2.3. Chuẩn bị chiết xuất protein từ sâu bột vàng

Chiết xuất protein từ sâu bột vàng được chuẩn bị bằng phương pháp có điều chỉnh nhẹ từ quy trình của Boukil và cộng sự (2022). Cụ thể, 100 g bột protein sâu bột vàng được phối trộn với 500 mL nước cất và khuấy liên tục ở 4 °C trong 48 giờ, sau đó được ly tâm ở 12.000 ×g trong 1 giờ tại 4 °C. Sau quá trình ly tâm, hỗn hợp tách thành ba lớp gồm lớp chất béo ở phía trên, lớp chiết xuất protein ở giữa và lớp chất không tan ở phía dưới. Lớp giữa được thu hồi và sấy đông khô bằng thiết bị CoolSafe Touch 100-9 (Allerød, Đan Mạch) để thu được bột chiết xuất protein sâu bột vàng (YMPE), sau đó được bảo quản ở −18°C cho đến khi tiến hành các phân tích tiếp theo. Hiệu suất thu hồi YMPE đạt 20,03% tính theo khối lượng khô của bột sâu bột vàng, với hàm lượng protein là 41,26%. Phần còn lại của YMPE có thể bao gồm các chất hòa tan trong nước được đồng chiết xuất cùng với protein, chẳng hạn như khoáng chất và carbohydrate (ví dụ: trehalose), vốn được biết là có mặt tự nhiên trong Tenebrio molitor (Storey & Storey, 2012). Hoạt tính bảo vệ chống đông của YMPE được đánh giá bằng mô hình dung dịch NaCl, thông qua việc theo dõi khả năng làm giảm enthalpy eutectic của NaCl theo phương pháp do Karnjanapratum và Benjakul (2015) đề xuất.

2.4. Xác định các protein trong dịch chiết protein sâu bột vàng

Hồ sơ protein của YMPE được phân tích bằng phương pháp proteomics toàn diện. Tóm tắt quy trình, dịch chiết được xử lý bằng phương pháp tiêu hóa trong dung dịch, sau đó phân tích bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần (LC-MS/MS). Các phổ MS/MS thu được được đối chiếu với cơ sở dữ liệu Tenebrio molitor (UniProt) bằng phần mềm MaxQuant để xác định trình tự peptide. Tiếp theo, các protein được sàng lọc nhằm tìm kiếm những trình tự có tính tương đồng với các protein chống đông đã được biết đến hoặc chứa các motif liên kết với băng, chẳng hạn như TCTxSxxCxxAx. Các thông tin chi tiết về cài đặt thiết bị và các tham số phân tích tin sinh học được trình bày trong Phương pháp bổ sung S1.

2.5. Lựa chọn nồng độ tối ưu của chiết xuất protein sâu bột vàng

Tôm thẻ chân trắng tươi (35–40 con/kg) được thu mua từ chợ địa phương tại Papayom, tỉnh Phatthalung, Thái Lan. Sau khi thu mua, tôm được sơ chế bằng cách loại bỏ đầu, vỏ và chỉ lưng, rồi rửa sạch bằng nước máy. Trong toàn bộ quá trình sơ chế, nhiệt độ của tôm được duy trì trong khoảng từ 2 đến 10 °C.

Sau khi chuẩn bị, tôm được ngâm trong các dung dịch xử lý với tỷ lệ tôm dịch là 1:1 (w/v) và được khuấy liên tục ở 4 °C trong 30 phút. Các nghiệm thức xử lý gồm: (1) nước cất (DW); (2) dung dịch phosphat hỗn hợp (MP) ở nồng độ 3% (w/v), bao gồm 1% (w/w) natri tripolyphosphat và 2% (w/w) tetranatri pyrophosphat, có bổ sung 2,5% (w/v) NaCl; và (3), (4), (5) và (6) dung dịch chiết xuất protein từ sâu bột vàng (YMPE) ở các nồng độ tương ứng 0,25%, 0,5%, 1% và 3% (w/v), trong đó tất cả các dung dịch đều chứa 2,5% (w/v) NaCl.Sau khi ngâm, tôm được vớt ra và thấm khô nhẹ nhàng bằng khăn. Độ tăng trọng được tính bằng cách so sánh trọng lượng của tôm sau khi ngâm và thấm khô với trọng lượng ban đầu trước khi xử lý. Tôm đã xử lý được đóng gói trong túi polyethylene và đông lạnh trong tủ đông (mẫu SNH-0205, SANDEN INTERCOOL, Thái Lan) trong 24 giờ.

Tôm đông lạnh được rã đông trong tủ lạnh ở nhiệt độ 2–4 °C cho đến khi nhiệt độ tại tâm sản phẩm đạt 0–2 °C, với thời gian rã đông khoảng 24 giờ. Sau khi rã đông, mẫu tôm được xác định hàm lượng nước có thể đóng băng theo phương pháp do Cao và cộng sự (2020) mô tả.

Trong số các điều kiện ngâm tẩm được khảo sát, điều kiện sử dụng dung dịch YMPE cho mức tăng trọng lượng cao nhất và hàm lượng nước có thể đóng băng thấp nhất được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu.

2.6. Hoạt tính bảo vệ chống đông lạnh của YMPE trong hệ thống mô hình tôm đông lạnh-rã đông

Điều kiện chuẩn bị mẫu và ngâm tôm được thực hiện theo quy trình đã mô tả ở Mục 2.5, sử dụng nồng độ YMPE đã được lựa chọn, sau đó tiến hành các chu kỳ đông lạnh – rã đông. Tôm sau khi xử lý được cấp đông ở −18 °C trong 24 giờ và rã đông theo cùng quy trình nêu tại Mục 2.5. Quá trình đông lạnh – rã đông được thực hiện với 0, 1 và 5 chu kỳ, tương ứng với các trạng thái tôm tươi ban đầu, điều kiện xử lý thông thường và điều kiện chịu tác động của nhiệt độ khắc nghiệt. Sau khi rã đông, mẫu tôm được bảo quản trên đá trước khi tiến hành phân tích tỷ lệ hao hụt sau rã đông, hao hụt khi nấu, hoạt tính α-glucosidase (AG) và β-N-acetyl-glucosaminidase (NAG), cùng các đặc tính lý hóa, màu sắc, kết cấu và cấu trúc vi mô.

2.7. Xác định tổn thất khi rã đông và tổn thất khi nấu chín

Sau khi rã đông, lượng nước dư trên bề mặt tôm được thấm khô bằng khăn giấy trước khi tiến hành cân khối lượng. Tỷ lệ hao hụt khối lượng trong quá trình rã đông được tính theo phương trình dưới đây. Để xác định tỷ lệ hao hụt khi nấu, tôm sau khi rã đông được luộc trong nước sôi trong 90 giây, sau đó làm nguội bằng nước đá trong 3 phút. Nước dư trên bề mặt tôm tiếp tục được loại bỏ bằng cách thấm khô bằng khăn giấy trước khi cân. Tỷ lệ hao hụt khi nấu được tính theo phương trình dưới đây.

2.8. Xác định hoạt tính α-glucosidase (AG) và β-N-acetyl-glucosaminidase (NAG)

Mẫu 25 g tôm đã rã đông được băm nhỏ và ly tâm ở 10.000 × g, 4 °C trong 60 phút. Dịch chiết sau khi pha loãng được sử dụng để xác định hoạt tính của enzyme AG và NAG theo phương pháp của Benjakul và Bauer (2001). Đối với AG, 1 mL dịch chiết pha loãng được trộn với dung dịch đệm natri citrat 0,1 M (pH 4), 0,2 mL dung dịch NaCl 1 M và được ủ sơ bộ ở 37 °C trong 10 phút. Đối với NAG, dịch chiết được trộn với dung dịch đệm natri citrat 0,1 M (pH 4,5) và 0,2 mL dung dịch KCl 0,6 M, sau đó cũng được ủ sơ bộ ở 37 °C trong 10 phút. Phản ứng được khởi động bằng cách bổ sung 1 mL dung dịch 4,2 mM ρ-nitrophenyl-α-glucopyranoside đối với AG hoặc 0,2 mL dung dịch 4,8 mM ρ-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosamine đối với NAG, rồi tiếp tục ủ ở 37 °C trong 60 phút. Sau đó, phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 1 mL KOH 0,3 M và đo độ hấp thụ ở bước sóng 405 nm. Mẫu đối chứng được chuẩn bị bằng cách thay thế dịch chiết bằng nước cất, trong khi mẫu đối chứng âm được chuẩn bị bằng cách bổ sung KOH 0,3 M để dừng phản ứng trước khi thêm cơ chất.

Lượng ρ-nitrophenol được giải phóng được xác định bằng cách sử dụng hệ số hấp thụ mol là 19.500 M/ cm. Hoạt tính enzyme được định nghĩa là một đơn vị, tương ứng với khả năng giải phóng 1 nmol ρ-nitrophenol mỗi phút.

2.9. Xác định các tính chất lý hóa

Các đặc tính lý hóa của tôm tươi và tôm đông lạnh sau rã đông được đánh giá thông qua các chỉ tiêu gồm độ hòa tan protein, hoạt tính Ca²⁺-ATPase, độ kỵ nước bề mặt và hàm lượng liên kết disulfide. Trước khi tiến hành các phép xác định, actomyosin tự nhiên (NAM) được chiết xuất từ cơ tôm theo quy trình của Benjakul và cộng sự (1997).

Độ hòa tan của protein được xác định bằng cách so sánh NAM chiết xuất từ cơ tôm sau rã đông ở từng chu kỳ với NAM chiết xuất từ cơ tôm tươi. Hoạt tính Ca²⁺-ATPase và hàm lượng liên kết disulfide được xác định lần lượt theo phương pháp của Benjakul và cộng sự (1997) và Thannhauser và cộng sự (1987).

Độ kỵ nước bề mặt được xác định bằng phương pháp liên kết với bromophenol blue (BPB) theo Chelh và cộng sự (2006). Cụ thể, 3 mL dung dịch NAM (4 mg/mL) được trộn với 0,1 mL dung dịch BPB 50 μM và ủ ở nhiệt độ phòng (25 °C) trong 30 phút. Sau đó, độ hấp thụ của hỗn hợp được đo tại bước sóng 595 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay thế mẫu NAM bằng dung dịch KCl 0,6 M. Hệ số hấp thụ 44.000 M⁻¹ cm⁻¹ được sử dụng để tính toán độ kỵ nước bề mặt, và kết quả được biểu thị dưới dạng lượng BPB liên kết (mol) trên 10⁶ g protein.

2.10. Xác định lực cắt

Một máy phân tích kết cấu (mẫu TA-XT2i, Stable Micro Systems, Surrey, Anh) được trang bị cảm biến lực 25 kg và hoạt động ở tốc độ đầu kẹp 10 mm/s đã được sử dụng kết hợp với thiết bị cắt Warner-Bratzler để đánh giá lực cắt của mẫu. Giá trị lực cắt được xác định là lực cực đại ghi nhận được khi đầu dò xuyên qua đoạn thứ hai của sợi cơ tôm.

2.11. Xác định màu sắc

Các mẫu được đồng nhất hóa bằng máy xay trước khi đo màu. Màu sắc của các mẫu được xác định bằng máy quang phổ CM-5 (KONICA MINOLTA, Nhật Bản), cung cấp giá trị L* (độ sáng), giá trị a* (độ đỏ/xanh lá cây) và giá trị b* (độ vàng/xanh dương).

2.12. Xác định cấu trúc vi mô

Cấu trúc vi mô của tôm tươi và tôm đông lạnh rã đông được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử (Quanta 400; FEI, Eindhoven, Hà Lan). Trước khi chụp ảnh, các mẫu được cố định trong dung dịch glutaraldehyde 2,5% (v/v) pha trong dung dịch đệm phosphat 0,2 M (pH 7,2) trong 12 giờ, sau đó khử nước tuần tự trong các dung dịch ethanol có nồng độ từ 50 đến 70% (v/v). Sau đó, mẫu được phủ một lớp vàng mỏng bằng máy phủ chân không (Sputter coater) (SPI-Module, PA, Hoa Kỳ).

2.13. Phân tích thống kê

Tất cả các thí nghiệm được tiến hành với ba lần lặp. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm Gói thống kê cho khoa học xã hội (SPSS for Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, Hoa Kỳ). Tùy theo kích thước mẫu, dữ liệu được phân tích bằng phép kiểm định t hoặc phân tích phương sai (ANOVA), và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được xác định bằng phép thử khoảng đa bội Duncan theo phương pháp của Steel và Torrie (1980).

…Còn tiếp…

Theo Phanat Kittiphattanabawon, Chodsana Sriket, Sitthipong Nalinanon, Narumon Phaonakrop, Sittiruk Roytrakul, Soottawat Benjakul,Wonnop Visessanguan

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643826005438

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Nuôi Cá Rô Phi Lai Trong Hệ Thống Sản Xuất Sinh Học Ngoài Trời
• Nồng Độ Nitrat Cao Gây Độc Cho Tôm
• Glutamate Tăng Cường Khả Năng Kháng Khuẩn Của Tôm Bằng Cách Tăng Cường Khả Năng Miễn Dịch Tế Bào Của Tôm