Phần 2: Chiết Xuất Bã Tinh Dầu Của Cây Tía Tô Có Hoạt Tính Sinh Học, Dùng Làm Chất Chống Oxy Hóa Và Chất Bảo Quản Chống Đen Cho Tôm Thẻ Chân Trắng

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Các sản phẩm phụ của tinh dầu và cách điều chế chiết xuất của chúng

Bốn loại phụ phẩm thực vật, gồm vỏ cây Cinnamomum zeylanicum, lá Perilla frutescens, Curcuma longa và Cymbopogon nardus, được thu nhận từ các phòng thí nghiệm hóa học của Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh (Việt Nam) sau quá trình chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất hơi nước. Các phụ phẩm sau chưng cất được sấy khô ở 80°C trong 6 giờ bằng tủ sấy (Memmert, Đức), sau đó được nghiền mịn bằng máy nghiền (Công ty Cổ phần Thương mại SEKA Việt Nam, Hà Nội, Việt Nam). Tiếp theo, 100 g bột phụ phẩm được ngâm trong ethanol 70% (v/v) với tỷ lệ bột/dung môi là 1:9 (w/v) ở nhiệt độ phòng (32 ± 4°C) trong 48 giờ, sau đó lọc để thu dịch chiết. Dịch lọc được cô đặc ở 50°C nhằm thu nhận dịch chiết thô. Các dịch chiết thô từ phụ phẩm vỏ cây C. zeylanicum, lá P. frutescens, C. longa và C. nardus lần lượt được ký hiệu là CM-E, PF-E, CL-E và CN-E, được bảo quản trong các chai nhựa kín, không trong suốt, và lưu trữ ở nhiệt độ 1–3°C trong tủ lạnh (LG Electronics) trong vòng 1 năm tại phòng thí nghiệm hóa học của Trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Thành phố Hồ Chí Minh (Việt Nam). Ngoài ra, 100 g lá Perilla frutescens tươi, không qua chưng cất và đã được sấy khô, được sử dụng làm mẫu đối chứng và ký hiệu là FPF-E. Các dịch chiết được đánh giá thông qua hàm lượng ẩm (wt, %) và hiệu suất chiết xuất (H%), với phương pháp phân tích chi tiết được trình bày trong phần dữ liệu bổ sung.

2.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chiết xuất đã điều chế

2.2.1. Phân tích FT-IR và HPLC-MS

Các nhóm chức trong dịch chiết từ phụ phẩm được xác định bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR). Đồng thời, thành phần hóa học của dịch chiết cặn P. frutescens được phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ với nguồn ion hóa phun điện tử (HPLC-ESI-MS), theo quy trình đã được mô tả trước đây (Do, Bui & Phan, 2022). Các điều kiện phân tích và thông số hiệu suất của phương pháp FT-IR và HPLC-MS được trình bày chi tiết trong phần dữ liệu bổ sung.

2.2.2. Tổng hàm lượng phenolic (TPC) và tổng hàm lượng flavonoid (TFC)

Tổng hàm lượng phenolic (TPC) được xác định theo quy trình đã được công bố trước đây (Do, Bui & Phan, 2022; Hussain et al., 2025). Trong khi đó, tổng hàm lượng flavonoid (TFC) được đo dựa trên phương pháp đã được báo cáo (Woisky & Salatino, 1998; Hussain et al., 2024). Việc đo độ hấp thụ của TPC và TFC trong các mẫu được thực hiện lần lượt tại các bước sóng 760 nm và 550 nm bằng máy quang phổ UV/Vis (UH-5300, Hitachi, Nhật Bản). Giá trị TPC và TFC của các dịch chiết được biểu thị tương ứng dưới dạng mg tương đương axit gallic (GAE) và mg tương đương catechin (CE) trên mỗi gam trọng lượng khô của mẫu chiết (mg GAE/g DW và mg CE/g DW). Tất cả các thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần, và quy trình chi tiết được trình bày trong phần dữ liệu bổ sung.

2.2.3. Các xét nghiệm DPPH, khả năng khử sắt/chống oxy hóa (FRAP) và khả năng ức chế polyphenoloxidase (PPO)

Hoạt tính loại bỏ gốc tự do của các mẫu chiết được xác định bằng phép thử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) theo quy trình đã công bố trước đó (Do, Bui & Phan, 2022). Tỷ lệ ức chế DPPH (I%) được tính toán dựa trên sự thay đổi giá trị độ hấp thụ tại bước sóng 517 nm của dung dịch DPPH trong điều kiện có và không có sự hiện diện của dịch chiết. Giá trị IC₅₀ của các mẫu chiết được xác định là giá trị trung bình thu được từ ba lần đo độc lập trong phạm vi nồng độ khảo sát. Axit gallic được sử dụng làm đối chứng dương, với giá trị IC₅₀ là 0,77 µg/mL.

Khả năng khử hay hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu chiết tiếp tục được đánh giá bằng phương pháp FRAP, thực hiện theo quy trình đã mô tả trước đó (Do, Bui & Phan, 2022). Giá trị EC₅₀, được định nghĩa là nồng độ hiệu quả của dịch chiết đạt mật độ quang học (OD) 0,5, được tính toán dựa trên giá trị OD trung bình của ba lần đo tại bước sóng 700 nm. Vitamin C được sử dụng làm đối chứng dương trong phép thử này, với giá trị EC₅₀ là 6,39 µg/mL.

Thử nghiệm ức chế PPO được tiến hành dựa trên phản ứng chuyển hóa 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine (L-DOPA) thành DOPA-chrome dưới sự xúc tác của enzyme PPO, với độ hấp thụ được đo tại bước sóng 475 nm (Do, Bui & Phan, 2022). Tỷ lệ ức chế PPO (I₍PPO₎%) và nồng độ gây ức chế 50% (IC₅₀) của các mẫu chiết được xác định theo phương pháp tương tự như trong phép thử DPPH. Axit kojic, với giá trị IC₅₀ = 4,35 µg/mL, được sử dụng làm đối chứng dương. Các quy trình chi tiết để đánh giá khả năng ức chế DPPH, FRAP và PPO được trình bày trong phần dữ liệu bổ sung.

2.3. Thử nghiệm độc tính

2.3.1. Nuôi cấy tế bào

Các dòng tế bào HepG2 và HEK293 (ATCC®) được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco®, Hoa Kỳ), 10% (v/v) huyết thanh bào thai bò (FBS) (Gibco®, Hoa Kỳ), 1% (v/v) kháng sinh-kháng nấm (Gibco®, Hoa Kỳ). Các tế bào được ủ (ESCO®, Singapore) ở 37°C và 5% CO2 _. Các tế bào được tách ra bằng cách sử dụng trypsin-EDTA 0,25% (Gibco®, Hoa Kỳ) và ủ ở 37°C.

2.3.2. Chuẩn bị mẫu

Dịch chiết được chuẩn bị dưới dạng dung dịch gốc trong DMSO và pha loãng trong môi trường nuôi cấy (nồng độ DMSO cuối cùng ≤ 0,5 % ( v / v )) với nồng độ pha loãng nối tiếp từ 12,5 – 100 µg/mL.

2.3.3. Thử nghiệm khả năng sống của tế bào

Các tế bào được gieo vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 2 × 10⁴ tế bào/giếng và được ủ ở 37 °C trong điều kiện 5% CO₂. Sau đó, tế bào được xử lý bằng các nồng độ chiết xuất khác nhau, dao động từ 12,5 đến 1000 µg/mL. Sau 24 giờ ủ ở 37 °C, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và 100 µL dung dịch MTT (0,5 mg/mL) được bổ sung vào mỗi giếng, tiếp tục ủ trong 3 giờ. Tiếp theo, dung dịch trong các giếng được hút bỏ và 100 µL DMSO được thêm vào để hòa tan các tinh thể formazan hình thành. Giá trị hấp thụ quang học được đo bằng máy đọc vi phiến tại các bước sóng 570 nm và 630 nm (Kehinde et al., 2021). Khả năng sống sót của tế bào có và không xử lý chiết xuất được biểu thị dưới dạng phần trăm khả năng sống sót, được tính theo công thức: Khả năng sống sót của tế bào (%) = (Độ hấp thụ trung bình của tế bào xử lý / Độ hấp thụ trung bình của tế bào không xử lý) × 100.

2.4. Bảo quản tôm thẻ chân trắng

2.4.1. Điều tra điều kiện bảo quản tôm

Tôm thẻ chân trắng được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch chiết xuất P. frutescens ở ba nồng độ khác nhau (0,1; 0,25 và 0,5% w/v, pha trong nước khử ion), với tỷ lệ tôm/dung dịch là 1:2 (w/v) trong 30 phút ở nhiệt độ 32 ± 3 °C (Phan, Bui, Doan, Nguyen & Ly, 2021). Các mẫu tôm sau xử lý lần lượt được ký hiệu là PF-E-1, PF-E-2 và PF-E-3. Để so sánh, tôm được ngâm riêng biệt trong dung dịch sodium metabisulfite (SMS) 1,25% (w/v) và trong nước khử ion trong cùng khoảng thời gian 30 phút (Do, Bui & Phan, 2022). Sau xử lý, các mẫu tôm được bảo quản ở 1–3 °C trong vòng 8 ngày. Trong suốt thời gian bảo quản, các chỉ tiêu bao gồm sự phát triển của hiện tượng nhiễm sắc tố đen, quá trình peroxy hóa lipid, mật độ vi sinh vật, giá trị pH và hàm lượng axit amin được theo dõi và đánh giá hằng ngày.

2.4.2. Sự phát triển của bệnh tăng sắc tố da

Trong suốt quá trình bảo quản, sự phát triển của hiện tượng nhiễm sắc tố đen hoặc sự xuất hiện các đốm đen trên bề mặt tôm sau xử lý được ghi nhận thông qua chụp ảnh bằng máy ảnh có độ phân giải cao và điều kiện chiếu sáng cố định. Sự khác biệt màu sắc (∆E) của mô cơ tôm được xác định theo công thức do Park và cộng sự (1994) đề xuất; phương trình chi tiết dùng để tính toán giá trị ∆E được trình bày trong phần dữ liệu bổ sung. Đối với mỗi mẫu, hai hình ảnh được chụp tại mặt trước và mặt sau của phần bụng tôm, và giá trị ∆E trung bình được tính toán dựa trên ba cá thể tôm cho mỗi nghiệm thức.

2.4.3. Đo lường sự thay đổi độ pH, quá trình peroxy hóa lipid, số lượng vi sinh vật, tổng lượng nitơ bazơ dễ bay hơi (TVB-N) và cấu trúc sản phẩm

Giá trị pH của các mẫu tôm được xác định bằng máy đo pH kỹ thuật số theo quy trình đã được mô tả trước đó (Nirmal & Benjakul, 2011). Quá trình peroxy hóa lipid được đánh giá thông qua hàm lượng malondialdehyde (MDA) theo phương pháp của Singh và Arora (2007). Hàm lượng MDA được biểu thị bằng mg tương đương MDA trên mỗi kg thịt tôm (mg MDA/kg) và được tính từ giá trị trung bình của ba lần đo lặp lại.

Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong các mẫu tôm được xác định theo tiêu chuẩn TCVN 4884–1:2015. Hàm lượng TVB-N trong thịt tôm được phân tích theo phương pháp đã được báo cáo bởi Botta và cộng sự (1984), với kết quả được biểu thị bằng mg nitơ (N) trên 100 g thịt tôm.

Độ cứng của các mẫu tôm được đo bằng máy phân tích kết cấu TMS-Pro (FTC, Sterling, VA, USA) theo quy trình đã được công bố (Zhang et al., 2015). Các phép đo độ cứng được thực hiện tại ba vị trí gồm đầu, bụng và đuôi tôm, và mỗi phép đo được lặp lại ba lần.

2.5. Phân tích thống kê

Dữ liệu được kiểm tra phân bố chuẩn và tính đồng nhất của phương sai trước khi phân tích phương sai (ANOVA) và phân tích hậu kiểm bằng phép thử khoảng đa bội Duncan. Phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (IBM, Hoa Kỳ) được sử dụng để phân tích dữ liệu, và sự khác biệt giữa các giá trị trung vị được coi là có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05.

…Còn tiếp…

Theo Quy Van Nguyen , Dao Thi Anh Phan

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2772753X25003223

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm: