Phần 1: Ảnh Hưởng Của Bột Hoa Cúc Tím (Echinacea purpurea) Trong Khẩu Phần Ăn Đến Sự Tăng Trưởng, Tỷ Lệ Sống, Hệ Thống Miễn Dịch Chống Oxy Hóa Và Khả Năng Chống Chịu Các Tác Động Từ Môi Trường Ở Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei

Tóm tắt

Các chất phụ gia thức ăn có nguồn gốc thực vật đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nuôi tôm nhằm cải thiện tăng trưởng, tăng cường miễn dịch và nâng cao khả năng chống chịu stress. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của bột Echinacea purpurea (EPP) bổ sung vào khẩu phần ăn đối với hiệu suất tăng trưởng, phản ứng miễn dịch và chống oxy hóa, biểu hiện các gen liên quan đến miễn dịch, cũng như khả năng chống chịu stress môi trường của tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei). Tôm được cho ăn bốn khẩu phần thử nghiệm chứa 0% (đối chứng), 2,5%, 5% và 10% EPP trong thời gian 68 ngày. Kết quả cho thấy tôm được bổ sung 5% và 10% EPP đạt mức tăng trọng cao hơn đáng kể và hệ số chuyển đổi thức ăn thấp hơn so với nhóm đối chứng, trong khi tỷ lệ sống không có sự khác biệt giữa các nghiệm thức. Việc bổ sung EPP trong khẩu phần ăn làm tăng đáng kể hoạt tính của các enzyme chống oxy hóa, bao gồm superoxide dismutase và glutathione peroxidase, đồng thời nâng cao hoạt tính lysozyme, hàm lượng protein và albumin trong huyết dịch, tổng số tế bào máu, cũng như tỷ lệ tế bào máu bán hạt và hạt lớn. Mức cải thiện rõ rệt và ổn định nhất của các chỉ tiêu này được ghi nhận ở nghiệm thức bổ sung 5% EPP. Ngoài ra, EPP còn làm tăng biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch như α2-M, integrin β, PX, LGBP và proPO1 trong tuyến tụy gan, đặc biệt ở các mức bổ sung 2,5% và 5%. Sau khi tiếp xúc với các điều kiện stress do pH thấp, pH cao và nhiệt độ lạnh, tôm được cho ăn khẩu phần có bổ sung EPP cho tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Các kết quả thu được cho thấy việc bổ sung EPP vào khẩu phần ăn có thể cải thiện hiệu quả tăng trưởng, tăng cường chức năng miễn dịch và nâng cao khả năng chống chịu stress của tôm L. vannamei. Trong điều kiện nghiên cứu này, mức bổ sung 5% EPP được xác định là liều lượng mang lại hiệu quả và tính thực tiễn cao nhất.

1. Giới thiệu

Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những ngành sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất trên thế giới. Trong đó, tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài được nuôi chủ lực trong các hệ thống nuôi tôm thâm canh, với sản lượng đạt khoảng 6,8 triệu tấn. Sự phổ biến của loài này bắt nguồn từ tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau và giá trị kinh tế cao (FAO, 2024; Liang và cộng sự, 2022; Reis và cộng sự, 2020; Verdegem và cộng sự, 2023). Tuy nhiên, hoạt động nuôi thâm canh thường phải đối mặt với nhiều yếu tố gây căng thẳng môi trường như chất lượng nước không ổn định, mật độ nuôi cao, cùng sự biến động của nhiệt độ và pH. Những yếu tố này có thể làm suy giảm chức năng miễn dịch của tôm và gia tăng nguy cơ mắc các bệnh truyền nhiễm, bao gồm các bệnh do Vibrio spp. và virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) (Bhassu và cộng sự, 2024; Lee và cộng sự, 2022). Vì vậy, tăng cường khả năng miễn dịch và sức chống chịu với các yếu tố gây căng thẳng thông qua các giải pháp bền vững đã trở thành một trong những mục tiêu quan trọng của nuôi trồng thủy sản hiện đại.

Trong bối cảnh đó, điều hòa miễn dịch thông qua các chất phụ gia thức ăn chức năng đang được xem là một hướng tiếp cận đầy tiềm năng và thân thiện với môi trường nhằm giảm nguy cơ dịch bệnh trên tôm nuôi. Đặc biệt, các sản phẩm có nguồn gốc thực vật và những hợp chất hoạt tính sinh học tự nhiên ngày càng thu hút sự quan tâm nhờ đặc tính kích thích miễn dịch, chống oxy hóa và hỗ trợ tăng trưởng. Bên cạnh đó, các hợp chất này còn có khả năng phân hủy sinh học cao và ít nguy cơ gây hiện tượng kháng kháng sinh hơn so với các loại hóa dược tổng hợp (Babanejad-Abkenar và cộng sự, 2025; Baniesmaeili và cộng sự, 2023; Eslami và cộng sự, 2025; Niroomand và cộng sự, 2024). Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy các chất phụ gia có nguồn gốc thực vật có thể nâng cao khả năng miễn dịch bẩm sinh, tăng cường hệ thống chống oxy hóa và cải thiện khả năng chống chịu stress ở tôm và cá, từ đó góp phần nâng cao tính bền vững của hoạt động sản xuất thủy sản (Ashour và cộng sự, 2024; Mansour và cộng sự, 2022).

Echinacea purpurea (hoa cúc tím) là một loài dược liệu được biết đến rộng rãi nhờ các đặc tính điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa và kháng khuẩn. Các hoạt tính sinh học của loài cây này được cho là bắt nguồn từ sự hiện diện của nhiều nhóm chất chuyển hóa thứ cấp khác nhau, bao gồm alkylamide, các dẫn xuất axit caffeic (chẳng hạn như axit chicoric), polysaccharide, glycoprotein, flavonoid và phytosterol (Attarzadeh và cộng sự, 2020; Qayumovich, 2022). Trong số đó, axit chicoric đã được chứng minh có khả năng tăng cường hoạt động của các tế bào miễn dịch và thúc đẩy phản ứng của các enzyme chống oxy hóa ở sinh vật thủy sinh, bao gồm cả tôm (Huo và cộng sự, 2022; Faghih và cộng sự, 2023). Việc bổ sung E. purpurea vào khẩu phần ăn đã được ghi nhận giúp cải thiện tăng trưởng, tăng cường đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng kháng bệnh ở nhiều loài cá (Aly và Mohamed, 2010; Oskoii và cộng sự, 2012; Pourgholam và cộng sự, 2013; Rahman và cộng sự, 2018; Guz và cộng sự, 2025), đồng thời cũng cho thấy những tác động tích cực nhất định ở tôm (Medina-Beltrán và cộng sự, 2012).

Mặc dù đã có nhiều kết quả khả quan, các nghiên cứu đánh giá toàn diện về việc sử dụng bột E. purpurea trong dinh dưỡng tôm vẫn còn hạn chế, đặc biệt liên quan đến ảnh hưởng phụ thuộc liều lượng đối với tăng trưởng, tình trạng miễn dịch – chống oxy hóa, biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch và khả năng chống chịu trước các tác nhân gây stress từ môi trường. Bên cạnh đó, các cơ chế phân tử liên quan đến tác dụng điều hòa miễn dịch của E. purpurea ở tôm vẫn chưa được làm sáng tỏ.

Để giải quyết những thiếu sót này, nghiên cứu hiện tại đã kiểm chứng giả thuyết rằng việc bổ sung bột E. purpurea (EPP) vào khẩu phần ăn sẽ tăng cường hiệu quả tăng trưởng, khả năng miễn dịch, khả năng chống oxy hóa và khả năng chống chịu stress ở tôm L. vannamei theo liều lượng nhất định. Tôm được cho ăn các khẩu phần có chứa các mức EPP khác nhau, và hiệu suất tăng trưởng, các thông số miễn dịch và chống oxy hóa trong dịch máu, các chỉ số huyết học, biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch quan trọng ở gan tụy, cụ thể là α2-macroglobulin (α2-M), protein liên kết β-1,3-glucan (LGBP), integrin β, peroxinectin (PX) và prophenoloxidase (proPO1), và tỷ lệ sống sót dưới các thách thức stress pH và nhiệt độ cấp tính đã được đánh giá. Phương pháp tiếp cận tích hợp này cung cấp những hiểu biết mới về ứng dụng chức năng và mức độ bổ sung tối ưu của E. purpurea như một chất phụ gia thức ăn có nguồn gốc thực vật trong nuôi trồng tôm.

2. Chuẩn bị nghiên cứu

2.1. Chuẩn bị thức ăn

Cây E. purpurea được thu mua từ một công ty được chứng nhận tại Iran (Tập đoàn Arman Sabz Adineh). Sau khi được làm sạch, nguyên liệu được phơi trong bóng râm ở nhiệt độ phòng trong hai tuần nhằm hạn chế sự phân hủy của các hợp chất hoạt tính. Mẫu sau khi sấy khô được nghiền thành bột bằng máy xay điện và sàng qua rây 60 mắt lưới để thu được kích thước hạt đồng nhất (Miroshina và Poznyakovskiy, 2023). Thành phần hóa học cơ bản của bột E. purpurea bao gồm độ ẩm, protein thô, carbohydrate, lipid thô và tổng tro được xác định theo các phương pháp chuẩn của AOAC (2000) (Bảng 1). Các hợp chất chuyển hóa chính trong bột E. purpurea được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS). Quá trình phân tích được thực hiện trên hệ thống sắc ký khí Agilent 7890A kết hợp với đầu dò khối phổ chọn lọc mạng 5975C (Agilent Technologies, Hoa Kỳ). Kết quả xác định sự hiện diện của nhiều hợp chất thực vật như phytol, neophytadiene, γ-sitosterol, vitamin E và nhiều hợp chất khác (Bảng 2).

Bảng 1. Thành phần của bột Echinacea purpurea (EPP).

Bảng 2. Các chất chuyển hóa của bột Echinacea purpurea (EPP) thu được từ phân tích GC-MS.

*Các cột mao dẫn có độ phân cực cao đã được sử dụng để tách các hợp chất này.

Bốn khẩu phần thức ăn thí nghiệm được xây dựng với các mức bổ sung EPP khác nhau, gồm 0% (đối chứng), 2,5% (EPP2.5), 5% (EPP5) và 10% (EPP10) (Bảng 3). Các khẩu phần này được sản xuất tại nhà máy thức ăn Hormoz Dam, nằm ở Eisin, tỉnh Hormozgan, Iran. Trước khi phối trộn, toàn bộ nguyên liệu được nghiền mịn và sàng qua rây có kích thước 50 µm. Hỗn hợp sau đó được ép thành viên bằng máy ép viên thức ăn (Maxima TYPE Y1000, Trung Quốc) để tạo viên nén nguội có đường kính 3,2 mm (Van Wyk và Scarpa, 1999). Các viên thức ăn sau khi chế biến được trải đều trên bàn nhựa và làm khô ở nhiệt độ phòng, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ −20°C cho đến khi sử dụng.

Bảng 3. Thành phần của khẩu phần ăn thử nghiệm được bổ sung các liều lượng khác nhau của bột hoa cúc tím Echinacea purpurea (EPP) để nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

1. Permix (Công ty Daniran Shiraz): vitamin (A, D3, E, K3-Stab, B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12, H2, C-Stay), inositol, L -carnitine, lysine, methionine, chất chống oxy hóa, phosphate, betaine, multi-enzyme, sắt, kẽm, selen, coban, đồng, mangan và iốt.

2.2. Tôm thí nghiệm và thức ăn

Tổng cộng 600 con tôm có khối lượng trung bình 3,8 ± 0,5 g được phân bổ ngẫu nhiên vào bốn nghiệm thức thức ăn. Nghiệm thức đối chứng được cho ăn khẩu phần cơ bản không bổ sung EPP, trong khi ba nghiệm thức còn lại được bổ sung EPP ở các mức 2,5%, 5% và 10%. Mỗi nghiệm thức gồm 150 con tôm, được nuôi trong ba bể sợi thủy tinh hình tròn dung tích 300 L với mật độ 50 con/bể, tương ứng ba lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Sau giai đoạn thích nghi kéo dài hai tuần với khẩu phần cơ bản, tôm được cho ăn các khẩu phần thí nghiệm trong thời gian 68 ngày.

Chất lượng nước được duy trì thông qua việc thay 50% lượng nước mỗi ngày. Tôm được cho ăn ba lần/ngày vào các thời điểm 8:00, 14:00 và 20:00, với lượng thức ăn tương đương 5% trọng lượng cơ thể. Khẩu phần ăn được điều chỉnh hai tuần một lần dựa trên tổng sinh khối của tôm trong từng bể. Các chỉ tiêu môi trường nước được theo dõi thường xuyên và duy trì ở mức ổn định, bao gồm nhiệt độ 28 ± 2°C, oxy hòa tan 6,5 ± 0,5 mg/L, pH 7,5 và độ mặn 35 ± 1 g/L.

Nghiên cứu được thực hiện theo các tiêu chuẩn đạo đức do Hiệp hội Phòng chống Bạo hành Động vật Iran ban hành. Trước khi lấy mẫu, tôm được nhịn ăn trong 24 giờ và được gây chết bằng phương pháp ngâm trong nước muối lạnh (< 2°C). Sau đó, trọng lượng cơ thể và chiều dài toàn thân của tôm được xác định theo quy trình đã được mô tả bởi Eslami và cộng sự (2025). Mẫu dịch máu và tuyến tụy được thu thập từ ba cá thể trong mỗi bể để phục vụ các phân tích sinh hóa và đánh giá biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch.

2.3. Các thông số hiệu suất tăng trưởng

Các chỉ số tăng trưởng được tính toán như sau:

Tăng cân (WG, g) = Wf – Wi

Tổng chiều dài tăng thêm (TLI, mm) = Lf – Li

Tốc độ tăng trưởng riêng (SGR, %/ngày) = 100 × (ln Wf − ln Wi) / t

Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) = Lượng thức ăn tiêu thụ (g) / Tăng trọng lượng (g)

Tỷ lệ sống (SR, %) = 100 × (Nt / Ni)

Trong đó:

Wi = Trọng lượng ban đầu,

Wf = Trọng lượng cuối cùng,

Li = Chiều dài ban đầu,

Lf = Chiều dài cuối cùng,

t = Thời gian thử nghiệm cho ăn (ngày),

Ni = Số lượng tôm ban đầu,

Nt = Số lượng tôm sống cuối cùng.

2.3.1. Phân tích sinh hóa và huyết học dịch máu

Vào cuối giai đoạn thí nghiệm cho ăn, dịch máu được thu từ ba con tôm trong mỗi bể theo phương pháp của Su và cộng sự (2022). Các mẫu sau đó được ly tâm ở tốc độ 5000 ×g trong 10 phút ở 4°C nhằm tách huyết tương khỏi các tế bào máu. Các chỉ tiêu sinh hóa và chống oxy hóa được xác định theo các quy trình tiêu chuẩn được mô tả bởi Ferrell và cộng sự (1992) và Zabolinia và cộng sự (2024).

Nồng độ protein toàn phần và albumin trong huyết tương được xác định bằng các bộ kit thương mại (Pars Azmoon, Iran). Protein toàn phần được định lượng dựa trên phản ứng đo màu liên kết đồng ở bước sóng 540 nm, trong khi albumin được xác định bằng phản ứng với bromocresol green và đo độ hấp thụ ở 600 nm. Hoạt tính lysozyme được đánh giá bằng phương pháp đo độ đục sử dụng huyền phù Micrococcus luteus, với độ hấp thụ được ghi nhận tại bước sóng 530 nm ở phút thứ nhất và phút thứ năm. Hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) và glutathione peroxidase (GPX) được xác định bằng bộ kit ZellBio, với độ hấp thụ được đo lần lượt ở 420 nm và 340 nm. Hoạt tính catalase (CAT) được xác định bằng phương pháp quang phổ theo Miller và Rice-Evans (1996), sử dụng bộ kit ZellBio.

Tổng số tế bào máu được xác định bằng buồng đếm tế bào dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400×. Số lượng các loại tế bào máu, bao gồm tế bào máu hạt, tế bào máu bán hạt và tế bào máu trong suốt, được xác định trên các tiêu bản cố định bằng methanol và nhuộm May–Grünwald–Giemsa, sau đó quan sát dưới kính hiển vi quang học.

2.4. Biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch

Mô gan tụy từ năm cá thể tôm ở mỗi nghiệm thức được bảo quản trong dung dịch RNAlater. RNA tổng số được chiết xuất từ 50–100 mg mô bằng bộ kit thương mại dựa trên cột (Dana Zist Asia, Iran) với một số điều chỉnh nhỏ trong quy trình thực hiện. DNA nhiễm tạp được loại bỏ bằng cách xử lý với DNase I (Fermentas, Hoa Kỳ). Nồng độ và chất lượng RNA được đánh giá bằng máy quang phổ NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) và kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. cDNA sợi đơn được tổng hợp từ 1 µg RNA tổng số bằng bộ kit ExcelRT™ Reverse Transcriptase (SMOBio, Đài Loan). Phân tích biểu hiện của năm gen liên quan đến miễn dịch (α2-M, integrin β, PX, LGBP và proPO1) được thực hiện bằng kỹ thuật PCR định lượng thời gian thực, sử dụng β-actin (Akbarzadeh và cs., 2019) làm gen tham chiếu. Các phản ứng được tiến hành trên hệ thống ABI StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) với thể tích phản ứng cuối cùng là 10 µL, bao gồm 5 µL Ampliqon 2× SYBR Green High ROX Master Mix, 0,2 µL mỗi mồi và 2 µL cDNA. Chương trình nhiệt gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 95°C trong 15 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ với các bước: 94°C trong 15 giây, 59°C trong 40 giây và 72°C trong 20 giây. Phân tích đường cong nóng chảy được thực hiện trong khoảng nhiệt độ từ 65°C đến 95°C với mức tăng 0,3°C mỗi bước. Tất cả các phản ứng được tiến hành với ba lần lặp lại kỹ thuật. Mức độ biểu hiện gen tương đối được xác định theo phương pháp 2^–ΔΔCt (Livak và Schmittgen, 2001). Giá trị ΔCt được tính bằng hiệu số giữa Ct của gen mục tiêu và Ct của gen tham chiếu β-actin. Giá trị ΔΔCt được xác định bằng cách so sánh ΔCt của từng mẫu với ΔCt của nhóm đối chứng, được sử dụng làm mẫu chuẩn. Trình tự các cặp mồi được trình bày trong Bảng 4.

Bảng 4. Chi tiết các cặp mồi được sử dụng để phân tích biểu hiện gen ở tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) trong nghiên cứu này.

2.5. Thách thức về độ pH và nhiệt độ thấp

Sau khi kết thúc giai đoạn cho ăn thử nghiệm, tôm được đưa vào ba điều kiện gây stress môi trường gồm pH thấp (4,5), pH cao (9,5) và nhiệt độ thấp (4 °C). Các điều kiện này được sử dụng như những thử nghiệm thách thức cấp tính trong môi trường phòng thí nghiệm được kiểm soát nhằm đánh giá khả năng chống chịu stress cực đoan và sức sống sinh lý tương đối của tôm sau khi được bổ sung các chế độ ăn khác nhau. Các mức pH và nhiệt độ được lựa chọn không nhằm mô phỏng điều kiện nuôi thực tế mà được sử dụng như những tác nhân gây stress cường độ cao trong các thử nghiệm thách thức trên động vật giáp xác. Mục đích là tạo ra các rối loạn sinh lý có thể đo lường được mà không gây tử vong ngay lập tức cho đối tượng thí nghiệm (Lignot và cộng sự, 2000; Pan và cộng sự, 2005; Zabolinia và cộng sự, 2024; Babanejad-Abkenar và cộng sự, 2025).

Đối với mỗi tác nhân gây stress, 30 con tôm của mỗi nhóm được phân bổ ngẫu nhiên vào ba bể thí nghiệm, với mật độ 10 con/bể. Stress pH thấp được gây ra bằng cách bổ sung dần axit clohydric vào nước cho đến khi đạt pH 4,5, với tốc độ giảm 1 đơn vị pH mỗi giờ. Ngược lại, stress pH cao được tạo ra bằng cách bổ sung dần natri hydroxit cho đến khi pH nước đạt 9,5, với tốc độ tăng 0,5 đơn vị pH mỗi giờ. Stress nhiệt độ thấp được mô phỏng bằng cách thêm đá vào bể nhằm hạ nhiệt độ nước xuống 4°C, với tốc độ giảm 2°C mỗi giờ. Tôm được duy trì trong mỗi điều kiện pH và nhiệt độ trong thời gian 24 giờ. Tỷ lệ sống và tỷ lệ chết được ghi nhận trong suốt thời gian tiếp xúc 24 giờ đối với từng điều kiện gây stress.

Tỷ lệ sống được tính bằng công thức sau: Tỷ lệ sống (%) = 100 × (Số lượng tôm ban đầu − Số lượng tôm chết) / Số lượng tôm ban đầu

2.6. Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu đều được kiểm tra tính chuẩn tắc bằng phép thử Kolmogorov–Smirnov. Sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng phân tích phương sai một chiều (ANOVA) tiếp theo là phép thử hậu kiểm Tukey. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS phiên bản 24, và các biểu đồ được tạo bằng phần mềm SigmaPlot phiên bản 11. Mức ý nghĩa được xem xét ở P < 0,05.

…Còn tiếp… 

Theo Morteza Raoofi, Arash Akbarzadeh, Ahmad Noori, Mohammad Niroomand, Leila Abdoli

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513426002620?fr=RR-2&ref=pdf_download&rr=a0d6c3147981f8e4

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Nuôi Cá Rô Phi Lai Trong Hệ Thống Sản Xuất Sinh Học Ngoài Trời
• Nồng Độ Nitrat Cao Gây Độc Cho Tôm
• Glutamate Tăng Cường Khả Năng Kháng Khuẩn Của Tôm Bằng Cách Tăng Cường Khả Năng Miễn Dịch Tế Bào Của Tôm