Phân tích các cơ chế phân tử thích nghi để đáp ứng với độ mặn thấp ở tuyến râu của cua bùn, Scylla paramamosain

Tóm tắt

Cua bùn (Scylla paramamosain), một loài thủy sản quan trọng, là đối tượng lý tưởng để nghiên cứu cơ chế điều hòa thẩm thấu ở động vật giáp xác. Trong khi các nghiên cứu trước đây tập trung vào vai trò của mang, nghiên cứu này khám phá chức năng của tuyến râu. Phân tích phiên mã so sánh cho thấy tuyến râu của cua sống lâu dài ở độ mặn thấp đã kích hoạt các con đường điều hòa ion quan trọng, bao gồm “thu hồi bicarbonate ống lượn gần” và “hấp thụ khoáng chất”. Điều này thể hiện qua sự tăng cường tái hấp thu ion, liên quan đến sự gia tăng biểu hiện của các gen vận chuyển ion như NKA, CA-c, VPA và NHE, cùng với các gen chuyển hóa năng lượng MDH, SLC25 và PEPCK. Hoạt tính tăng cao của enzyme NKA và CA-c đã xác nhận kết quả này. Sự thâm nhập của nước ngoài và tăng bài tiết nước tiểu, thể hiện qua độ thẩm thấu và nồng độ ion hemolymp giảm, cũng như lòng mê đạo và mao mạch hemolymp mở rộng trong tuyến râu, giải thích nhu cầu tái hấp thu ion tăng cường. Thử nghiệm độ mặn thấp kéo dài 96 giờ với các thời điểm lấy mẫu khác nhau đã khẳng định các kết quả trên. Nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết quan trọng về vai trò của tuyến râu trong điều hòa thẩm thấu ở cua bùn. Thông tin này có thể ứng dụng để cải thiện điều kiện nuôi trồng và nâng cao khả năng chịu đựng của cua bùn đối với stress do độ mặn. Các gen và con đường liên quan đến điều hòa thẩm thấu có tiềm năng trở thành mục tiêu cho các chương trình chọn giống, nhằm phát triển các giống cua bùn thích nghi tốt hơn với môi trường nuôi trồng.

Giới thiệu

Độ mặn là một yếu tố môi trường phi sinh học, tác động trực tiếp ảnh hưởng đến các quá trình sinh học cơ bản của nhiều loài giáp xác thủy sinh. Sự biến động đột ngột của độ mặn có thể gây ra những rối loạn nghiêm trọng trong quá trình điều hòa thẩm thấu, dẫn đến suy giảm tăng trưởng, ức chế hệ miễn dịch và thậm chí chết hàng loạt. Do đó, việc giám sát và quản lý độ mặn là một trong những yếu tố cốt lõi trong nuôi trồng giáp xác. Trong bối cảnh biến đổi khí hậu và đô thị hóa ven biển ngày càng gia tăng, thách thức đối với việc kiểm soát độ mặn trong nuôi trồng thủy sản nói chung và giáp xác nói riêng trở nên cấp bách hơn bao giờ hết.

Ở cấp độ sinh lý, độ mặn ảnh hưởng chủ yếu đến quá trình điều hòa thẩm thấu. Nhiều loài giáp xác đã tiến hóa cơ chế thích nghi với sự biến động của độ mặn thông qua các điều chỉnh sinh lý và sinh hóa phức tạp, bao gồm điều hòa nội tiết, cân bằng ion và tái cấu trúc quá trình trao đổi chất. Quá trình điều hòa thẩm thấu được thực hiện chủ yếu qua các cơ quan hô hấp như mang và tuyến râu, nhằm duy trì sự cân bằng ổn định giữa nồng độ muối trong cơ thể và môi trường xung quanh.

Mang, đặc biệt là vùng sau, là nơi chính trao đổi khí, điều hòa thẩm thấu và điều hòa ion và là cơ quan điều hòa thẩm thấu chính ở giáp xác. Người ta cho rằng mang có khả năng điều hòa nhanh chóng độ thẩm thấu hemolymp bằng cách thay đổi kiểu biểu hiện của các gen ứng viên tiềm ẩn để chịu được những biến động lớn về độ mặn. Khi độ mặn thay đổi, các gen ứng viên sẽ phản ứng ngay lập tức bằng cách thay đổi kiểu biểu hiện của chúng để chống lại những tác động bất lợi của nó.

Tuyến râu, còn được gọi là tuyến xanh cơ quan bài tiết đặc trưng của giáp xác, đóng vai trò trung tâm trong việc duy trì cân bằng nội môi, cụ thể là điều hòa thẩm thấu. Cấu trúc của tuyến râu, bao gồm mê đạo và khoang cơ thể, tương đồng đáng kể với thận động vật có vú. Các nghiên cứu trước đây đã xác định ít nhất hai loại tế bào chính trong tuyến râu: tế bào khoang cơ thể (COE) và tế bào mê đạo (LBR), cả hai đều đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển ion. Khả năng thích ứng với môi trường đa dạng của giáp xác, đặc biệt là cua, có liên quan mật thiết đến chức năng của tuyến râu. Cơ quan này không chỉ tham gia vào việc điều hòa nồng độ các ion như Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl⁻ và HCO₃⁻ mà còn đóng vai trò trong việc bài tiết chất thải và duy trì cân bằng nước. Các nghiên cứu trên cua Dungeness (Cancer magister) và cua violin (Ocypode quadrata) đã chỉ ra rằng tuyến râu có khả năng vận chuyển ion tích cực cả theo hướng tái hấp thu và bài tiết. Các enzyme quan trọng như carbonic anhydrase (CA) và Na⁺/K⁺-ATPase (NKA) đóng vai trò trung tâm trong quá trình vận chuyển ion này. Tuy nhiên, do kích thước nhỏ và khó lấy mẫu, việc nghiên cứu chi tiết về hình thái và chức năng của tuyến râu ở các loài cua brachyuran vẫn còn nhiều hạn chế.

Cua bùn (Scylla paramamosain), một loài giáp xác euryhaline, sinh sống phổ biến tại các vùng cửa sông ở Đông Nam Á với độ mặn dao động từ 5-33‰. Loài cua này được nuôi trồng rộng rãi ở các vùng ven biển Đông Nam Trung Quốc nhờ khả năng thích nghi cao với các biến động độ mặn. Chính khả năng chịu đựng vượt trội này đã khiến S. paramamosain trở thành một mô hình nghiên cứu lý tưởng để làm sáng tỏ cơ chế điều hòa thẩm thấu ở động vật giáp xác. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá vai trò của tuyến râu trong quá trình điều hòa nội môi khi đối mặt với các thay đổi về độ mặn. Cụ thể, chúng tôi sẽ so sánh các chỉ số mô học, hoạt tính enzyme liên quan đến thẩm thấu và biểu hiện gen ở các cá thể cua được nuôi dưỡng lâu dài trong môi trường nước lợ và các cá thể bị stress độ mặn ngắn hạn.

Chuẩn bị nghiên cứu

Cua và thu thập mẫu cua

Chuẩn bị mẫu vật: Nghiên cứu này sử dụng cua bùn Scylla paramamosain trưởng thành (n = 12, khối lượng trung bình 100,0 ± 5,0 g) để xây dựng thư viện cDNA và phân tích biểu hiện gen liên quan đến khả năng thích nghi với độ mặn. Cua được thu thập từ hai quần thể tự nhiên: một quần thể thích nghi với độ mặn cao (23‰) tại Hạ Môn và một quần thể thích nghi với độ mặn thấp (5‰) tại Từ Hi, cả hai đều nằm ở Trung Quốc.

Thiết kế thí nghiệm: Thí nghiệm độ mặn thấp cấp tính được thực hiện trên 120 cá thể cua trưởng thành thu thập từ quần thể 23‰. Cua được nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm ổn định (nhiệt độ 24 ± 1°C, pH 7.2, DO 6 ± 0.5 mg/L) và cho ăn thịt ngao hai lần mỗi ngày trong 14 ngày để thích nghi. Sau đó, một nửa số cua được chuyển đột ngột từ môi trường 23‰ sang 5‰, trong khi nửa còn lại được duy trì ở 23‰ làm đối chứng. Mẫu mô được thu thập tại các thời điểm 0, 3, 6, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ để phân tích biểu hiện gen.

Điều kiện nuôi: Tất cả các bể nuôi đều được trang bị hệ thống sục khí và thay nước biển nhân tạo có độ mặn được kiểm soát định kỳ.

Thiết kế thử nghiệm là thực hiện RNAseq trên các mẫu dài hạn, sau đó tiến hành thí nghiệm căng thẳng độ mặn cấp tính trên cua 23‰ trong nhóm đối chứng thử nghiệm dài hạn để phát hiện các chỉ số sinh lý, sinh hóa và biểu hiện mRNA. Tuyến râu nằm ở gốc cuống mắt gần chỗ chèn của râu thứ hai, mặt trên của dạ dày, dưới dạng 1 cặp túi hình bầu dục, mở ra ở gốc râu thứ hai, bao gồm một tuyến và một bàng quang. Để thu thập mẫu, cua được gây mê bằng đá trong 5 phút, sau đó tiến hành phẫu thuật. Cụ thể, chúng tôi cắt bỏ lớp vỏ lưng, loại bỏ mô dạ dày và xác định vị trí tuyến râu. Tiếp theo, tuyến râu được tách khỏi cơ thể bằng kẹp. Đối với mỗi nhóm, toàn bộ tuyến râu của mỗi con cua được chỉ định để chiết xuất RNA, chiết xuất protein và nghiên cứu vi mô, và máu được lấy ra để đo độ thẩm thấu. Tất cả các loài động vật đều được xử lý theo các quy trình chuẩn của Hướng dẫn sử dụng động vật thí nghiệm của Đại học Ninh Ba.

Xây dựng và phân tích phiên mã

Tổng RNA (hơn 2 μg) được chiết xuất từ tuyến râu của từng cá thể cua theo phương pháp Du et al. Sau khi làm giàu và tinh sạch bằng hạt từ tính oligo(dT), cDNA sợi đầu tiên được tổng hợp bằng phiên mã ngược, sử dụng hỗn hợp các đoạn mồi ngẫu nhiên và đoạn mồi đặc hiệu oligo(dT) để bắt cặp với các phân tử mRNA. cDNA sợi thứ hai được tổng hợp bằng DNA Polymerase I và RNase H, tạo ra cDNA kép sợi đầy đủ. Thư viện cDNA sau khi tinh sạch và khuếch đại bằng PCR đã được giải trình tự trên nền tảng BGISEQ-500 (BGI, Thâm Quyến, Trung Quốc) với chiều dài đọc cặp là 100 bp.

Các đoạn đọc sạch chất lượng cao được tạo ra bằng cách loại bỏ các bộ điều hợp, trình tự chất lượng thấp (<Q20) và trình tự ngắn hơn 50 bp của dữ liệu thô RNA-Seq bằng Solexa QA. Phân tích biểu hiện gen khác biệt được so sánh từng cặp bằng DESeq2 sau khi căn chỉnh các đoạn đọc RNA-Seq sạch vào bộ gen của S. paramamosain (GWHALOH00000000) bằng gói HISAT2. Một gen có giá trị P đã điều chỉnh nhỏ hơn 0,05 và thay đổi gấp lớn hơn 2 được định nghĩa là một gen biểu hiện khác biệt. Chú thích gen được thực hiện bằng cơ sở dữ liệu của NR, GO và KEGG. Sau đó, làm giàu GO và làm giàu KEGG của các bản sao biểu hiện khác biệt được phân tích bằng R ClusterProfiler 4.0 với giá trị P là 0,05.

Phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (RT-qPCR)

Mười hai DEG trong bản phiên mã đã được chọn để xác minh bằng qRT-qPCR nhằm khẳng định độ tin cậy của kết quả bản phiên mã. Các mẫu tương tự đã được sử dụng cho cả giải trình tự BGISEQ-500 và xác nhận qRT-PCR. Tổng RNA được chiết tách từ tuyến râu của các mẫu nghiên cứu bằng thuốc thử TRIzol, sau đó được định lượng và kiểm tra độ nguyên vẹn bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 và điện di gel agarose. Từ 2 μg RNA nguyên chất, cDNA đã được tổng hợp sử dụng bộ kit PrimerScript™ RT với gDNA Eraser. Phản ứng qRT-PCR được thực hiện trên hệ thống ABI 7500 với các điều kiện nhiệt chu kỳ như sau: Mỗi mẫu được chạy ba lần lặp lại độc lập và mỗi phản ứng được lặp lại ba lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Hiệu suất khuếch đại của các đường chuẩn cho từng gen nằm trong khoảng 95-105% với hệ số tương quan R² > 0,98. Biểu hiện tương đối của gen mục tiêu được tính toán bằng phương pháp 2^−ΔΔCq, sử dụng gen nội bào β-actin của S. paramamosain làm gen tham chiếu.

Đo độ thẩm thấu và nồng độ ion

Đối với mỗi con cua, 2 mL hemolymp được thu thập ở gốc chi đi bộ thứ ba bằng cách sử dụng ống tiêm heparin (100 IU/mL). Các tế bào trong hemolymp được loại bỏ bằng cách ly tâm (1000 g, 10 phút, 4℃). Hemolymp đầu tiên được chuẩn bị bằng máy đồng nhất T10B (IKA, Staufen, Đức) theo phương pháp của Yao và cộng sự. Phần dịch nổi được thu thập sau khi hemolymp được ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4℃. Độ thẩm thấu được phân tích bằng máy đo độ thẩm thấu Fiske 210 (Advanced Instruments, Norwood, Hoa Kỳ). Nồng độ Na⁺, Cl⁻, K⁺, Ca²⁺ và Mg²⁺ được đo bằng bộ dụng cụ thuốc thử thương mại (Viện Kỹ thuật sinh học Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) và phương pháp sau đây do Long và cộng sự. Bước sóng hấp thụ được đặt thành 620, 480, 440, 610 và 540 nm trên đầu đọc vi mạch SpectraMax M2 (Thiết bị phân tử, California, Hoa Kỳ) để đo Na⁺, Cl⁻, K⁺, Ca²⁺ và Mg²⁺.

Xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA)

Toàn bộ tuyến râu (khoảng 0,1 g) được đồng nhất trong PBS (w: v = 1: 9) trước khi ly tâm (3000 vòng/phút, 10 phút, 4℃). Hoạt động của enzyme CA-g và NKA trong dịch nổi được phân tích bằng bộ dụng cụ ELISA thương mại (Qiaodu Biomart, Thượng Hải, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, 50 μL mẫu pha loãng và 100 μL liên hợp HRP được trộn trong giếng vi đĩa đã xử lý kháng thể trước. Sau khi ủ trong 60 phút ở 37℃, đĩa được rửa kỹ năm lần bằng dung dịch rửa. Sau đó, 50 μL dung dịch tạo sắc tố A và 50 μL dung dịch tạo sắc tố B được thêm vào mỗi giếng và trộn nhẹ. Sau khi ủ trong 15 phút ở 37℃ trong bóng tối, 50 μL dung dịch dừng được thêm vào và mật độ quang học (O.D.) được đo ở bước sóng 450 nm bằng đầu đọc vi đĩa SpectraMax M2 (Thiết bị phân tử, California, Hoa Kỳ).

Mô học và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Ba tuyến râu nguyên vẹn được cố định trong đệm phosphat 0,1 M (Na2HPO4, NaH2PO4) chứa 4% paraformaldehyde để nghiên cứu mô học và trong PB 0,1 M chứa 2,5% glutaraldehyde (trong đệm phosphat 0,1 M) trong 4–6 giờ ở 4℃ để quan sát TEM. Độ thẩm thấu của dung dịch cố định được điều chỉnh đến 950 mOsm/kg để ngăn ngừa tế bào co lại/sưng lên. Để chuẩn bị các phiến kính nghiên cứu mô học, các mẫu mô cố định trước tiên được nhúng vào khối parafin sau một loạt các lần rửa và khử nước bằng etanol. Tại vùng quan tâm, các lát cắt ngang dày 5 μm được cắt bằng máy cắt vi phẫu KD-2268 (Kedee, Jinhua, Trung Quốc) rồi gắn lên các phiến kính dính. Sau khi loại bỏ parafin bằng xylen và khử nước bằng etanol một loạt các lần, phiến kính được nhuộm H&E và bịt kín bằng sơn móng tay xung quanh tấm kính. Hình ảnh mô học được chụp bằng kính hiển vi quang học OLYMPUS DP72 (Olympus, Tokyo, Nhật Bản). Đối với TEM, sau khi rửa bằng 0,1 M PB ba lần (mỗi lần 15 phút), các mô được cố định trong 1% OsO4 qua đêm. Sau một loạt lần rửa và sau đó khử nước bằng etanol, các khối mô được làm sạch bằng propylen oxit và nhúng trong nhựa Epon 812. Các lát cắt siêu mỏng (dày 50–70 nm) được cắt bằng dao kim cương (DiATOME, Nidau, Thụy Sĩ) trên máy cắt siêu mỏng RMC PT-XL (Boeckeler Instrument, Tucson, Hoa Kỳ) và sau đó gắn vào lưới đồng 200 mắt lưới. Các lưới sấy khô trong không khí được nhuộm bằng dung dịch uranyl acetate 3% trong 30 phút và 6% chì citrate trong 5 phút trước khi quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua Hitachi H-7650 (Hitachi, Tokyo, Nhật Bản) hoạt động ở 80 KV. Các mẫu được phân tích ba lần và các thí nghiệm được thực hiện ba lần. Tất cả các mẫu được phân tích ba lần và các phần được thực hiện ba lần.

Phân tích thống kê

Sau khi kiểm tra tính chuẩn và tính đồng nhất của phương sai, dữ liệu được đưa vào phân tích phương sai một chiều ANOVA. Nếu phát hiện ra hiệu ứng chính đáng kể, sự khác biệt giữa các giá trị trung bình của phương pháp điều trị được so sánh bằng cách sử dụng kiểm định phạm vi bội của Duncan. Tất cả dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (trung bình ± SD). Mức độ ý nghĩa được đặt ở p < 0,05. Tất cả các phân tích được thực hiện bằng SPSS 18.0.0 cho Windows.

Kết quả

Phân tích so sánh các bản phiên mã

Sáu thư viện cDNA (ba thư viện cho mỗi nhóm) của tuyến râu đã được xây dựng thành công, chứa trung bình 83.718.424 ± 1.124.465 bản đọc sạch chất lượng tốt (Q20: 98,74 ± 0,10%). Hàm lượng GC của các bản đọc sạch là 45,19 ± 0,45% và tỷ lệ lập bản đồ với bộ gen là 76,92 ± 3,53% (Bảng 1). Có 2507 gen biểu hiện khác biệt (DEG) giữa nhóm 23 ‰ (1202 gen được điều hòa tăng) và 5 ‰ (1305 gen được điều hòa tăng) (Hình 1A). Dựa trên DEG, bản phiên mã của bốn mẫu riêng lẻ được nhóm lại với nhau cho mỗi nhóm thử nghiệm (Hình 1B). Nó chứng minh sự tương đồng về phiên mã giữa các mẫu trong cùng một nhóm và sự khác biệt về phiên mã giữa hai nhóm. Dựa trên chú thích GO, hầu hết các DEG đều liên quan đến các tiểu thể loại “liên kết” (44,65%) và “hoạt động xúc tác” (36,56%) của thể loại “chức năng phân tử”, các tiểu thể loại “quy trình tế bào” (26,47%) và “quy trình chuyển hóa” (22,81%) của thể loại “quy trình sinh học”, và các tiểu thể loại “tế bào” (17,09%), “phần tế bào” (17,01%), “màng” (16,34%), “phần màng” (15,16%) và “bào quan” (12,48%) của thể loại “thành phần tế bào” (Hình S1A). Các con đường KEGG hàng đầu được làm giàu bởi DEG có liên quan đến các quá trình điều hòa ion (“tái tạo bicarbonate ống lượn gần” và “hấp thụ khoáng chất”), sản xuất hormone (“sinh tổng hợp hormone steroid”, “tiết nước bọt”, “phân giải đường/tạo glucose mới” và “tiết mật”), truyền tín hiệu (“hệ thống tín hiệu phosphatidylinositol”, “con đường tín hiệu cAMP” và “tín hiệu adrenergic trong tế bào cơ tim”) và chuyển hóa (“chuyển hóa pyrimidine”, “chuyển hóa purin”, “tiêu hóa và hấp thụ protein” và “chuyển hóa glutathione”) (Hình S1B).

Hình 1. Các gen biểu hiện khác biệt (DEG) của bản phiên mã giữa nhóm 5‰ và 23‰. A, biểu đồ núi lửa cho thấy mức độ biểu hiện tương đối của tất cả các DEG; B, bản đồ nhiệt cho thấy sự phân cụm của tất cả các mẫu bản phiên mã dựa trên DEG.

Bảng 1 Thông tin cơ bản về bản phiên mã được xây dựng.

Các DEG liên quan đến điều hòa thẩm thấu

So với nhóm 23‰, các gen được điều hòa tăng lên ở nhóm 5‰ bao gồm Na+/K+-ATPase (NKA), proton (H+)- ATPase loại V (VPA), anhydrase carbonic tế bào chất (CA-c), adenylate cyclase (AC), phân họ C của cassette liên kết ATP (CFTR), họ chất mang chất tan 25 (SLC25), malate dehydrogenase (MDH) và phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), trong khi các gen được điều hòa giảm xuống là họ chất mang chất tan 1 (NBC1), chất trao đổi natri/hydro (NHE), anhydrase carbonic liên kết glycosyl-phosphatidylinositol (CA-g) và succinate dehydrogenase (SDH) (Bảng 2; Hình 2A). Kết quả qRT-PCR khẳng định rằng NKA, VPA, CA-c, AC, PEPCK, SLC25, MDH và CFTR được biểu hiện cao hơn ở nhóm 5‰ so với nhóm 23‰ và biểu hiện của NBC1, NHE, CA-g và SDH ở nhóm 5‰ thấp hơn so với nhóm 23‰ (Hình 2B). Các đoạn mồi được sử dụng cho RT-qPCR được liệt kê trong Bảng 3.

Bảng 2 Danh sách các gen biểu hiện khác biệt liên quan đến quá trình điều hòa thẩm thấu

Bảng 3. Trình tự các đoạn mồi được sử dụng trong RT-qPCR.

Hình 2. So sánh biểu hiện gen đối với DEG liên quan đến điều hòa thẩm thấu. A, so sánh biên độ biểu hiện gen (RPKM) của DEG. B, xác nhận biểu hiện gen khác biệt bằng qRT-PCR. NBC1, Họ chất mang chất tan 1; NKA, Na+/K+-ATPase; NHE, chất trao đổi natri/hydro; VPA, proton (H+)-ATPase loại V; CA-g, glycosyl-phosphatidylinositol-linked carbonic anhydrase; CA-c, cytoplasmic carbonic anhydrase; AC, adenylate cyclase; CFTR, ATP-binding cassette, phân họ C; SLC25, họ chất mang chất tan 25; PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase; MDH, malate dehydrogenase; SDH, succinate dehydrogenase. Các thanh trong sơ đồ biểu thị giá trị trung bình ± SD và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) được biểu thị bằng dấu hoa thị (*).

Phản ứng thích nghi dài hạn với độ mặn thấp

Để thích nghi với môi trường độ mặn thấp, độ thẩm thấu hemolymp của nhóm 5‰ đã giảm xuống còn 651,0 ± 166,3 mOsm/kg so với 851,2 ± 33,8 mOsm/kg của nhóm 23‰ (Hình S2A). Là các thành phần ion chính trong hemolymp, nồng độ Na⁺, Cl⁻, Ca²⁺, Mg²⁺ và K⁺ giảm từ 359,4 ± 2,8 xuống 204,5 ± 4,7 mmol/L (Hình S2B), 231,1 ± 3,2 xuống 194,5 ± 5,5 mmol/L (Hình S2C), 10,3 ± 0,1 đến 8,6 ± 0,5 mmol/L (Hình S2E), 10,9 ± 0,3 đến 8,2 ± 0,1 mmol/L (Hình S2F) và 7,1 ± 0,3 đến 3,4 ± 0,2 mmol/L (Hình S2D). Nồng độ giảm dần của các ion hemolymp chính phù hợp với độ thẩm thấu hemolymp giảm.

Là các enzym chính cho quá trình vận chuyển ion, hoạt động của enzym CA-c (Hình 3A) và NKA (Hình 3B) trong các tuyến râu tăng lên ở nhóm 5‰ so với nhóm 23‰. Kết quả này cũng phù hợp với biểu hiện mRNA được điều chỉnh tăng của CA-c và NKA ở nhóm 5‰ (Bảng 2 và Hình 2A).

Mức độ cắt ngang được cắt ngang bởi phần trước và bao gồm cả vùng ống gần và vùng ống xa. Vùng ống xa của tuyến râu chứa các tế bào ống và một khoang gian bào lớn. Có sự phân tách không liên tục của các khoảng máu bạch huyết giữa khoang gian bào và các tế bào mê đạo của các tế bào mê đạo lót ống. Các mạch máu bạch huyết được tìm thấy ở vùng ống gần của tuyến râu và là lối vào của động mạch khoang gian bào.

Hình 3. Hoạt động tăng lên của hai enzyme chính liên quan đến vận chuyển ion trong tuyến râu của S. paramamosain khi thích nghi với độ mặn thấp. A, so sánh hoạt động của anhydrase carbonic giữa hai nhóm; B, so sánh hoạt động của Na+/K+-ATPase giữa hai nhóm. Các thanh trong sơ đồ biểu thị giá trị trung bình ± SD và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) được biểu thị bằng dấu hoa thị (*).

LBR là các tế bào hình khối với các vi nhung mao dạng bàn chải ở đỉnh, màng đáy gấp nếp và nhiều ty thể. Ở tuyến râu, loại tế bào chính là mê cung hình khối đơn liên tục (LBR). Các mũi tên trong (Hình 4A’, B’) xác định chiều rộng của lòng mê cung. Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy chiều rộng của lòng mê cung của nhóm 5‰ giãn ra nhiều hơn đến 103,57 ± 2,54 μm so với 71,17 ± 6,8 μm của nhóm 23‰ (Hình 4E). Ngoài ra, có nhiều ty thể hơn (8 ± 2) trong LBR của nhóm 5‰ (mũi tên đen trong Hình 4C và D) so với những loại được hiển thị trong nhóm 23‰ (30 ± 8) (Hình 4F).

Hình 4. So sánh cấu trúc của tuyến râu giữa nhóm 23‰ và 5‰. A, A′ và C, hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua và ánh sáng của mặt cắt ngang của tuyến râu của nhóm 5‰. B, B′ và D, hình ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua và ánh sáng của mặt cắt ngang của tuyến râu của nhóm 23‰. E, chiều rộng của khoang mê đạo (Wll). F, số lượng ty thể có trong mỗi tế bào LBR. Trong phần, mức độ cắt ngang đi qua phần trước và bao gồm cả vùng ống gần và vùng ống xa. Các tế bào ống và thể tương bào lớn được tìm thấy ở ngoại vi của tuyến râu được định nghĩa là vùng ống xa. Một mạch máu lớn (hv) được tìm thấy ở trung tâm của tuyến râu được định nghĩa là vùng ống gần. LBR là các tế bào hình khối với các vi nhung mao chải đỉnh (bbm), màng đáy bên gấp nếp và nhiều ty thể (m). Thanh tỷ lệ: 50 μm (A, A′, B, B′), 1 μm (C), 2 μm (D).Phản ứng thích nghi ngắn hạn đối với sự suy giảm đột ngột của độ mặn

Kết quả của chúng tôi cho thấy hầu hết tỷ lệ chết do sự suy giảm đột ngột của độ mặn xảy ra trong vòng 24 giờ (Hình S3). Đối với những con cua sống sót, độ thẩm thấu hemolymp giảm từ 824,0 ± 13,6 xuống 545,8 ± 27,6 mOsm/kg trong 12 giờ đầu tiên và không thay đổi sau đó (Hình S4A); trong khi đó, độ thẩm thấu môi trường dường như tăng lên mặc dù không đáng kể. Theo đó, nồng độ Na+, K+, Mg2+ và Cl− trong hemolymp giảm từ 340,2 ± 4,9 xuống 203,5 ± 5,6 mmol/L (Hình S4B), 6,8 ± 0,1 xuống 3,3 ± 0,1 mmol/L (Hình S4D), 10,8 ± 0,1 xuống 7,0 ± 0,5 mmol/L (Hình S4F) và 236,2 ± 4,9 xuống 203,5 ± 5,3 mmol/L (Hình S4C); đồng thời, Na+, K+, Mg2+ và Cl− trong môi trường tăng từ 147,0 ± 7,0 lên 216,0 ± 8,0 mmol/L (Hình S4B), 2,0 ± 0,2 đến 3,3 ± 0,3 mmol/L (Hình S4D), 4,7 ± 0,4 đến 7,3 ± 0,5 mmol/L (Hình S4F), 147,0 ± 7,0 đến 222,7 ± 6,1 mmol/L (Hình S4C). Nồng độ ion cân bằng mới giữa hemolymp và môi trường đạt được trong vòng 12–24 giờ.

Tình trạng của Ca²⁺ hơi khác so với các ion khác. Ở nhóm 5‰, Ca²⁺ hemolymp giảm từ 9,9 ± 0,1 xuống 5,9 ± 0,1 mmol/L trong 24 giờ đầu và không thay đổi sau đó; trong khi đó, Ca²⁺ môi trường tăng từ 4,7 ± 0,2 lên 7,2 ± 0,3 mmol/L trong 6 giờ đầu. Không giống như trường hợp của các ion khác, Ca²⁺ môi trường của nhóm 23‰ không duy trì ở mức ban đầu, nó giảm từ 8,0 ± 0,2 xuống 5,3 ± 0,3 mmol/L trong 6 giờ đầu và không thay đổi sau đó (Hình S4E). Trong quá trình thích nghi ngắn hạn với độ mặn thấp, enzyme của CA-c phản ứng nhanh hơn NKA và thời gian đáp ứng của CA-c dài hơn. Hoạt động của enzyme của CA tăng ngay lập tức và đạt đỉnh sau 48 giờ (Hình 5A); khi so sánh, hoạt động của enzyme NKA tăng 3 giờ sau khi độ mặn thay đổi trong khi mức độ ổn định ở giờ thứ 6, sớm hơn CA (Hình 5B). Biểu hiện gen của CA-c (Hình S5E) và NKA (Hình S5B) cho thấy một mô hình thay đổi tương ứng; tuy nhiên, biểu hiện giảm mạnh của CA-c đã được quan sát thấy từ 72 đến 96 giờ (Hình S5E). Tương tự như NKA, biểu hiện tăng của CFTR (Hình S5H), SLC25 (Hình S5I) và PEPCK (Hình S5J) xảy ra trong vòng 24 giờ và biểu hiện gen được duy trì ở mức đỉnh sau đó. Đối với VPA (Hình S5D) và AC (Hình S5G), có sự giảm tạm thời biểu hiện gen giữa 24 giờ và 72 giờ. Đối với NHE (Hình S5C), MDH (Hình S5K) và SDH (Hình S5L), biểu hiện gen đạt đỉnh ở giờ thứ 24 và bắt đầu giảm sau đó. Không giống như các gen khác, biểu hiện của NBC1 (Hình S5A) và CA-g (Hình S5F) bắt đầu giảm từ 0 giờ, tăng trở lại từ 12 giờ đến 24 giờ, sau đó lại giảm tiếp.

Hình 5. Ảnh hưởng của sự suy giảm độ mặn đột ngột lên hoạt động của hai loại enzyme vận chuyển ion chính trong tuyến râu của Scylla paramamosain. A, sự thay đổi hoạt động của carbonic anhydrase trong 96 giờ; B, sự thay đổi hoạt động của Na⁺/K⁺-ATPase trong 96 giờ. Thanh biểu thị giá trị trung bình ± SD, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) được biểu thị bằng dấu hoa thị (*).

Thảo luận

Kết quả của chúng tôi cho thấy các con đường điều hòa ion bao gồm “thu hồi bicarbonate ống lượn gần” và “hấp thụ khoáng chất” đã được kích hoạt trong các tuyến râu của S. paramamosain trong quá trình thích nghi với độ mặn thấp. Các gen vận chuyển ion, ví dụ như NKA, CA-c, VPA và NHE, đã được điều hòa tăng lên. Sự gia tăng hoạt động của enzyme NKA và CA-c đã xác nhận sự kích hoạt của hai gen này. NKA là một enzyme liên kết màng chịu trách nhiệm vận chuyển K⁺vào và Na⁺ ra khỏi tế bào. NHE cũng là một protein màng vận chuyển Na⁺ vào và H⁺ ra. VPA có thể vận chuyển H⁺ qua màng tế bào. CA xúc tác quá trình chuyển đổi hai chiều của H₂O và CO₂ thành H⁺ và HCO₃⁻, trong khi H⁺ thường được cung cấp cho các chất vận chuyển ion khác.

Sự điều hòa tăng của AC có thể liên quan đến sự kích hoạt của con đường truyền tín hiệu vận chuyển ion AC-cAMP-PKA-ion, được cho là một con đường truyền tín hiệu quan trọng được điều chỉnh bởi hệ thống thần kinh nội tiết giáp xác. Các yếu tố thần kinh nội tiết trung gian qua cAMP đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa thẩm thấu ở giáp xác. Ở giáp xác, mang chủ yếu chịu trách nhiệm về quá trình điều hòa thẩm thấu, bao gồm vận chuyển ion hiệu quả, điều hòa hemolymp và những thay đổi trong quá trình trao đổi chất thông qua việc tăng tiêu thụ O₂ để điều hòa nồng độ ion hemolymp. Những kết quả này cho thấy chức năng điều hòa thẩm thấu của tuyến râu phụ thuộc vào sự tái hấp thu ion thông qua sự kích hoạt của các chất vận chuyển ion (Hình 6). Cơ chế phản ứng của tuyến mang và tuyến râu có thể khác nhau và cân bằng thẩm thấu được điều chỉnh bởi hoạt động phối hợp của tuyến mang và tuyến râu. Tuy nhiên, điểm yếu là không tìm thấy sự khác biệt trong phản ứng của các gen liên quan đến điều hòa thẩm thấu trong quá trình thích nghi với hàm lượng muối thấp trong thời gian dài và ngắn hạn, có thể là do chỉ một số ít gen được chọn được phát hiện trong quá trình tiếp xúc trong thời gian dài và ngắn hạn.

Hình 6. Con đường điều hòa thẩm thấu được đề xuất của tuyến râu của S. paramamosain thích nghi với độ mặn thấp. Mũi tên đỏ chỉ ra sự điều hòa tăng gen và mũi tên xanh chỉ ra sự điều hòa giảm gen. NBC1 , họ chất mang chất tan 1; NKA , Na ⁺ /K ⁺ -ATPase; NHE , chất trao đổi natri/hydro; VPA , proton (H ⁺ )-ATPase loại V; CA-g , glycosyl-phosphatidylinositol-linked carbonic anhydrase; CA-c , cytoplasmic carbonic anhydrase; AC , adenylate cyclase; CFTR , ATP-binding cassette, phân họ C; SLC25 , họ chất mang chất tan 25; PEPCK , phosphoenolpyruvate carboxykinase; MDH , malate dehydrogenase; SDH , succinate dehydrogenase.

Nghiên cứu cho thấy biểu hiện của các gen liên quan đến sự phân bổ lại năng lượng được sắp xếp trong tuyến râu để đáp ứng với độ mặn thấp. SDH và MDH là các enzyme quan trọng trong chu trình TCA. PEPCK chuyển đổi oxaloacetate (OAA) thành phosphoenolpyruvate (PEP) trong quá trình tân tạo glucose. SLC25 làm trung gian cho quá trình chuyển vị các chất bao gồm axit amin, đường và các ion vô cơ qua màng ty thể. Sự điều hòa tăng MDH, SLC25 và PEPCK và sự điều hòa giảm SDH cho thấy sự tăng cường tân tạo glucose (Hình 6). Kết quả này phù hợp với quan sát thấy sự gia tăng ty thể trong các tế bào biểu mô ống của tuyến râu để đáp ứng với độ mặn thấp. Có thể liên quan đến nhu cầu năng lượng bổ sung từ các nguồn không phải carbohydrate như một cách lập trình lại quá trình trao đổi chất để điều hòa thẩm thấu chuyên sâu trong quá trình thích nghi với độ mặn thấp.

Kết quả của chúng tôi cho thấy độ thẩm thấu máu và nồng độ hemolymp của Na⁺, Cl⁻, Ca²⁺, Mg²⁺ và K⁺ giảm khi thích nghi với độ mặn thấp và cuối cùng độ thẩm thấu bên trong cân bằng ở trạng thái ổn định với độ thẩm thấu môi trường bên ngoài. Sau khi độ mặn giảm đột ngột, độ thẩm thấu máu của S. paramamosain cân bằng với độ thẩm thấu môi trường trong vòng 12–24 giờ. Tiêu thụ O₂, nhu cầu năng lượng tăng và quá trình trao đổi chất tăng tốc do độ mặn thay đổi dẫn đến rối loạn chức năng sinh lý và giảm khả năng phòng vệ miễn dịch, vì hầu hết tỷ lệ chết cũng được quan sát thấy trong cùng thời kỳ. Một nghiên cứu khác cũng quan sát thấy độ thẩm thấu máu thấp hơn của S. paramamosain được nuôi trong nước có độ mặn thấp. Ngược lại, sự gia tăng thẩm thấu hemolymp được quan sát thấy ở cua nước ngọt Eriocheir sinensis khi tích tụ trong môi trường có độ mặn cao. Do đó, các loài cua như S. paramamosain và E. sinensis cũng được biết đến là loài điều hòa thẩm thấu mạnh, duy trì thẩm thấu hemolymp rất giống với môi trường bên ngoài. E. sinensis chủ yếu sống ở nước ngọt trong khi S. paramamosain và P. trituberculatus sống ở cửa sông hoặc đại dương. Sự thay đổi độ mặn là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến sự chiếm đóng của giáp xác trong môi trường. Đối với giáp xác, sự cân bằng thẩm thấu ở độ mặn thấp hoặc cao đạt được thông qua cơ chế vận chuyển, điều hòa thẩm thấu và ion. Việc chiếm giữ thành công các môi trường có độ mặn khác nhau đòi hỏi khả năng phản ứng nhanh với những thay đổi về độ mặn.

Dựa trên mặt cắt ngang tuyến râu, lòng mê đạo mở rộng bên trong tuyến râu được quan sát thấy trong nghiên cứu này và các nghiên cứu khác trong quá trình thích nghi với độ mặn thấp. Nước bên ngoài có độ thẩm thấu thấp có khả năng thâm nhập vào máu có độ thẩm thấu cao và làm loãng máu. Để bù đắp cho thể tích máu tăng lên, nước dư thừa được bài tiết qua tuyến râu dưới dạng nước tiểu có độ thẩm thấu thấp.

Tóm lại, nghiên cứu này cho thấy chức năng điều hòa thẩm thấu của tuyến râu của S. paramamosain thông qua các phát hiện về việc điều hòa tăng gen vận chuyển ion, vô hiệu hóa hoạt động của enzyme vận chuyển ion và cân bằng lại độ thẩm thấu máu khi cua thích nghi với độ mặn thấp. Đối với quá trình thích nghi với độ mặn thấp, cua tăng bài tiết nước tiểu và tái hấp thu ion từ nước tiểu trong tuyến râu. Ngoài ra, cua sống trong môi trường có độ mặn thay đổi có thể cần thêm năng lượng để thực hiện các cơ chế vận chuyển và điều hòa thẩm thấu và ion. Chỉ một số ít gen được chọn sử dụng để xác thực thực nghiệm đã được kiểm tra đối với cả phơi nhiễm dài hạn và ngắn hạn, kết quả qPCR có thể không phản ánh được phản ứng toàn cầu và hồ sơ biểu hiện ở cua bùn. Cần có nghiên cứu trong tương lai với quy mô lớn hơn.

Theo Nan Mo, Tianyi Feng, Dandan Zhu, Jiaxin Liu, Shucheng Shao, Rui Han, Wentao Lu, Pingping Zhan, Zhaoxia Cui

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844024015871

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức