English
中文 (中国)
Nuôi tôm phải đối mặt với nhiều thách thức từ các bệnh do vi khuẩn và vi-rút, đăc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) và vi-rút đốm trắng (WSSV). Nghiên cứu gần đây nhấn mạnh tiềm năng của Lactiplantibacillus plantarum (FD-LAB) như một chất kích thích miễn dịch qua khẩu phần ăn giúp tăng cường khả năng miễn dịch của tôm. Phân tích phiên mã cho thấy việc bổ sung FD-LAB điều chỉnh các gen liên quan đến miễn dịch và RNA vòng (circRNA), góp phần tăng cường trí nhớ miễn dịch và khả năng kháng mầm bệnh.
Nuôi tôm đóng vai trò quan trọng trong đảm bảo an ninh lương thực toàn cầu nhưng phải đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là các bệnh gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng, nhất là ở Châu Á. Một số bênh phổ biến bao gồm nhiễm trùng do vi khuẩn như bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) và các mối đe dọa do vi-rút như vi-rút đốm trắng (WSSV). Do thiếu khả năng miễn dịch thích ứng, tôm chủ yếu dựa vào phản ứng miễn dịch bẩm sinh để chống lại các tác nhân gây bệnh.
Để tăng cường khả năng miễn dịch của tôm, các nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch, giúp cải thiện khả năng kháng bệnh. Những chất này bao gồm các hợp chất tổng hợp và các chất có nguồn gốc tự nhiên từ thực vật, nấm và vi khuẩn.
Vi khuẩn axit lactic (LAB), chẳng hạn như Lactiplantibacillus plantarum, được sử dụng rộng rãi trong nuôi tôm như chất kích thích miễn dịch trong khẩu phần ăn. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung LAB cải thiện sự tăng trưởng, thành phần hệ vi sinh đường ruột và phản ứng miễn dịch ở tôm thẻ chân trắng, tăng tỷ lệ sống sau nhiễm bệnh.
Những tiến bộ trong phân tích phiên mã đã giúp chúng ta hiểu sâu hơn về khả năng miễn dịch của tôm, bao gồm phản ứng miễn dịch với AHPND và WSSV. Ngoài ra, RNA không mã hóa, chẳng hạn như RNA vòng (circRNA), có vai trò điều chỉnh biểu hiện gen miễn dịch. Tuy nhiên, tác động của kích thích miễn dịch đối với biểu hiện circRNA vẫn chưa được khám phá.
Một khái niệm gần đây về khả năng miễn dịch của giáp xác, “miễn dịch tập nhiễm”, cho rằng việc tiếp xúc với các chất kích thích miễn dịch như L. plantarum đông lạnh (FD-LAB) có thể tăng cường trí nhớ miễn dịch ở Penaeus vannamei, cải thiện khả năng chống lại các bệnh nhiễm trùng thứ cấp. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tiềm năng của FD-LAB trong việc kích thích khả năng miễn dịch của tôm.
Nguyên liệu và phương pháp
» Chuẩn bị tôm và thức ăn: Tôm thẻ chân trắng P. vannamei (0,87 ± 0,24 g) được chia thành nhóm đối chứng và nhóm FD-LAB và thích nghi trong 7 ngày. Thức ăn được bổ sung L. plantarum đông khô (FD-LAB) ở mức 34,2 mg/g. Tôm được nuôi trong bể tuần hoàn có giám sát điều kiện nước và cho ăn 3 lần/ngày trong 8 hoặc 15 ngày.
» Chiết xuất và giải trình tự RNA: Tổng RNA từ mô mang và dạ dày tôm được chiết xuất và đánh giá chất lượng. Chuẩn bị thư viện được thực hiện bằng bộ dụng cụ Illumina Stranded mRNA Prep, sau đó giải trình tự trên nền tảng Illumina MiSeq.
» Phân tích transcriptome và circRNA: Kiểm soát chất lượng và phân tích biểu hiện khác biệt được thực hiện bằng các công cụ tin sinh học như STAR, RSEM và DESeq2. Phát hiện circRNA được thực hiện bằng quy trình CIRIquant.
» Xác thực qPCR: Các gen biểu hiện khác biệt (DEG) và circRNA được xác thực thông qua qPCR. RNA được phiên mã ngược và khuếch đại được thực hiện bằng các đoạn mồi đặc hiệu.
» Thử nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn và vi-rút: Tôm được cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus (AHPND) hoặc WSSV thông qua phương pháp ngâm. Tỷ lệ sống được phân tích bằng phương pháp Kaplan-Meier, bao gồm các thử nghiệm bổ sung về khả năng miễn dịch tập nhiễm.
Kết quả
Chất lượng giải trình tự RNA & tổng quan
Giải trình tự RNA được thực hiện trên các mẫu mang và dạ dày tôm sau 8 và 15 ngày cho ăn bằng FDLAB hoặc thức ăn đối chứng. Giải trình tự tạo ra ~180 triệu lần đọc chất lượng cao (Q>30), hỗ trợ các phân tích hạ lưu đáng tin cậy.
Hồ sơ phiên mã & những thay đổi biểu hiện gen
Bổ sung FD-LAB dẫn đến biểu hiện gen khác biệt (DEG):
» Mang: 80 DEG (8 ngày), 40 DEG (15 ngày) (Hình 1).
Hình 1. Bản đồ nhiệt cho thấy sự khác biệt giữa các hồ sơ phiên mã của mang (a-b) và dạ dày (c-d) của tôm được nuôi bằng thức ăn nuôi cấy toàn bộ Lactiplantibacillus plantarum (FD-LAB) đông khô hoặc đối chứng. Biểu đồ là số lượng gen được biểu hiện khác biệt (DEG) được chuẩn hóa với sự thay đổi gấp log2 ≥ 2 và giá trị p < 0,05.
» Dạ dày: 14 DEG (8 ngày), 22 DEG (15 ngày).
» 17 gen được điều hòa tăng, 103 gen được điều hòa giảm.
» DEG bao gồm các gen liên quan đến miễn dịch tham gia vào quá trình nhận dạng mầm bệnh, phản ứng kháng khuẩn và trí nhớ miễn dịch.
» Các con đường làm giàu khác: phiên mã, dịch mã, phân bào và các quá trình trao đổi chất.
qPCR xác nhận DEG
Phương pháp qPCR xác nhận các phát hiện RNA-seq, xác nhận các thay đổi biểu hiện gen liên quan đến miễn dịch:
» Mang: Điều hòa tăng yếu tố antilipopolysaccharide (ALF) (8 ngày), ficolin-1 (FCN1) (15 ngày); điều hòa giảm mucin 5AC (Muc5ac) (8 ngày).
» Dạ dày: điều hòa tăng thiopurine S-methyltransferase (TPMT) và chất ức chế elastase bạch cầu giống B (SERPINB1) (15 ngày).
» Các gen miễn dịch bổ sung (prophenoloxidase [proPO], superoxide dismutase [SOD], lysozyme [LYZ]) được tăng cường, đặc biệt là LYZ ở mang (15 ngày).
Biểu hiện khác biệt của circRNA
» Mang: 248 DEC
» Dạ dày: 226 DEC
» RNA của tôm bố mẹ của DEC được liên kết với trí nhớ miễn dịch, phản ứng căng thẳng và liên kết độc tố.
» Phân tích thuật ngữ gen (GO) chỉ ra vai trò trong các chức năng phân tử (liên kết heme/ion), liên kết chéo peptide và tái cấu trúc tế bào.
Xác thực RNA vòng (DEC) biểu hiện khác biệt thông qua qPCR
» DEC đã được xác thực: Protein giống phân tử kết dính tế bào hội chứng Down (DSCAM), protein sốc nhiệt 70 kDa giống 4 (HSP70), aminopeptidase giống N (APN) và giống extensin (ETX).
» Các kiểu biểu hiện gen của RNA của tôm bố mẹ phần lớn phù hợp với circRNA, xác nhận sự điều biến khi bổ sung FD-LAB.
Miễn dịch tập nhiễm & khả năng kháng bệnh
Các thử nghiệm cảm nhiễm V. parahaemolyticus (VPAHPND) và WSSV:
» Cho ăn FD-LAB trong 15 ngày làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tôm chống lại cả hai tác nhân gây bệnh.
» Cho ăn trong 8 ngày cải thiện tỷ lệ sống chống lại VPAHPND nhưng không phải WSSV.
» Sau khi cho ăn FD-LAB (7-14 ngày): Tỷ lệ sống được cải thiện, cho thấy cơ chế miễn dịch tập nhiễm tiềm năng. (Hình 2).
Hình 2. Đường cong sống sót Kaplan-Meier của tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei chống lại vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus D6 (VPAHPND) gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) sau (a) 15 ngày và (b) 8 ngày cho ăn, và vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) sau (c) 15 ngày và (d) 8 ngày cho ăn. Dấu hoa thị (**** = p < 0,0001) biểu thị sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng.
Thảo luận
FD-LAB tăng cường khả năng miễn dịch và trí nhớ miễn dịch ở tôm
Việc bổ sung L. plantarum (FD-LAB) vào khẩu phần ăn đã tạo ra những thay đổi đáng kể trong phiên mã ở tôm thẻ chân trắng, đặc biệt là ở các gen liên quan đến khả năng miễn dịch và trí nhớ miễn dịch. Toàn bộ quá trình nuôi cấy FD-LAB vẫn giữ lại các hợp chất hoạt tính sinh học, tăng cường tiềm năng sinh học của nó. Phân tích phiên mã cho thấy sự biểu hiện khác biệt của Mucin-5ac (Muc5ac), một thành phần quan trọng của hàng rào chất nhầy, bị giảm điều hòa ở mang, có khả năng ảnh hưởng đến khả năng kháng mầm bệnh.
Các protein miễn dịch điều hòa như SERPINB1 được tăng điều hòa, cho thấy vai trò của chúng trong điều hòa miễn dịch và ức chế vi khuẩn. Gen kháng khuẩn anti-lipopolysaccharide factor (ALF) cũng được tăng điều hòa ở cả mang và dạ dày, góp phần vào khả năng kháng vi khuẩn và vi rút.
Các gen liên quan đến trí nhớ miễn dịch, bao gồm Thiopurine Methyltransferase (TPMT) và Histone H1-delta (HisH1), được biểu hiện khác biệt. TPMT ảnh hưởng đến DNA methyl, một cơ chế chính trong khả năng miễn dịch được đào tạo, trong khi HisH1 điều chỉnh biểu hiện gen miễn dịch và có đặc tính kháng khuẩn. Sự điều hòa tăng cường của Ficolin-1 (FCN1), liên quan đến nhận dạng mầm bệnh và thực bào, cho thấy phản ứng miễn dịch được cải thiện. Những thay đổi này trong thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR) chỉ ra sự chuẩn bị miễn dịch, một dấu hiệu đặc trưng của khả năng miễn dịch được đào tạo.
RNA vòng như chất điều hòa miễn dịch
Bổ sung FD-LAB cũng điều chỉnh biểu hiện của circRNA, đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Một số circRNA tiêu biểu bao gồm DSCAM, HSP70, EXT và APN. DSCAM tham gia vào trí nhớ miễn dịch và khả năng miễn dịch đặc hiệu với mầm bệnh, trong khi HSP70 hoạt động như một mô hình phân tử liên quan đến tổn thương (DAMP) kích hoạt phản ứng miễn dịch bẩm sinh. EXT và APN được biểu hiện khác nhau, có thể góp phần vào phản ứng kháng khuẩn và khả năng kháng AHPND.
Ngoài ra, circRNA nhắm vào các gen protein biểu bì bị điều hòa giảm, có thể giúp ức chế nhiễm WSSV, trong khi các RNA liên quan đến gen Rab được điều hòa tăng, phù hợp với các báo cáo trước đây về khả năng kháng WSSV ở tôm. Những phát hiện này cho thấy circRNA ảnh hưởng đến khả năng điều hòa các gen liên quan đến miễn dịch và góp phần vào khả năng miễn dịch được đào tạo.
Khả năng miễn dịch được đào tạo và khả năng kháng mầm bệnh
Các thử nghiệm cảm nhiễm chứng minh rằng bổ sung FD-LAB giúp tăng cường khả năng kháng V. parahaemolyticus (VPAHPND) và WSSV của tôm. Khi bổ sung trong 15 ngày, tỷ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể trước cả hai tác nhân gây bệnh, trong khi 8 ngày cung cấp khả năng bảo vệ chống lại VPAHPND nhưng không phải WSSV. Đáng chú ý, ngay cả 7 ngày sau khi ngừng bổ sung FD-LAB, tôm vẫn duy trì tỷ lệ sống cao hơn trước cả hai tác nhân gây bệnh, cho thấy cơ chế miễn dịch tập nhiễm. Tuy nhiên, sau 14 ngày, khả năng bảo vệ chỉ còn hiệu quả đối với WSSV, nhưng không duy trì với VPAHPND, cho thấy sự tồn tại của trí nhớ miễn dịch đặc hiệu theo từng loại tác nhân kích thích.
Kết luận
Việc bổ sung FD-LAB giúp tăng cường hệ miễn dịch của tôm bằng cách tác động đến biểu hiện khác biệt của các gen liên quan đến miễn dịch và circRNA. Cơ chế mồi miễn dịch được kích hoạt giúp tôm nhận diện tác nhân gây bệnh tốt hơn, tăng cường phản ứng kháng khuẩn và điều hòa biểu sinh. Nhờ đó, FD-LAB trở thành một chất phụ gia thức ăn đầy tiềm năng trong việc phòng ngừa bệnh cho tôm nuôi.
Theo John Paul Matthew Domingo Guzman, Reiko Nozaki, Mikio Aoki, Hiroshi Kuwahara, Kazuki Mikata, Keiichiro Koiwai , Hidehiro Kondo, Ikuo Hirono
Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh
Đọc thêm:
- Phần 1: Tác dụng của việc bổ sung Spirulina platensis vào khẩu phần ăn đối với hiệu suất tăng trưởng, thành phần cơ thể, hoạt động chống oxy hóa, thay đổi mô học và khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei
- Phần 2: Tác dụng của việc bổ sung Spirulina platensis vào khẩu phần ăn đối với hiệu suất tăng trưởng, thành phần cơ thể, hoạt động chống oxy hóa, thay đổi mô học và khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus ở tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei
- Ảnh Hưởng Của Khẩu Phần Thủy Phân Đầu Cá Ngừ Đến Tỷ Lệ Sống Và Tăng Trưởng Của Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei