Nghiên Cứu Tỷ Lệ Mắc Bệnh Mờ Đục Hậu Ấu Trùng (TPD) Ở Trung Quốc

Tóm tắt

Đầu năm 2020, ngành nuôi tôm Trung Quốc đối mặt với thách thức lớn khi dịch bệnh mờ đục hậu ấu trùng (TPD) bùng phát trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Nguyên nhân của dịch bệnh mới nổi này là do chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus (Vp_TPD) có độc lực cao. Mặc dù đã có những tiến bộ trong việc nghiên cứu các yếu tố độc lực của Vp_TPD, nhưng vẫn chưa rõ ràng về tính đa dạng và mức độ phổ biến của mầm bệnh TPD. Do đó, nghiên cứu này nhằm điều tra một cách hệ thống về dịch tễ học của TPD tại Trung Quốc. Nghiên cứu này tiến hành phân lập, xác định và bảo quản các vi khuẩn có khả năng gây bệnh từ các mẫu tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên. Qua nghiên cứu sâu hơn cho thấy các loài Vibrio khác nhau mang gen độc lực chính của Vp_TPD có thể lây nhiễm cho ấu trùng
P. vannamei và gây ra bệnh TPD. Điều này cho thấy sự đa dạng của mầm bệnh TPD.
Các chủng Vibrio gây bệnh được tạm thời gọi là Vibrio gây ra TPD (V_TPD). Bên cạnh đó, giám sát dịch tễ học dựa trên phân tích TaqMan qPCR và phân tích mô bệnh học cho thấy V_TPD xuất hiện ở hầu hết các ao nuôi tôm tại các tỉnh nuôi tôm khác nhau của Trung Quốc. Tỷ lệ nhiễm của V_TPD vượt quá 50% ở một số khu vực. Các loài nuôi trong nước biển như P. vannamei và P. japonicus nhạy cảm hơn với V_TPD và dễ bị nhiễm bệnh hoặc mang mầm bệnh hơn. Tôm nuôi nước ngọt như tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm hùm đất (Procambarus clarkii) có thể không bị ảnh hưởng bởi V_TPD. Tuy nhiên, nguy cơ mang hoặc nhiễm V_TPD vẫn tiềm ẩn ở các sinh vật làm mồi cho tôm. Nỗ lực của nghiên cứu này đã cung cấp sự hiểu biết cơ bản về dịch tễ học cũng như những hiểu biết kỹ thuật quan trọng để phòng ngừa và quản lý các bệnh tôm mới nổi.

Giới thiệu

Đầu năm 2020, dịch bệnh “mờ đục hậu ấu trùng” (TPD) bùng phát trên diện rộng tại các vùng nuôi tôm lớn ở miền Nam Trung Quốc. Bệnh chủ yếu tấn công vào giai đoạn hậu ấu trùng P5-P7 của tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei, với tốc độ lây lan nhanh và tỷ lệ chết cao. Trong vòng 3 ngày sau khi xuất hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết có thể lên đến 90%. Bệnh có khả năng lây lan cao, khiến tôm thẻ P. vannamei ngừng ăn, suy yếu, tỷ lệ sống giảm. Gan tụy nhợt nhạt, ruột giữa và dạ dày trống rỗng. Màu sắc cơ thể thay đổi từ phần đầu ngực đến phần bụng, trở nên trong suốt hoặc bán trong suốt. Sau đó, dịch bệnh nhanh chóng lan rộng sang các vùng nuôi trồng thủy sản ven biển phía Bắc Trung Quốc, cho thấy tốc độ lây lan nhanh chóng. Nguyên nhân gây ra dịch bệnh được xác định là một chủng Vibrio parahaemolyticus mới và có độc lực cao, được gọi là V. parahaemolyticus gây ra TPD (Vp_TPD) (Zou và cộng sự, 2020).

Liu Shuang và cộng sự đã thực hiện một loạt các thí nghiệm để xác định yếu tố độc lực chính của Vp_TPD. Họ phân tích khả năng gây bệnh của các protein trọng lượng phân tử khác nhau của Vp_TPD trên ấu trùng P. vannamei, kết hợp với phân tích khối phổ, phân tích so sánh bộ gen, điều tra dịch tễ học và thử nghiệm cảm nhiễm Vp_TPD. Kết quả nghiên cứu cho thấy protein độc lực mới, protein độc lực cao Vibrio (VHVP), là yếu tố độc lực chính tiềm ẩn của Vp_TPD. VHVP-2, được mã hóa bởi gen độc lực vhvp-2 nằm trên plasmid 187, 791 bp, là yếu tố không thể thiếu đối với độc lực của V. parahaemolyticus trong việc gây chết ấu trùng tôm. Trên thực tế, phân tích sâu hơn về plasmid này dựa trên bộ gen so sánh và phép đo phổ khối, nhóm nghiên cứu còn phát hiện ngoại trừ gen độc lực chính của vhvp-2 mã hóa protein VHVP-2 (chứa các miền độc tố được bảo tồn SpvB và TcdB), còn có hai gen độc lực tiềm năng khác. vhvp-1 mã hóa protein VHVP-1 (trọng lượng phân tử (MW) > 100 kDa) và vhvp-3 mã hóa protein có độc lực tiềm ẩn (MW khoảng 100 kDa) trong plasmid có độc lực 187, 791 bp. Mặc dù chức năng của hai gen này đối với độc lực gây chết đối với ấu trùng tôm chưa được xác định rõ ràng, nhưng đây là hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn để giải mã cơ chế gây bệnh của Vp_TPD.

Theo kết quả dự đoán của các gen mã hóa trong 187, 791 bp plasmid bằng cách sử dụng Dịch vụ tìm kiếm miền bảo tồn trực tuyến (CD Search) trong NCBI, yếu tố độc lực tiềm ẩn VHVP-1 sở hữu các miền bảo tồn của miền liên quan đến phức hợp độc tố Tc TcA, miền neuraminidase và protein độc lực Salmonella 28,1 kDa A, trong khi yếu tố độc lực tiềm ẩn VHVP-3 sở hữu miền liên quan đến TccC. Các miền này được coi là thành phần quan trọng của độc tố, do đó việc nghiên cứu chức năng gây độc lực của các gen này trong Vp_TPD là rất cần thiết.

Từ năm 2021 đến năm 2022, chúng tôi đã tiến hành phân lập, xác định và phân tích khả năng gây bệnh của các mầm bệnh vi khuẩn có khả năng gây nhiễm trùng TPD trên tôm được thu thập từ các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc để hiểu các đặc điểm sinh học cơ bản của mầm bệnh này. Trong khi đó, để xác định mức độ phổ biến của bệnh này ở các loài nuôi tôm chính và các vùng nuôi tôm khác nhau ở Trung Quốc, nghiên cứu này đã tiến hành điều tra dịch tễ học phân tử về TPD từ năm 2021 đến năm 2022, dựa trên phân tích sinh học phân tử (PCR và real-time PCR) và phân tích mô bệnh học.

Vật liệu và phương pháp

Lấy mẫu và thí nghiệm tôm

Từ tháng 3 năm 2021 đến tháng 12 năm 2022, tổng cộng 694 mẫu đã được thu thập từ 10 tỉnh khác nhau trên khắp Trung Quốc. Mỗi con tôm được chia thành hai phần: phần đầu ngực và phần bụng. Một phần bao gồm một phần gan tụy, một phần cơ bụng và cuống mắt, được đặt trong dung dịch cố định chứa 4% PFA-PBS (Sinopharm, Bắc Kinh, Trung Quốc) để phân tích bệnh lý mô (Hình 4a). Phần gan tụy, mang, cơ, phần phụ và các mô khác còn lại được băm nhỏ và trộn với nhau. Sau đó, 30 mg hỗn hợp được chiết xuất và cho vào ethanol 95% để chiết xuất axit nucleic (Zhang, 2017) và một số hỗn hợp mô được sử dụng để phân lập mầm bệnh tiềm ẩn (2.3 để biết chi tiết). Đối với hậu ấu trùng, 3-5 con tôm được trộn và bảo quản trong Ethanol 95% để tách chiết DNA; 2-3 cá thể khác được cắt ngang và cố định trong 4%PFA để quan sát mô bệnh học tiếp theo. Để tránh lây nhiễm chéo, các dụng cụ được thay mới sau mỗi lần lấy mẫu.

Tôm post sạch mầm bệnh (P5-P7, chiều dài cơ thể 7-9 mm) được lấy từ một trang trại nuôi tôm ở Weifang, tỉnh Sơn Đông và được nuôi trong hai ngày trước khi được sử dụng trong thử nghiệm cảm nhiễm.

Chiết xuất DNA và phát hiện VpTPD bằng Real-time qPCR

DNA bộ gen của mô được chiết xuất bằng bộ dụng cụ DNA vi khuẩn TIANamp (TIANGEN BIOTECH, Bắc Kinh, Trung Quốc).

Phản ứng PCR thời gian thực (qPCR) để phát hiện Vp_TPD được thực hiện trên Hệ thống phát hiện PCR thời gian thực BIORAD CFX96 Touch (BIORAD, Hercules, CA, USA) theo hướng dẫn của bộ kit Roche^® FastStart Essential DNA Probes. Các thông số phản ứng bao gồm sự biến tính ban đầu ở nhiệt độ 95℃ trong 1 phút, sau đó là 40 chu kỳ biến tính ở 95℃ trong 10 giây, ủ và kéo dài ở nhiệt độ 55,7℃ trong 25 giây. Hỗn hợp phản ứng 20 µL chứa 8 µL FastStart Essential DNA Probes Master (2×), 8,6 µL FastStart Essential DNA Probes Master (H₂O), 0,8 µL mồi và đầu dò (mỗi loại 0,4 µM) và 1 µL DNA bộ gen (Wang, 2022).

Phân lập vi khuẩn

Tôm bị bệnh trong bể nuôi được khử trùng bằng cồn 75%, sau đó rửa ba lần bằng dung dịch đệm PBS. Sau đó, một phần gan tụy, ruột và cơ được loại bỏ và trộn, đồng thời hỗn hợp mô 30 mg được đồng nhất hóa với 0,5 mL dung dịch đệm PBS vô trùng. Các khuẩn lạc riêng lẻ được chọn từ môi trường chứa đầy khuẩn lạc và cấy vào môi trường TSA hoặc LB mới. Việc ủ được thực hiện ở nhiệt độ nêu trên trong 18-24 giờ. Sau đó, khuẩn lạc đơn đã được tinh chế được cấy vào môi trường TSB hoặc môi trường lỏng LB sạch và được ủ trong máy lắc ở 28°C (môi trường TSB) hoặc 37°C (môi trường lỏng LB) với tốc độ quay 180 vòng/phút trong 18-24 giờ để chuẩn bị huyền phù vi khuẩn. Vi khuẩn phân lập được bảo quản trong dung dịch môi trường chứa 20% glycerol ở -80℃ (Hình 2a).

Khuếch đại PCR và giải trình tự các gen cụ thể của vi khuẩn

Để nghiên cứu chức năng và mức độ phổ biến của các gen độc lực tiềm ẩn trong plasmid VpTPD 187, 791 bp, các nhà khoa học đã thiết kế các bộ mồi PCR nhắm vào các trình tự gen mã hóa các miền liên quan đến độc lực. Các mồi PCR được sử dụng để khuếch đại các gen sau:

• 16S rRNA: gen kiểm soát này được sử dụng để làm chuẩn nội bộ.
• VHVP-1-P: gen mã hóa miền liên quan đến TcA trong gen vhvp-1.
• VHVP-2-P: gen mã hóa các miền liên quan đến SpvB trong gen vhvp-2.
• VHVP-3-P: gen mã hóa miền liên quan đến TccC trong gen vhvp-3.

Quá trình khuếch đại PCR được thực hiện theo hướng dẫn của Premix Ex Taq Phiên bản 2.0 (TaKaRa, Dalian).

Hỗn hợp phản ứng PCR 25 μL chứa 12,5 μL Premix Ex Taq, 0,5 μL mỗi mồi thuận và mồi ngược (10 μM), 1 μL DNA mẫu và 10,5 μL ddH₂O. Các điều kiện khuếch đại như sau: biến tính ban đầu ở 95℃ trong 5 phút; biến tính ở 95℃ trong 30 giây, nhiệt độ ủ thích hợp trong 30 giây, kéo dài ở 72℃ trong một thời gian xác định, trong 35 chu kỳ; phần mở rộng cuối cùng ở 72℃ trong 10 phút.

 Đối với gen 16S rRNA, nhiệt độ ủ là 54℃ và thời gian kéo dài ở 72℃ là trong 90 giây (Chen, 2015; Miller, 2013). Đối với VHVP-1-P và VHVP-3-P, nhiệt độ ủ là 58℃ và thời gian kéo dài ở 72℃ là trong 30 giây. Đối với VHVP-2-P, nhiệt độ ủ là 60℃ và thời gian kéo dài ở 72℃ là trong 1 phút.

Sau khi khuếch đại PCR, các sản phẩm được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%. Các sản phẩm PCR mong muốn được tinh chế bằng bộ thu hồi gel (OMEGA, Hoa Kỳ), sau đó đưa vào vector pMD18-T (TaKaRa, Đại Liên, Trung Quốc) để biến đổi. Các dòng vô tính dương tính đã được gửi đến Sangon Biotech (Thượng Hải, Trung Quốc) để giải trình tự. Trình tự nucleotide được so sánh và phân tích bằng công cụ BLAST trong NCBI.

Bảng 1. Trình tự mồi của 16S rRNA, VHVP-1-P, VHVP-2-P, VHVP-3-P, rctB, rpoD và toxR cho PCR.

Thử nghiệm cảm nhiễm bằng cách ngâm

Trước thử nghiệm, các chủng thử nghiệm được nuôi cấy trong môi trường Tryptic Soy Broth (TSB+) được bổ sung thêm NaCl và ủ qua đêm ở 28 ℃. Vi khuẩn thu được được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút, rửa bằng nước biển vô trùng và thả nổi trong nước biển vô trùng ba lần. Mật độ tế bào được đo bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 600 nm và được điều chỉnh thành 1.0, tương ứng với khoảng 1×10⁹ tế bào/mL. Giá trị này được xác nhận bằng phương pháp pha loãng số đĩa. Cuối cùng, vi khuẩn được pha loãng trong nước biển vô trùng đến nồng độ 1×10⁴ CFU/mL.

Nồng độ huyền phù vi khuẩn 1×10⁴ CFU/mL được sử dụng để nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng vi khuẩn khác nhau trên ấu trùng tôm. Ấu trùng tôm khỏe mạnh được chọn ngẫu nhiên và chia thành các nhóm 20 con trong cốc 1 L, mỗi nhóm được tiêm một huyền phù vi khuẩn khác nhau. Nhóm đối chứng dương tính được tiêm Vp-JS20200428004-2, và nhóm đối chứng âm tính chỉ được tiêm nước biển vô trùng. Mỗi nhóm có ba lần lặp lại và được sục khí trong 24 giờ. Tôm được cho ăn bình thường hai lần một ngày. Sự phát triển của bệnh và tỷ lệ chết được ghi lại sau mỗi 8 giờ và thời gian gây chết trung bình (LT₅₀) sau đó được tính toán. Tôm chết ngay lập tức được loại bỏ, cố định trong dung dịch paraformaldehyde 4% và được phân tích bệnh lý mô. Ngoài ra, một số tôm sắp chết đã được phân lập, nuôi cấy, làm sạch và xác định xem vi khuẩn gây bệnh có phải là chủng độc lực hay không.

Nhận dạng vi khuẩn

Sau khi xác định phân loại cấp độ chi của chủng vi khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rRNA, các nhà khoa học đã tiến hành xác định các chủng được chọn từ các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp Phân tích trình tự đa vị trí (MLSA). Phương pháp MLSA sử dụng ba gen mã hóa protein (rctB, rpoD và toxR) để phân biệt các chủng vi khuẩn. Trình tự của ba gen này được nối và căn chỉnh để tạo ra một cây phát sinh gen thông qua thuật toán neighbor-joining với phân tích bootstrap (1000 lần lặp lại) trong MEGA7.

Các gen 16S rRNA và ba gen mã hóa protein (rctB, rpoD, và toxR), được khuếch đại bằng cách sử dụng phần nổi phía trên vi khuẩn đã đun sôi làm mẫu theo hướng dẫn của Premix Ex Taq Version2.0 (TaKaRa, Dalian). Theo các báo cáo trước đây, trình tự gen rctB và rpoD được bảo tồn thu được thông qua chương trình nhiệt: (i) 95℃ trong 5 phút; (ii) 10 chu kỳ 95℃ trong 1 phút, 54℃ trong 2 phút và 72℃ trong 1 phút 15 giây; (iii) 25 chu kỳ 95℃ trong 35 giây, 54℃ trong 2 phút và 72℃ trong 1 phút 15 giây; (iv) bước mở rộng ở 72℃ trong 10 phút. Việc khuếch đại đoạn toxR được thực hiện bằng phương pháp PCR chạm xuống: (i) 95℃ trong 5 phút; (ii) 8 chu kỳ 95℃ trong 1 phút, 62℃ trong 2 phút và 72℃ trong 1 phút 15 giây, với chu kỳ nhỏ giọt 1℃; (iii) 27 chu kỳ 95℃ trong 35 giây, 54℃ trong 2 phút và 72℃ trong 1 phút 15 giây; (iv) bước kéo dài ở 72℃ trong 7 phút (Pascual, 2010).

Phần mô bệnh học

Các mẫu cephalothorax và cơ bụng được ủ trong dung dịch cố định paraformaldehyde 4% trong 24 giờ, sau đó chuyển sang ethanol 70%. Các phần paraffin được chuẩn bị và nhuộm bằng H&E bằng phương pháp mô học do Lightner nêu ra (Lightner, 1996). Sau đó, các phần mô học được kiểm tra và chụp ảnh bằng hệ thống kính hiển vi ánh sáng (Nikon Eclipse E80i, Nikon Co., Tokyo, Nhật Bản).

Kết quả

Kết quả phân lập và phát hiện mầm bệnh tiềm ẩn

Nghiên cứu này đã phân lập, tinh chế và định danh được 448 chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh từ các mẫu tôm được thu thập từ nhiều địa phương khác nhau. Loại vi khuẩn phổ biến nhất là Vibrio spp., chiếm 53,79% (241/448) tổng số. Sau đó, 9 chủng mang gen độc lực tiềm tàng của Vp_TPD đã được chọn lọc từ 448 vi khuẩn nói trên bằng phương pháp phát hiện PCR và phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy cả 9 chủng này đều thuộc Vibrio. Trong số 9 chủng vi khuẩn có khả năng gây bệnh này, 2 chủng mang 3 gen nghi ngờ có độc lực (vhvp-1, vhvp-2 và vhvp-3), 4 chủng mang 2 gen nghi ngờ có độc lực và 3 chủng mang 1 gen nghi ngờ có độc lực (Bảng 2).

Khả năng gây bệnh của các chủng mang gen độc lực Vp_TPD được xác định bằng thử nghiệm cảm nhiễm

Tôm trong nhóm đối chứng dương tính (Vp-JS20200428004-2) đã chết trong vòng 64 giờ sau khi tiếp xúc với vi khuẩn, cho thấy các triệu chứng lâm sàng điển hình của bệnh TPD.  Nhóm đối chứng âm tính không có triệu chứng hoặc tỷ lệ chết nào trong suốt thí nghiệm. Ba nhóm thử nghiệm 20220614001-2, 20220614004-1 và 20220614009-1 có tỷ lệ chết tích lũy tương tự như nhóm đối chứng dương tính (Vp-JS20200428004-2) (Hình 2b). Ngoài ra, ba nhóm tôm thí nghiệm này cho thấy các dấu hiệu lâm sàng điển hình của TPD ở giai đoạn nhiễm trùng sớm, giữa và muộn (Hình 2c). Kết quả mô bệnh học của các phần mô phù hợp với kết quả của các nhóm tôm bị bệnh tự nhiên. Các nhóm khác cho thấy tỷ lệ tôm chết không đáng kể hoặc chỉ có một số ít tôm chết mà không có triệu chứng TPD điển hình.

Thời gian gây chết trung bình (LT₅₀) và khoảng tin cậy 95% của các chủng vi khuẩn được tính toán bằng phần mềm SPSS 27 của IBM. Kết quả cho thấy Vp-JS20200428004-2 và 3 chủng (20220614001-2, 20220614004-1, và 20220614009-1) ở nồng độ 10⁴ CFU/mL trên hậu ấu trùng P. vannamei như sau: 32,3 giờ (29,0 —35,5), 37,0 giờ (33,4—40,5), 34,8 giờ (31,1—38,5) và 20220614009-1: 43,5 giờ (39,6—47,4)

Tôm post trong nhóm thử nghiệm (20220614001-2, 20220614004-1, 20220614009-1) và nhóm đối chứng dương tính (Vp-JS20200428004-2) có tổn thương tương tự nhau ở ống gan tụy và ruột giữa. Tổn thương bao gồm hoại tử một phần và bong tróc các tế bào biểu mô. Trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng, các tế bào biểu mô của ống gan tụy và ruột giữa bị bong ra một chút và vi khuẩn tích tụ trong lòng. Ở giai đoạn giữa, hoại tử nặng hơn và bong tróc một phần (mũi tên đen) của các tế bào biểu mô ở ống gan tụy và ruột giữa (Hình 2d). Ở giai đoạn muộn, có sự hoại tử và bong tróc nghiêm trọng các ống gan tụy và mô ruột giữa, với một số lượng lớn vi khuẩn xâm chiếm lòng ống (mũi tên đỏ). Ngược lại, tôm giống khỏe mạnh không có thay đổi mô bệnh học đáng kể ở ống gan tụy và ruột giữa (Hình 2d).

Bảng 2. Phân tích khả năng gây bệnh của các chủng V_TPD nghi ngờ

Hình 1. Plasmid độc lực 187, 791 bp chứa ba gen độc lực tiềm ẩn (vhvp-1, vhvp-2 và vhvp-3). (a) Vị trí của gen vhvp-1, vhvp-2 và vhvp-3 trong plasmid độc lực 187, 791 bp. (b) Ba gen độc lực tiềm ẩn (vhvp-1, vhvp-2 và vhvp-3) và các đoạn mồi phát hiện nhắm vào các gen vhvp.

Hình 2. Phân tích khả năng gây bệnh của các chủng mang gen độc lực Vp_TPD được xác định bằng thử nghiệm cảm nhiễm. (a) Sơ đồ phân lập, phát hiện và phân tích khả năng gây bệnh của các vi khuẩn gây bệnh có khả năng gây nhiễm TPD ở tôm. (b) Tỷ lệ chết tích lũy của tôm bị nhiễm các chủng khác nhau. (c) Dấu hiệu lâm sàng của tôm thẻ chân trắng bị nhiễm Vp_TPD. Tôm bệnh (bên trái) có biểu hiện đường tiêu hóa trống rỗng và gan tụy nhợt nhạt hoặc không màu. Tôm khỏe mạnh có màu sắc bình thường và gan tụy đầy đặn. Thanh tỷ lệ = 2 mm. (d) Hình ảnh mô bệnh học của gan tụy và ruột của tôm thẻ chân trắng P. vannamei từ nhóm cảm nhiễm V_TPD ở các giai đoạn khác nhau sau nhiễm bệnh (bao gồm giai đoạn đầu, giai đoạn giữa, giai đoạn muộn). Mũi tên đen biểu thị các tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột bị bong ra; mũi tên màu đỏ biểu thị khối vi khuẩn V_TPD tập trung.

Nhận dạng vi khuẩn

Phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy ba chủng vi khuẩn 20220614001-2, 20220614004-1 và 20220614009-1 đều thuộc chi Vibrio. Sau đó, các nhà khoa học đã tiến hành phân tích ghép nối đa gen (Multi-locus sequence typing – MLST) dựa trên ba gen mã hóa protein (rctB, rpoD và toxR) để xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng này và xây dựng cây phát sinh gen (Hình 3). Kết quả cho thấy chủng 20220614001-2 thuộc về V. natriegens, chủng 20220614004-1 phân cụm với V. parahaemolyticus và chủng 20220614009-1 phân cụm với V. campbellii.

Hình 3. Tái tạo phát sinh chủng loại học dựa trên các chuỗi rpoD, rctB và toxR được nối. Phần trăm giá trị bootstrap (1000 lần lặp lại). Các trình tự tham chiếu được căn chỉnh theo mô tả của Pascual và cộng sự.

Dựa trên kết quả định danh vi khuẩn và thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo, các chủng Vibrio khác nhau mang gen độc lực chính của VpTPD có thể lây nhiễm sang tôm post P. vannamei và gây ra bệnh TPD. Điều này cho thấy sự đa dạng của các chủng Vibrio gây bệnh liên quan đến TPD và các chủng Vibrio gây bệnh tạm thời được đặt tên là Vibrio gây TPD (V_TPD).

Phát hiện VTPD bằng phân tích TaqMan qPCR và PCR

Từ năm 2021 đến 2022, chúng tôi đã thực hiện một cuộc khảo sát để xác định sự hiện diện của Vibrio gây bệnh TPD (V_TPD) ở P. vannamei và các loài thủy sản khác tại Trung Quốc. Tổng cộng có 694 mẫu sinh học được thu thập từ 10 tỉnh khác nhau, bao gồm Thiên Tân, Hà Bắc, Sơn Đông, Giang Tô, Hồ Nam, Hồ Bắc, Chiết Giang, Quảng Tây, Hải Nam và Tân Cương. Sử dụng phương pháp TaqMan qPCR để phát hiện các gen độc lực chính của V_TPD, tỷ lệ V_TPD dương tính là 23,1% (160/694). Trong các mẫu P. vannamei, tỷ lệ dương tính là 29,1% (135/463), trong khi ở mẫu P. japonicus, tỷ lệ dương tính là 18,3% (11/60). Không tìm thấy kết quả dương tính trên các mẫu Macrobrachium rosenbergii và Procambarus clarkii. Ngoài ra, tỷ lệ V_TPD dương tính là 22,9% (14/61) trong các mẫu mực và tằm, nhưng không tìm thấy kết quả dương tính nào trong các mẫu Margarya melanoide (hoang dã) (Hình 4b).

V_TPD được tìm thấy ở các ao nuôi trồng thủy sản tại hầu hết các tỉnh ven biển, với tỷ lệ phổ biến khác nhau (Hình 4d). Tỷ lệ nhiễm V_TPD cao nhất ở Tân Cương (93,33%, 14/15), tiếp theo là Quảng Tây (52,90%, 18/34) và Hồ Nam (42,9%, 3/7). Số lượng mẫu lớn nhất đến từ tỉnh Sơn Đông và tỉnh Hải Nam, với tỷ lệ nhiễm V_TPD lần lượt là 25% (64/256) và 28,66% (45/157). Tuy nhiên, không có mẫu dương tính với V_TPD nào được phát hiện ở tỉnh Chiết Giang và tỉnh Hồ Bắc (Hình 4c).

Phân tích mô bệnh học của các mẫu dương tính với VTPD trong TaqMan qPCR cho thấy rằng trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng VTPD (Hình 5a, b), các tế bào biểu mô gan tụy P. vannamei bị nhiễm bệnh đã co lại, và vi khuẩn tích tụ trong lòng. Trong các giai đoạn nhiễm bệnh sau này (Hình 5c, d), cấu trúc gan tụy của P. vannamei bị nhiễm bệnh bị tổn hại nghiêm trọng. Cấu trúc lòng hình elip hoặc hình tròn của ống gan tụy không còn nguyên vẹn. Các tế bào biểu mô của ống gan tụy bị hoại tử và bong ra (mũi tên đen). Đồng thời, có thể quan sát thấy một số lượng lớn vi khuẩn đang xâm chiếm (mũi tên đỏ). Sau đó, ở giai đoạn giữa của nhiễm trùng (Hình 5e), các tế bào biểu mô ruột bắt đầu bong ra (mũi tên đen), và một số lượng lớn vi khuẩn tập hợp lại và định cư trong lòng ruột (mũi tên đỏ). Khi nhiễm trùng tiến triển, mức độ nghiêm trọng của tổn thương ruột giữa trở nên trầm trọng hơn. Trong giai đoạn sau của nhiễm trùng (Hình 5f), cấu trúc ruột giữa bị tổn thương nghiêm trọng và hầu hết các tế bào biểu mô đã bị bong tróc (mũi tên đen). Toàn bộ mô ruột chỉ còn lớp nền.

Hình 4. Điều tra dịch tễ học phân tử của bệnh V_TPD. ( a ) Sơ đồ điều tra dịch tễ học phân tử của V_TPD. (b) Tỷ lệ dương tính với V_TPD trong các mẫu (2021-2022) của các loài khác nhau dựa trên phân tích TaqMan qPCR. (c) Tỷ lệ nhiễm V_TPD trong các mẫu (2021-2022) từ các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc. (d) Tỷ lệ lây nhiễm V_TPD ở các vùng nuôi tôm khác nhau với tỷ lệ nhiễm khác nhau.

Hình 5. Kết quả mô bệnh học của tôm thẻ chân trắng P. vannamei bị nhiễm TPD nhân tạo. (a) và (b) là các bức ảnh hiển vi nhuộm H&E của các mô gan từ P. vannamei bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đầu hoặc giữa, (c) và (d) là các bức ảnh hiển vi nhuộm H&E của các mô gan tụy từ P. vannamei bị nhiễm bệnh ở giai đoạn muộn, (e) là ảnh hiển vi nhuộm H&E của mô ruột của P. vannamei ở giai đoạn đầu hoặc giữa, (f) là ảnh hiển vi nhuộm H&E của mô ruột của P. vannamei ở giai đoạn muộn. Mũi tên đỏ biểu thị tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột hoại tử; mũi tên đen biểu thị các tế bào biểu mô gan tụy hoặc ruột bị bong ra; mũi tên trắng biểu thị khối vi khuẩn V_TPD tập trung. (b) và (d) là các hình ảnh phóng to của (a) và (c), với tỷ lệ: (b), (d), (e) và (f) là 20 μm, (a) và (c) là 100 µm.

Thảo luận

Đầu năm 2020, bệnh TPD ở P. Vannamei bùng phát tại miền Nam Trung Quốc, khiến 70-80% trại giống và trại ương ở các tỉnh nuôi tôm ven biển phải đóng cửa, gây thiệt hại nặng nề đến ngành nuôi tôm của Trung Quốc. Nghiên cứu ban đầu cho thấy một chủng Vibrio parahaemolyticus (Vp_TPD) mới có độc lực cao là nguyên nhân gây ra bệnh TPD (Zou và cộng sự, 2020). Vào năm 2022, phát hiện này đã được Yang Feng (Yang, 2022) xác nhận thêm. Bằng cách phân tích khả năng gây bệnh của các sản phẩm protein có trọng lượng phân tử khác nhau từ Vp_TPD trên tôm post Penaeus vannamei và kết hợp các gen độc lực dự đoán của bộ gen Vp_TPD, Liu Shuang và cộng sự đã xác định ba loại protein có độc lực tiềm tàng mới (protein có độc lực cao Vibrio, VHVP-1, VHVP-2 và VHVP-3) được nghi ngờ là các yếu tố độc lực chính của Vp_TPD (Liu và cộng sự, 2023). Mục tiêu nghiên cứu là hiểu rõ hơn về tính đa dạng và mức độ phổ biến của mầm bệnh TPD, khảo sát dịch tễ học phân tử và nghiên cứu mầm bệnh TPD, và xác định đặc điểm sinh học cơ bản của Vp_TPD bằng phân lập vi khuẩn từ tôm bị bệnh TPD ở các tỉnh Trung Quốc từ năm 2021 đến 2022, xác định vi khuẩn bằng phương pháp phân tử, phát hiện gen protein độc lực Vp_TPD bằng PCR.

Trong nghiên cứu này, 448 vi khuẩn có khả năng gây bệnh đã được phân lập, tinh chế và định danh từ các mẫu bệnh tự nhiên từ năm 2021 đến năm 2022. Trong đó, chi Vibrio có tỷ lệ cao nhất, chiếm 53,79% (241/448), cho thấy chi Vibrio đóng vai trò quan trọng trong vi khuẩn gây bệnh của tôm nuôi. Chi Vibrio bao gồm nhiều loài, tìm thấy rộng rãi trong môi trường nuôi trồng thủy sản và trong cơ thể động vật nuôi. Đồng thời, chúng cũng là mầm bệnh cơ hội. Trong nuôi tôm, các loài Vibrio khác nhau có mức độ gây bệnh khác nhau. Phần lớn Vibrio gây bệnh khi môi trường bất lợi hoặc tôm có sức đề kháng yếu. Tuy nhiên, Một số loài Vibrio có khả năng gây bệnh ngay cả ở mức độ thấp (ví dụ: chủng AHPND).

Nghiên cứu phát hiện gen độc lực Vp_TPD trong 448 chủng vi khuẩn gây bệnh từ tôm nuôi. Chọn 9 chủng mang gen độc lực để thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo trên ấu trùng P. vannamei để phân tích tính đa dạng của vi khuẩn gây bệnh TPD. Kết quả cho thấy, trong số 9 chủng tuyển chọn (gồm 20220614001-2, 20220614004-1, 20220614009-1) là vi khuẩn gây bệnh mờ đục hậu ấu trùng. Kết quả phân tích song song đa gen (MLSA) dựa trên 3 gen mã hóa protein được bảo tồn (rctB, rpoD và toxR) cho thấy chủng 20220614001-2 là V. natriegens, chủng 20220614004-1 là V. parahemolyticus và chủng 20220614009- 1 là V. campbellii. Những kết quả này đã xác nhận rằng TPD có thể do nhiều chủng Vibrio khác nhau gây ra. Các chủng Vibrio gây bệnh tạm thời được đặt tên là Vibrio gây TPD (V_TPD). Wang và cộng sự đã phân tích các mầm bệnh ưu thế gây ra TPD và phát hiện ra rằng các mầm bệnh gây ra TPD có độ tương đồng cao hơn với V. alginolyticus, V. harveyi và V. parahaemolyticus (Wang, 2021). Yang và cộng sự phát hiện ra rằng tác nhân gây bệnh TPD là chủng V. parahaemolyticus (Yang, 2022). Cần có nghiên cứu thêm về sự đa dạng của mầm bệnh TPD.

Điều mấu chốt là tất cả V_TPD hiện được phát hiện đều thuộc về nhánh Harveyi. Nhánh Harveyi bao gồm tổng cộng 11 loài, cụ thể là V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. harveyi, V. azureus, V. sagamiensis, V. campbellii, V. Owensii, V. natriegens, V. costicola, V. jasicida và V. mytili. Tuy nhiên, một số thành viên nhất định của nhánh Harveyi, bao gồm V. harveyi, V. campbellii và V. parahaemolyticus, là những mầm bệnh quan trọng ở các sinh vật dưới nước (Thompson và cộng sự 2004; Hettipala và cộng sự, 2012). Điều này nhấn mạnh khả năng gây bệnh không phụ thuộc vào loài mà phụ thuộc vào đặc điểm của từng chủng và mức độ gây bệnh cũng khác nhau giữa các chủng. Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm chủng để phát triển chiến lược phòng chống hiệu quả.

Xem xét tính đa dạng của các chủng TPD, phân tích cơ chế gây bệnh bằng cách sử dụng kết quả phân tích PCR sử dụng ba bộ mồi. Các chủng 20220614001-2, 20220614004-1 và 20220614009-1 đều cho kết quả dương tính với gen vhvp-2 và gen vhvp-3 với mức độ dương tính mạnh. Tuy nhiên, chủng 20220614004-1 không mang gen vhvp-1. Trong khi đó chủng 20210807003-1 (chỉ mang gen vhvp-1) và chủng 20211213001-2 (mang cả gen vhvp-1 và vhvp-3) vẫn không gây bệnh. Những kết quả này cho thấy rằng sự tồn tại của gen độc lực bị nghi ngờ là vhvp-1 hoặc sự tồn tại cùng tồn tại của gen vhvp-1 và vhvp-3 không gây ra siêu độc lực của Vp_TPD, điều này càng khẳng định thêm vhvp-2 là gen độc lực chính của VpTPD. Tuy nhiên, Bảng 2 cho thấy các chủng độc lực chứa ít nhất hai PCR dương tính với gen vhvp-2 và vhvp-3. Dựa trên những phát hiện này, sự kết hợp giữa gen vhvp-2 và vhvp-3 có thể dẫn đến khả năng gây bệnh cao hơn. Việc kiểm soát điều hòa biểu hiện gen độc lực cũng có thể là yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh.

Theo kết quả dự đoán của các gen mã hóa trong 187, 791 bp plasmid bằng cách sử dụng Dịch vụ tìm kiếm miền bảo tồn trực tuyến (CD Search) trong NCBI, yếu tố độc lực tiềm ẩn của VHVP-2 được phát hiện có chứa các vùng bảo tồn của plasmid độc lực Salmonella 65 protein kDa B (SpvB), vùng giữa/đầu C của độc tố diệt côn trùng TcdB, và miền vùng giữa/đầu N của độc tố TcdB; và yếu tố độc lực tiềm ẩn của VHVP-3 sở hữu các vùng được bảo tồn trong số các vùng được bảo tồn của vùng liên quan đến phức hợp độc tố Tc. Protein Spv được coi là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất trong quá trình nhiễm Salmonella và protein SpvB đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của vi khuẩn (Aguilera và cộng sự, 2012; Lesnicket và cộng sự, 2001; Kurita và cộng sự, 2003). Nó có thể tiết trực tiếp vào tế bào chất và làm trung gian cho quá trình ribosyl hóa Actin của tế bào chủ, ức chế quá trình trùng hợp và sắp xếp lại khung tế bào Actin, gây ra sự phân mảnh sợi Actin, phá vỡ cấu trúc khung xương của tế bào, dẫn đến apoptosis của tế bào chủ và làm trầm trọng thêm tổn thương tế bào. Các nghiên cứu sâu hơn đã phát hiện ra rằng dư lượng proline kết nối đầu C và đầu N không thể thiếu đối với độc tính của protein độc lực trong quá trình chuyển từ vi khuẩn sang tế bào chủ. Lần đầu tiên, phức hợp độc tố diệt côn trùng có trọng lượng phân tử cao (Tcs) được xác định ở Photorhabdus luminesces W14, bao gồm 4 locus phức hợp độc tố (tca, tcb, tcc, và tcd) (Lyerly và cộng sự, 1982; Zhan và cộng sự, 2016). Trong số các Tcs này, đã có báo cáo rằng tca có thể tham gia vào việc liên kết và chuyển vị trí sang các thụ thể trên màng, tcc có thể tham gia vào quá trình tự dịch chuyển đến màng tế bào đích thông qua con đường nội tiết và tcb hoạt động như một đầu nối chức năng giữa tca và tcc.

Trong khi đó, Yang và cộng sự (2023) cho rằng việc V_TPD sản sinh ra độc tố Tcs là nguyên nhân chính khiến nó có khả năng gây bệnh cao. Dựa trên nghiên cứu về VHVP-1, VHVP-2 và VHVP-3, VHVP-3 chứa miền bảo tồn của TccC có thể đóng vai trò phụ trợ trong siêu độc lực của Vp_TPD. Điều quan trọng là xác định liệu gen vhvp-3 có đóng vai trò phụ trong quá trình gen vhvp-2 hoạt động như gen có độc lực cao hay không. Để đạt được mục tiêu này, các nghiên cứu dịch tễ học trong tương lai và các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo sử dụng gen độc lực chính, các chủng đã bị loại bỏ và các chủng bổ sung có thể được tiến hành để xác định tác động của nhiều gen protein độc lực đối với khả năng gây bệnh.

Nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát dịch tễ học về TPD vào năm 2021 và 2022, đồng thời thu thập 694 mẫu sinh học từ các tỉnh khác nhau ở Trung Quốc. Kết quả phân tích TaqMan qPCR (gen vhvp-2) và PCR (cả vhvp-2 và vhvp-3) ở các mẫu trên cho thấy tỷ lệ V_TPD dương tính ở các mẫu là 23,1% (160/694), tỷ lệ dương tính là 23,1% (160/694). Tỷ lệ V_TPD trong các mẫu P. vannamei là 29,1% (135/463). Tỷ lệ V_TPD dương tính trong các mẫu P. japonicus là 18,3% (11/60), nhưng không tìm thấy tỷ lệ dương tính ở M. rosenbergii và Procambarus clarkii. Tỷ lệ V_TPD dương tính ở mẫu mực, tằm là 22,9% (14/61). Không có kết quả tích cực nào được tìm thấy ở ốc hoang dã. Những kết quả này cho thấy các loài nuôi như P. vannamei và P. japonicus nhạy cảm hơn với V_TPD và có nhiều khả năng bị nhiễm hoặc mang mầm bệnh này hơn. Tôm nuôi nước ngọt như M rosenbergii và Procambarus clarkii có thể không bị ảnh hưởng bởi V_TPD. Sinh vật làm mồi cho tôm có nguy cơ mang hoặc bị nhiễm bệnh V_TPD. Các mẫu dương tính với V_TPD đã được tìm thấy trong các ao nuôi trồng thủy sản ở hầu hết các tỉnh ven biển của Trung Quốc, nhưng có sự khác biệt về mức độ phổ biến giữa các vùng. Tỷ lệ nhiễm V_TPD cao nhất là ở tỉnh Tân Cương với 93,33% (14/15), tiếp theo là tỉnh Quảng Tây với 52,90% (18/34) và tỉnh Hồ Nam với 42,9% (3/7). Số lượng mẫu lớn nhất đến từ tỉnh Sơn Đông và tỉnh Hải Nam, với tỷ lệ lây nhiễm V_TPD lần lượt là 25% (64/256) và 28,66% (45/157). Tuy nhiên, không có mẫu dương tính với VTPD nào được phát hiện ở tỉnh Chiết Giang và tỉnh Hồ Bắc. Từ năm 2021 đến năm 2022, do ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19 nên cỡ mẫu của một số tỉnh không lớn, điều này có thể khiến kết quả phổ biến có một số hạn chế. Các mẫu dương tính được phát hiện ở hầu hết các ao nuôi tôm ở các vùng khác nhau của Trung Quốc, với một số khu vực cho thấy tỷ lệ phát hiện dương tính lên tới hơn 50%. Điều này cho thấy V_TPD phổ biến và lây lan ở các vùng nuôi tôm ven biển ở Trung Quốc, có nguy cơ lây truyền và lây lan cao.

Tóm lại, nghiên cứu này không chỉ xác định mức độ phổ biến của TPD ở các loài nuôi tôm chính ở Trung Quốc và điều tra tính đa dạng gây bệnh mà còn đánh giá mối liên hệ giữa các gen độc lực và khả năng gây bệnh. Hiểu được sự tương tác phức tạp giữa các gen độc lực này và các cơ chế điều hòa là rất quan trọng để hiểu được các cơ chế làm tăng khả năng gây bệnh trong nhiễm trùng V_TPD và giúp giảm thiểu tác động của các yếu tố độc lực này và nâng cao khả năng quản lý và kiểm soát các bệnh do V_TPD gây ra trong môi trường nước.

Theo Tianchang Jia, Shuang Liu, Xingtong Yu, Tingting Xu, Jitao Xia, Wenxiu Zhao, Wei Wang, Jie Kong, Qingli Zhang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848624000449

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG