Tác Dụng Sinh Học Của Chủng Streptomyces Đơn Thuần Hoặc Kết Hợp Với Bacillus Và LactoBacillus Trên Tôm Giống Litopenaeus vannamei

Tóm tắt

Chúng tôi nghiên cứu tác động của hai chủng Streptomyces được sử dụng riêng lẻ và kết hợp với Bacillus và LactoBacillus, về sự phát triển, hệ vi sinh vật, số lượng tế bào máu và hoạt tính superoxide dismutase (SOD) của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei. 8 nhóm thử nghiệm được cho ăn 30 ngày với N7 (Streptomyces N7), RL8 (Streptomyces RL8), Strep (Streptomyces N7) và RL8), Lac (LactoBacillus graminis), Bac (hỗn hợp Bacillus) hoặc kết hợp của Lac- Strep, Bac-Strep và Mix (hỗn hợp của Bac, Lac và Strep). Nhóm được cho ăn không bổ sung probiotic đóng vai trò đối chứng. Sau khi xử lý, tôm được cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus và tỷ lệ sống được ghi nhận trong 4 ngày. Nhóm Bac-Strep cho thấy hiệu suất tăng trưởng tốt hơn đáng kể (P<0,05) so với nhóm đối chứng, tiếp theo nhóm N7, RL8 và Strep cho thấy hiệu suất tốt nhưng không đáng kể. Tất cả các nhóm bổ sung Streptomyces, ngoại trừ Mix, cho thấy lượng Vibrio giảm đáng kể từ gan tụy, giống như Bac-Strep từ nước, trong khi chúng tạo ra sự giảm nhẹ các vi sinh vật dị dưỡng. Tất cả các nhóm được cho ăn probiotic đều có số lượng tế bào máu cao hơn đối chứng, nhưng nó chỉ có ý nghĩa đối với Strep và Bac-Strep. Thử nghiệm cảm nhiễm tôm với V. parahaemolyticus đã kích thích hoạt tính SOD của các nhóm tôm có bổ sung probiotic, ngoại trừ RL8, có SOD cao hơn nhưng không đáng kể, và nhóm N7 và Strep. Tất cả nhóm được bổ sung probiotic cho thấy tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, ngoại trừ cho N7 và Strep. Nghiên cứu này cho thấy rằng sử dụng một số chủng Streptomyces riêng lẻ hoặc kết hợp với các chi khác, chủ yếu là Bacillus, có tác dụng sinh học trên tôm bằng cách cải thiện sự tăng trưởng các thông số, điều chỉnh phản ứng miễn dịch, điều chỉnh hệ vi sinh vật trong nước và vật chủ, và tăng cường sức đề kháng với bệnh tật.

1. Giới thiệu

Nuôi trồng thủy sản là lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển nhanh nhất, chiếm gần 50% sản lượng đánh bắt được con người tiêu thụ trên toàn thế giới. Đã có ước tính rằng sản lượng nuôi trồng thủy sản sẽ tăng 2.5 lần vào năm 2030 để duy trì mức tiêu thụ bình quân đầu người hiện nay. Nếu thực hiện các biện pháp có trách nhiệm, nuôi cá sẽ mang lại doanh thu lâu dài cho tăng trưởng kinh tế toàn cầu và an toàn thực phẩm (FAO 2014). Các động vật thủy sinh như cá có vây, động vật giáp xác và động vật thân mềm đặc biệt nhạy cảm với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh, bao gồm các loài thuộc chi Aeromonas, Vibrio và Pseudomonas. Tuy nhiên, những vi sinh vật này là một phần của hệ vi sinh vật nước và có thể trở thành mầm bệnh trong điều kiện căng thẳng, chất lượng nước kém hoặc suy giảm sinh lý của động vật thủy sinh (Balcazar và cộng sự 2006; Lara-Flores và cộng sự 2010).

Các thuốc hóa chất thường được sử dụng để kiểm soát quần thể vi khuẩn không mong muốn. Tuy nhiên, cách làm này đã kích thích sự gia tăng tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn và các bệnh truyền nhiễm không thể kiểm soát được (Gullian và cộng sự 2004; Venkat và cộng sự 2004; Rodgers và Furones, 2009), cũng như ô nhiễm môi trường và độc tính đối với con người khi tiêu thụ cá do tồn dư hóa chất (Haws và cộng sự 2010). Trong bối cảnh này, các vi sinh vật có lợi hoặc men vi sinh đã nổi lên như những tác nhân hiệu quả để kiểm soát các bệnh truyền nhiễm thông qua cơ chế loại trừ cạnh tranh. Mặc dù nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản còn khá mới mẻ nhưng chúng đã cho thấy những tác dụng có lợi đối với các loài quan trọng như cá rô phi, động vật thân mềm, tôm và cá hồi (Vine và cộng sự 2006). Probiotic được cung cấp ở giai đoạn ấu trùng và ấu trùng làm giảm tỷ lệ chết, tăng tốc độ tăng trưởng và cải thiện các thông số miễn dịch của động vật mà không để lại bất kỳ dư lượng độc hại nào (Nimrat và cộng sự 2011). Chúng thường được áp dụng cùng với thức ăn hoặc trong nước để cải thiện chất lượng các thông số thủy sinh (Verschuere và cộng sự 2000).

Hầu hết các chế phẩm sinh học được đề xuất làm tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản đều thuộc về vi khuẩn axit lactic (LactoBacillus và Carnobacteria), nhưng các chi khác như Bacillus, Pseudomonas, Flavobacter, Aeromonas và Vibrio cũng đã được xem xét (Bourouni và cộng sự 2012). Chúng mang lại nhiều lợi ích như cải thiện tốc độ tăng trưởng, hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng cường phản ứng miễn dịch, tỷ lệ mắc bệnh thấp hơn và tỷ lệ sống cao hơn cũng như chất lượng nước được cải thiện (Kumar và cộng sự 2016). Tuy nhiên, bệnh truyền nhiễm vẫn là một vấn đề nghiêm trọng đối với vật nuôi thủy sản và do đó, các chế phẩm sinh học mới và hiệu quả hơn không ngừng được khám phá.

Môi trường biển là nơi sinh sống của nhiều loại vi sinh vật không có ở môi trường trên trái đất (Ramesh và Mathivanan 2009). Nhiều hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm các chất kháng khuẩn, chống ung thư và ức chế miễn dịch cũng như các enzyme khác nhau đã được phát hiện trong các vi sinh vật biển, chủ yếu là Actinomycetes (Tanaka và Omura 1990). Trong số đó, chi Streptomyces được coi là loài sản xuất kháng sinh xuất sắc (Okazaki và Okami 1972; Ellaiah và Reddy 1987). Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu cho thấy chi này được coi là tác nhân sinh học cho nuôi trồng thủy sản (Das và cộng sự 2006). Mục đích của nghiên cứu này là nghiên cứu ảnh hưởng của chủng Streptomyces N7 và RL8, riêng lẻ hoặc kết hợp với các chế phẩm sinh học khác, lên sự tăng trưởng, hệ vi sinh vật, hoạt tính superoxide dismutase, số lượng tế bào máu và tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei sau khi cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tôm và nuôi dưỡng tôm

1500 con tôm thẻ chân trắng L. vannamei khỏe mạnh được nuôi trong trại giống, mua từ Công ty Acuiculura Mahr tại La Paz, B.C.S., Mexico và được thích nghi trong Phòng thí nghiệm Động vật thân mềm của CIBNOR trong 7 ngày. Tôm được nuôi trong bể sợi thủy tinh 1500 L chứa nước biển được lọc qua lưới 1 micromet và khử trùng dưới tia UV. Nước được giữ ở nhiệt độ 29 ± 1°C, độ mặn 37 PSU và được sục khí liên tục trong suốt thí nghiệm. Tôm được cho ăn tự do ba lần mỗi ngày với khẩu phần ăn thương mại (PIASA, 35% hàm lượng protein).

2.2. Các chủng probiotic và gây bệnh

Các chủng probiotic được sử dụng trong nghiên cứu này là Streptomyces sp. RL8 và Streptomyces sp. N7, được phân lập từ trầm tích biển và được chọn lọc trong các nghiên cứu in vitro trước đây (García-Bernal và cộng sự 2015); hỗn hợp Bacillus (Bac), được tạo thành bởi Bacillus tequilensis YC5-2, Bacillus endphyticus C2-2, và B. endphyticus YC3-B (Luis-Villaseñor và cộng sự 2011); và LactoBacillus graminis (Lac) (Abasolo-Pacheco và cộng sự 2015), thuộc dữ liệu sinh vật nuôi của CIBNOR. Ngoại trừ chủng L. graminis được nuôi cấy trong môi trường Man-Rogosa-Sharpe (MRS), tất cả các chủng khác đều được nuôi cấy trong môi trường tryptone soy broth (TSB) có chứa 3% natri clorua. Các chủng Streptomyces được nuôi cấy trong điều kiện lắc ở 30°C trong 7 ngày, trong khi Bacillus và LactoBacillus được ủ ở 35°C trong 24 – 48 giờ. Sau đó, quá trình nuôi cấy được ly tâm ở 4696 × g và 4°C trong 10 phút và cặn thu được được rửa hai lần bằng nước biển vô trùng. Viên cuối cùng được đặt trong trạng thái lơ lửng trong nước biển vô trùng đến mật độ quang học là 1 ở bước sóng 600 nm đối với Actinomycetes (Gopalakrishnan và cộng sự 2014) và 540 nm đối với Bacillus và LactoBacillus, tương đương với 1 × 10⁹ CFU/mL (Luis-Villaseñor và cộng sự 2011; Abasolo-Pacheco và cộng sự 2015). V. parahaemolyticus CAIM 170 gây bệnh được nuôi cấy trong TSB ở 35°C trong 24 – 48 giờ. Nuôi cấy được ly tâm ở 4696× g và 4°C trong 10 phút, và viên thu được được đặt lơ lửng trong dung dịch muối 3% (w/v) đến mật độ quang học là 1, tương đương với 1 × 10⁹ CFU/mL. Huyền phù tương quan với số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) bằng cách sử dụng độ pha loãng gấp 10 lần và trải đĩa trên tryptone soy agar (TSA) cho tất cả các vi khuẩn, ngoại trừ L. graminis được sử dụng thạch MRS.

2.3. Chuẩn bị men vi sinh

Huyền phù Probiotic được bổ sung hàng tuần vào thực phẩm (Purina^®, Obregón City, Mexico, 35% protein) bằng cách xác định nồng độ cuối cùng là 1 × 10⁶ CFU/g thức ăn đối với các chủng LactoBacillus và Bacillus (Luis-Villaseñor và cộng sự 2011; Abasolo-Pachecoet cộng sự 2015). Các chủng Streptomyces đã được thêm vào ở mức 1 × 10⁸ CFU/g, đây là giá trị trung bình của khoảng liều được sử dụng cho hầu hết các chế phẩm sinh học (Newaj-Fyzul và Austin 2014). Huyền phù vi khuẩn được phun đều lên toàn bộ bề mặt viên, để khô ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ và bảo quản ở 4°C cho đến khi sử dụng. Khẩu phần ăn đối chứng nhận được một lượng nước biển vô trùng tương đương. Tải lượng vi khuẩn trong thực phẩm được xác nhận bằng số lượng đĩa sử dụng đĩa TSA đối với Streptomyces và đĩa thạch Bacillus và MRS đối với LactoBacillus.

2.4. Điều trị bằng probiotic

Tôm có trọng lượng trung bình ban đầu là 0,78 ± 0,32 g được phân ngẫu nhiên vào các bể sợi thủy tinh 120 L (50 con/bể) chứa nước đã lọc (cỡ lỗ 5 μm) và nước biển được khử trùng bằng tia cực tím, ở 29 ± 1°C với sục khí liên tục. 9 nhóm thử nghiệm với 3 lần lặp lại, mỗi nhóm được đặt như sau: RL8 (Streptomyces sp. RL8), N7 (Streptomyces sp. N7), Strep (Streptomyces sp. RL8 và Streptomyces sp. N7; tỷ lệ 1:1), Lac (L. graminis), Lac-Strep (L. graminis kết hợp với Streptomyces sp. RL8 và Streptomyces sp. N7; tỷ lệ 1:1:1), Bac (B. tequilensis YC5-2, B. endphyticus C2-2, và B. endphyticus YC3- B; tỷ lệ 1:1:1), Bac-Strep (B. tequilensis YC5-2, B. endphyticus C2-2, B. endphyticus YC3-B, Streptomyces sp. RL8, và Streptomyces sp. N7; 1:1: tỷ lệ 1:1:1), Nhóm trộn (tất cả các probiotic; trộn theo tỷ lệ bằng nhau) và nhóm đối chứng (không bổ sung probiotic).

Tôm được cho ăn tự do và các chất dạng hạt được loại bỏ hàng ngày bằng ống hút, sau đó bổ sung cùng một lượng nước thải (25%). Họ cũng nhận được một chu kỳ quang học tự nhiên của ánh sáng. Khi kết thúc điều trị (30 ngày), mức tăng kích thước (SI), tăng trọng (WG), tăng trọng hàng ngày (DWG), tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (FCR) và tỷ lệ sống (SR) của các nghiệm thức khác nhau được tính toán theo các phương pháp được mô tả trước đây (Felix vàSudharsan 2004; Venkat và cộng sự 2004).

2.5. Đánh giá vi sinh

Gan tụy được cắt bỏ bằng dao mổ vô trùng, cân và đồng nhất bằng nước muối sau khi khử trùng từng con bằng ethanol 70%. Sau đó, thực hiệm độ pha loãng gấp 10 lần và 100 µL phần dịch được mở rộng trên các đĩa thạch biển và TCBS để tính lần lượt tổng số vi khuẩn dị dưỡng và Vibrio. Số lượng vi sinh vật này cũng được xác định từ nước nuôi.

2.6. Tổng số lượng tế bào máu

Sau 30 ngày điều trị, 3 con tôm trong mỗi bể, tổng cộng 9 con tôm trong mỗi nghiệm thức, được sử dụng để lấy mẫu hemolymp. Khoảng 200 µL hemolymp trên mỗi con tôm đã được rút ra khỏi phần bụng đầu tiên của vùng bụng bằng ống tiêm insulin (27 G × 13 mm). Ống tiêm trước đây được chuẩn bị với thể tích chống đông máu 2:1 (NaCl 450 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM + EDTA-Na 2 10 nM, pH 7,3, với áp suất thẩm thấu 850 mOsm/ kg) (Vargas-Albores và cộng sự 1993). Các mẫu hemolymp được đặt trên đá và xử lý ngay lập tức; sau đó, 50 μL mỗi dung dịch (hemolymp/thuốc chống đông máu) được trộn với 150 μL dung dịch formaldehyde 6% (1:3) để thực hiện đếm tế bào bằng buồng Neubauer. Tổng số tế bào máu được ghi lại dưới dạng tế bào trên mililit.

2.7. Cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus CAIM 170

Cảm nhiễm được thực hiện bằng phương pháp ngâm sử dụng huyền phù V. parahaemolyticus CAIM 170 ở 1 × 10⁶ CFU/mL (Austin và cộng sự 1995), sau khi sử dụng probiotic trong 30 ngày. Tất cả 9 nhóm có 10 con tôm và hai lần lặp lại đều được cảm nhiễm. Tỷ lệ sống sót được ghi nhận hàng ngày trong 4 ngày

2.8. Hoạt tính của Superoxide disutase

Hoạt tính Superoxide dismutase (SOD) được xác định 96 giờ sau khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Mô cơ từ 6 con tôm trên mỗi lần lặp lại của mỗi nhóm thử nghiệm được cắt bỏ và đồng nhất hóa (100 mg) trong 500 μL dung dịch đệm photphat (pH 7,5), bằng cách sử dụng chất đồng nhất mô. Chất đồng nhất được ly tâm ở tốc độ 4696 × g trong 10 phút ở 4°C, và chất nổi phía trên được bảo quản ở -20°C cho đến khi sử dụng. Hoạt tính superoxide dismutase được đo bằng bộ xác định SOD (số 19160, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Kết quả được biểu thị dưới dạng thước đo gián tiếp hoạt tính SOD bằng tỷ lệ phần trăm phản ứng ức chế sự hình thành phức hợp formazan WST-1 (Dudonné và cộng sự 2009).

2.9. Phân tích thống kê

Tính quy chuẩn ban đầu được phân tích bằng thử nghiệm Kolmogorov-Smirnov và sau đó được xác nhận bằng thử nghiệm Levene về tính đồng nhất của phương sai (Sokal và Rohlf 1981). Sau đó, ANOVA một chiều được sử dụng để đánh giá sự khác biệt về tốc độ tăng trưởng, hoạt động SOD và khả năng sống sót giữa các nhóm thử nghiệm. Dữ liệu phần trăm (SOD và tỷ lệ sống) được chuyển đổi arcsine trước khi phân tíchANOVA. Các thử nghiệm Kruskal-Wallis/Mann Whitney được sử dụng cho dữ liệu phi tham số. Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa ở P <0,05. Phân tích được thực hiện bằng gói Thống kê SPSS phiên bản 21 dành cho windows (SPSS Inc., Chicago, IL).

3. Kết quả

3.1. Ảnh hưởng của probiotic đến tăng trưởng tôm

Một số thông số tăng trưởng (SI, WG, DWG và FCR) đã được xác định sau khi cho tôm thẻ chân trắng L. vannamei ăn với các khẩu phần ăn probiotic khác nhau trong 30 ngày (Bảng 1). Trọng lượng trung bình của tôm khi kết thúc thí nghiệm là 4,78 ± 1,00 g. Mặc dù không có ý nghĩa thống kê nhưng Streptomyces sp. N7, Streptomyces sp. RL8 và sự kết hợp của chúng (nhóm N7, RL8 và Strep) cho thấy hiệu suất tăng trưởng tốt hơn so với nhóm đối chứng probiotic (Lacand Bac) và đối chứng không bổ sung, ngoại trừ nhóm RL8 và Strep cho thấy kích thước tăng lên đáng kể so với nhóm đối chứng Lac và Bac (P < 0,05) (Bảng 1). Sự kết hợp giữa Streptomyces với Bacillus (Bac-Strep) mang lại hiệu suất tăng trưởng (P < 0,05) tốt hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (Lac, Bac và nhóm đối chứng không bổ sung), không bao gồm việc tăng kích thước. Sự kết hợp của Streptomyces với LactoBacillus (Lac-Strep) và với LactoBacillus cộng với Bacillus (Mix) không mang lại bất kỳ sự cải thiện tăng trưởng nào. Trên thực tế, sự kết hợp của tất cả các chủng probiotic (nhóm Mix) gây ra các thông số tăng trưởng thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng và nhóm được bổ sung probiotic (P 0,05). Không có trường hợp chết nào liên quan đến bất kỳ nghiệm thức bằng probiotic nào trong thí nghiệm cho ăn 30 ngày.

Bảng 1. Ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến các thông số tăng trưởng của L. vannamei

Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Các giá trị trong cùng một cột với các chữ cái viết thường khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05).

Kích thước SI tăng, tăng trọng WG, tăng trọng DWG hàng ngày, tỷ lệ chuyển đổi thức ăn FCR, tỷ lệ sống SR.

3.2. Phân tích vi khuẩn và số lượng tế bào máu

Số lượng Vibrio trong nước đã giảm một log đơn vị bởi probiotic RL8 và Mix với sự khác biệt không đáng kể và giảm mạnh 4 log đơn vị ở nhóm Bac-Strep với sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05) (Bảng 2). Vibrio giảm đáng kể trong gan tụy của trường hợp. 4 đơn vị log cũng được thực hiện bởi tất cả các nhóm chứa Streptomyces (tức là RL8, N7, Strep, Lac-Strep và Bac-Strep), ngoại trừ nhóm Mix. Không có sự thay đổi đáng kể về số lượng heterotroph trong nước đối với các chủng Streptomyces đơn lẻ và đối chứng probiotic (Lac và Bac) so với đối chứng không bổ sung. Tất cả các tổ hợp probiotic khác cho thấy số lượng heterotroph thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05) (Bảng 2). Chỉ các nhóm N7, Strep và Mix cho thấy số lượng heterotroph trong gan tụy tôm giảm không đáng kể, trong khi tất cả các nhóm khác có số lượng heterotroph thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05) (Bảng 2). Mặc dù tất cả các nhóm được bor sung probiotic trong 30 ngày đều biểu hiện số lượng tế bào máu cao hơn nhóm đối chứng, những giá trị này chỉ cao hơn đáng kể đối với các nhóm Strep, Bac và Bac-Strep (Bảng 2).

Bảng 2. Tổng số heterotroph, Vibrio và số lượng tế bào máu sau khi cho tôm ăn các chủng probiotic khác nhau

Các giá trị phạm vi trung bình trong cùng một cột với các chữ cái viết thường khác nhau là khác nhau đáng kể (P < 0,05) theo thử nghiệm Kruskal-Wallis/Mann-Whitney

3.3. Hoạt tính superoxide dismutase của tôm được nuôi bằng probiotic

Trong số các probiotic Streptomyces đơn lẻ, Streptomyces sp. RL8 cho thấy hoạt tính SOD cao hơn nhưng không đáng kể, trong khi Streptomyces sp. N7 hiển thị hoạt tính SOD thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (Hình 1). Sự kết hợp của Streptomyces sp. RL8 và N7 (Strep) không dẫn đến tăng hoặc giảm hoạt tính SOD đối với nhóm đối chứng. Tất cả các probiotic khác cho thấy hoạt tính SOD cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng sau khi cảm nhiễm tôm với V. parahaemolyticus CAIM 170.

3.4. Tỷ lệ sống sau cảm nhiễm với parahaemolyticus

Tất cả các nhóm thử nghiệm đều được cảm nhiễm với V. parahaemolyticus CAIM 170 sau khi cho động vật ăn các chủng probiotic khác nhau trong 30 ngày. Sau khi ghi nhận tỷ lệ sống trong 96 giờ, tất cả các nhóm được bổ sung probiotic, ngoại trừ nhóm N7 và Strep, đều cho thấy tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (P < 0,05, Hình 2). Streptomyces sp. RL8 và Bac-Strep, có tỷ lệ sống cao nhất với tỷ lệ sống 95%. Chỉ có nhóm được nuôi bằng Streptomyces sp. N7 và Strep, với tỷ lệ sống lần lượt là 50 và 45%, cho thấy tỷ lệ sống không đáng kể gần bằng với nhóm đối chứng (30%).

4. Thảo luận

Probiotic đã được chứng minh là mô hình bền vững để thay thế việc sử dụng các hóa chất và kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản (Bidhan và cộng sự 2014). Vì vậy, các chủng ứng cử viên mới liên tục được khám phá để tìm ra các chế phẩm sinh học mới có đặc tính được cải thiện. Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng sử dụng chủng Streptomyces RL8 đơn lẻ hoặc kết hợp với một số chế phẩm sinh học khác có khả năng cải thiện các thông số tăng trưởng, miễn dịch, vi sinh và tỷ lệ sống của L. vannamei. Nhìn chung, các thông số tăng trưởng được cải thiện khi tôm được cho ăn chỉ bằng các chủng Streptomyces, tự kết hợp (Strep) hoặc kết hợp với Bacillus (Bac-Strep), mặc dù chỉ nhóm sau mới đạt được hiệu suất tăng trưởng tốt hơn đáng kể. Chúng tôi đã nhận thấy thông qua việc áp dụng chủng Streptomyces N7 và RL8 phù hợp với các nghiên cứu trước đây, cho thấy sự tăng trưởng đáng kể của tôm sú Penaeus monodon bằng cách bổ sung vào thức ăn 1% khối lượng tế bào Streptomyces trong 15 ngày bổ sung (Das và cộng sự 2010) và cá cảnh Xiphophorushelleri thông qua cách thay thế gần 30 – 40% bột cá được kết hợp trong thức ăn bằng các chủng Streptomyces khác nhau sau 50 ngày cho ăn thử nghiệm (Das và cộng sự 2010; Dharmaraj và Dhevendaran 2010). Các nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng việc bổ sung men vi sinh, chẳng hạn như Bacillus spp. vào thức ăn hoặc nước giúp cải thiện hiệu suất tăng trưởng của L. vannamei (Liu và cộng sự2009; Silva và cộng sự 2012); được cho là do việc sản xuất các enzym ngoại bào như protease, carbohydrolase và lipase cũng như các yếu tố tăng trưởng tham gia vào quá trình tiêu hóa của tôm (Leonel Ochoa-Solano và Olmos-Soto 2006; Liu và cộng sự 2009). Actinomycetes cũng có khả năng tạo ra nhiều enzyme ngoại bào khác nhau để phân hủy các chất hữu cơ như tinh bột, cellulose, protein và lipid (Prakash và cộng sự2013). Như chúng tôi đã trình bày trước đây, chủng Streptomyces N7 và RL8 tạo ra một số enzyme này (García-Bernal và cộng sự 2015). Vì vậy, có khả năng là chúng đã đóng một vai trò trong việc cải thiện tăng trưởng mà chúng tôi đã tìm thấy trong nghiên cứu này.

Hình 1. Hoạt tính SOD trong mô của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được nuôi bằng các chủng probiotic khác nhau và bị cảm nhiễm Vibrio parahaemolyticus. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn. Các thanh có chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể (P < 0,05)

Hình 2. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được nuôi bằng các chế phẩm sinh học khác nhau sau khi cảm nhiễm với Vibrio parahaemolyticus. Các thanh có chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể (P < 0,05)

Trong các trang trại thủy sản, tổng số vi khuẩn dị dưỡng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy và khoáng hóa chất hữu cơ trong khi một số loài Vibrio có thể gây ra dịch bệnh và tỷ lệ chết cao (Thompson và cộng sự 2004). Do đó, bằng cách duy trì một cộng đồng vi khuẩn có lợi và đa dạng có thể điều chỉnh hệ vi sinh vật trong ruột cá cũng như trong nước nuôi, đồng thời giảm bớt các loài không mong muốn, là một thuộc tính quan trọng của probiotic để giảm sự xáo trộn của mầm bệnh và cải thiện chất lượng nước (Mohapatra và cộng sự 2013). Nhìn chung, sử dụng các chủng Streptomyces riêng lẻ hoặc kết hợp có thể làm giảm số lượng Vibrio trong gan tụy tôm bằng ca.4 log đơn vị. Mặc dù các chủng này cũng làm giảm số lượng heterotroph nhưng mức giảm này chỉ thấp hơn 0,1 – 1,6 log đơn vị so với nhóm đối chứng. Như vậy, khả năng này của Streptomyces sp. N7 và RL8, được đặc trưng bởi sự loại trừ rõ rệt Vibrio trong khi vẫn duy trì tải lượng heterotroph cao từ gan tụy tôm, là điều rất quan trọng để duy trì tình trạng sức khỏe tốt cho tôm và ngăn ngừa nhiễm trùng các loài Vibrio. Nhóm Bac-Strep có mô hình tương tự về mức giảm ca. 4 và 1,6log-đơn vị Vibrio và các vi khuẩn dị dưỡng trong nước nuôi. Do đó, sự kết hợp đầy triển vọng giữa Streptomyces và Bacillus để đồng thời duy trì tải lượng Vibrio ở mức thấp và mức độ heterotroph cao ở tôm và môi trường xung quanh chúng. Việc loại trừ có chọn lọc Vibrio trong khi vẫn duy trì tổng số lượng vi khuẩn dị dưỡng cũng đã được báo cáo ở Streptomyces rubrolavendulae M56 và Streptomyces fradiae có nguồn gốc từ biển (Aftabuddin và cộng sự 2013; Augustine và cộng sự 2015). Vì vậy, các chủng Streptomyces từ nguồn hải sản là ứng cử viên tốt để điều chỉnh hệ vi sinh vật vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.

Việc điều chỉnh hệ thống miễn dịch bằng cách kích hoạt một số tác nhân có tác động toàn thân và cục bộ lên phản ứng miễn dịch được cho là một trong những lợi ích phổ biến nhất của men vi sinh (Nayak 2010; Lazado và cộng sự 2015). Ở động vật không xương sống, tế bào máu đóng vai trò chính trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh, bao gồm giải phóng các peptide kháng khuẩn và lysozyme, hệ thống kích hoạt prophenoloxidase, thực bào, hình thành nốt sần và chữa lành vết thương (Bachère và cộng sự 2004; Jiravanichpaisal và cộng sự 2006). Khi tế bào máu lấn át vi sinh vật, một loạt chất kháng khuẩn được tạo ra để tiêu diệt mầm bệnh, bao gồm các loại oxy phản ứng (ROS) khác nhau. Bởi vì những ROS này cũng có thể gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho chính vật chủ nên chúng cần được loại bỏ nhanh chóng bằng các cơ chế chống oxy hóa, bao gồm cả SOD giúp loại bỏ anion superoxide (Holmblad và Söderhäll 1999; Bogdan và cộng sự 2000). Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng số lượng tế bào máu và công cụ đánh giá hoạt tính SOD của quá trình tăng sinh miễn dịch của Streptomyces sp. N7 và RL8 đơn lẻ hoặc kết hợp với các chủng khác. Mặc dù các chủng này được cho là tác nhân sinh học đơn lẻ không làm tăng đáng kể số lượng tế bào máu, nhưng khi chúng được kết hợp với nhau và kết hợp với Bacillus, chúng biểu hiện số lượng tế bào máu cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Tôm cảm nhiễm với V. parahaemolyticus đã kích thích hoạt tính SOD của hầu hết các nhóm được bổ sung probiotic, ngoại trừ nhóm Streptomyces N7 và Strep. Trong trường hợp này, Streptomyces RL8 và sự kết hợp của Streptomyces với các chủng LactoBacillus và Bacillus có khả năng kích thích hoạt tính SOD của tôm bị cảm nhiễm. Do đó, chúng có thể bảo vệ tôm khỏi ROS được tạo ra trong các đợt bùng phát dịch bệnh truyền nhiễm.

Một số chế phẩm sinh học đã được chứng minh là có tác dụng tăng cường phản ứng miễn dịch và do đó có khả năng chống nhiễm trùng ở tôm. Các nghiên cứu độc lập với các chủng LactoBacillus plantarum khác nhau đã cho thấy sự gia tăng tổng số lượng tế bào máu (THC), hoạt tính của phenoloxidase và SOD, cũng như sự phiên mã prophenoloxidase và peroxinect mRNA của L. vannamei (Chiu và cộng sự 2007; Kongnum và Hongpattarakere 2012). Bacillus cereus ở nồng độ 0,4% có hiệu quả trong việc kích thích THC, phenoloxidase, bùng nổ hô hấp và hoạt tính lysozyme ở P. monodon (NavinChandran và cộng sự 2014). Chủng Bacillus subtilis S12 đã tăng cường đáng kể mức độ tế bào máu, tỷ lệ thực bào, lysozyme, phenoloxidase và SOD ở L. vannamei (Liu và cộng sự 2014). Bacillus licheniformis đã cải thiện khả năng miễn dịch của L. vannamei bằng cách tăng hoạt tính HC và SOD và phenoloxidase (Li và cộng sự 2007). Ở đây, lần đầu tiên chúng tôi đã chứng minh rằng chủng Streptomyces có tác dụng điều hòa miễn dịch trên tôm, chủ yếu khi sử dụng kết hợp với các chủng khác. Theo nghĩa này, nhóm Bac-Strep cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch tốt nhất bằng cách tăng đáng kể cả hoạt tính THC và SOD, trong khi các nhóm Strep, Lac-Strep và Mix kích thích một trong những thông số này.

Hiệu quả bảo vệ tốt nhất của L. vannamei bị cảm nhiễm với V. parahaemolyticus đã đạt được nhờ các nhóm RL8 và Bac-Strep, sau đó là Lac-Strep và Mix, với tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Điều này phù hợp với những phát hiện trước đây của Das và cộng sự (2010) đã chỉ ra rằng chủng Streptomyces CLS-28 làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của P. monodon sau khi cảm nhiễm với Vibrio harveyi. Mặc dù các tác giả này cho rằng tác dụng bảo vệ này là do khả năng tốt của Streptomyces trong việc tạo ra các hợp chất kháng khuẩn, nhưng chúng tôi đã cho thấy rằng chúng cũng có tác động tích cực đến tình trạng miễn dịch của tôm.

Xem xét tất cả các thông số, sự kết hợp giữa Streptomyces với Bacillus trở thành ứng cử viên probiotic hứa hẹn nhất, tiếp theo là chủng probiotic đơn Streptomyces sp. RL8. Thật vậy, nhóm Bac-Strep cho thấy sự gia tăng đáng kể ở hầu hết các thông số tăng trưởng, tế bào máu, hoạt tính SOD và tỷ lệ sống của tôm cũng như giảm đáng kể Vibrio trong nước và gan tụy. Tương tự, Streptomyces sp. RL8 cải thiện một số thông số tăng trưởng, hoạt tính SOD, tỷ lệ sống của tôm và giảm Vibrio trong nước và gan tụy. Mặc dù N7 và Strep có tác động tích cực đến số lượng tế bào máu, các thông số tăng trưởng và giảm Vibrio trong gan tụy tôm, nhưng các ứng cử viên probiotic này đã làm tăng số lượng Vibrio trong nước nuôi và không thể tạo ra hoạt tính SOD hiệu quả. Kết quả là họ đã thất bại trong việc bảo vệ tôm khỏi bị cảm nhiễm với V. parahaemolyticus và do đó không phải là ứng cử viên chế phẩm sinh học tốt. Nhóm Lac-Strep và Mix cho thấy tác dụng điều chỉnh các thông số miễn dịch cũng như hệ vi sinh vật gan tụy và cho thấy khả năng bảo vệ tốt trước nhiễm bệnh, cũng không phải là những ứng cử viên probiotic xuất sắc vì chúng không có tác động tích cực đến các thông số tăng trưởng của tôm. Do đó, RL8 và Bac-Strep rõ ràng là những ứng cử viên probiotic tốt nhất trong số tất cả các chủng đơn và chủng kết hợp được nghiên cứu.

Tác dụng hiệp đồng của sự kết hợp Streptomyces và Bacillus được tìm thấy ở đây nhất quán với sự đánh giá cao rằng chế phẩm sinh học đa chủng hoặc nhiều loài có thể hiệu quả hơn chế phẩm sinh học đơn chủng (Timmerman và cộng sự 2004). Do đó, hoạt tính sinh học đáng chú ý của nhóm Bac-Strep là do vô số tác dụng có lợi liên quan đến hai chi này, bao gồm cả khả năng phi thường của Streptomyces trong việc sản xuất một số enzyme ngoại bào và kháng sinh (Berdy 2005; Chater và cộng sự 2010) và tác động một số tác dụng điều hòa miễn dịch, cùng với khả năng được biết đến của Bacillus trong việc cải thiện hiệu suất tăng trưởng, hoạt tính của enzyme tiêu hóa, phản ứng miễn dịch, vi khuẩn có lợi và khả năng kháng bệnh của tôm (Nimrat và cộng sự 2013; Zokaeifar và cộng sự 2014).

Trong số một số giống vi khuẩn đã được nghiên cứu rộng rãi làm tác nhân sinh học trong nuôi trồng thủy sản, các thành viên của lớp Actinobacteria hiếm khi được xem xét (Ninaweand Selvin, 2009; Akhter và cộng sự 2015). Do đó, nghiên cứu này đưa ra bằng chứng thuyết phục về giá trị của chúng với tư cách là tác nhân bảo vệ đơn chủng hoặc đa chủng trong nuôi tôm và là điểm khởi đầu để phát triển các tác nhân sinh học mới và hiệu quả hơn dựa trên các vi sinh vật này.

Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng một số chủng Streptomyces đơn lẻ hoặc kết hợp với các chi khác, chủ yếu là Bacillus, có tác dụng sinh học trên tôm bằng cách cải thiện các thông số tăng trưởng, điều chỉnh phản ứng miễn dịch, điều chỉnh hệ vi sinh vật của vật chủ và nước, và tăng khả năng kháng bệnh. Trong số hai chủng Streptomyces cũng như sự kết hợp của chúng với Bacillus và LactoBacillus, chủng đơn Streptomyces sp. RL8 và Bac-Strep đa chủng là những ứng cử viên probiotic hứa hẹn nhất sẽ được sử dụng trong nuôi tôm. Sự kết hợp giữa Streptomyces với Bacillus này đáng được chú ý hơn nữa vì chúng là vi khuẩn hình thành bào tử tạo ra vô số enzyme ngoại bào và kháng sinh, có thể được phát triển thành tác nhân kiểm soát mới với các tính năng sinh học được cải thiện và thời hạn sử dụng kéo dài.

Theo Milagro García Bernal, Ricardo Medina Marrero, Ángel Isidro Campa-Córdova, José Manuel Mazón-Suástegui

Nguồn: https://www.academia.edu/32100323/Probiotic_effect_of_ Streptomyces_strains_alone_or_in_combination_with_Bacillus_and_LactoBacillus_in_juveniles_of_the_white_shrimp_Litopenaeus_vannamei

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức