Phần 2: Silkrose Của Bombyx mori Ngăn Ngừa Hiệu Quả Bệnh Vibrio Ở Tôm He Thông Qua Việc Kích Hoạt Khả Năng Miễn Dịch Bẩm Sinh

Hình 2. Sắc ký đồ của polysacarit tinh khiết của B. mori nhộng trên sắc ký lọc gel dành riêng cho kích thước.

Bảng 1. Trọng lượng phân tử và giá trị EC50 của các polysacarit tinh khiết.

Trọng lượng phân tử của polysacarit được phân lập từ A. yamamai dựa trên Ohta và cộng sự.

Hình 3. Tổng sắc ký ion của polysacarit tinh khiết của nhộng B. mori. 1, l-rhamnose; 2, l-fucozơ; 3, l-arabinose; 4, axit d-glucuronic; 5, d-mannose; 6, d-glucozơ; 7, d-galactose; 8, N-axetyl-d-glucosamin; 9, N-axetyl-d-galactosamin. Myo, Myo-inositol, một tiêu chuẩn nội bộ.

Bảng 2. Tỷ lệ mol của monosacarit trong polysacarit tinh khiết.

Dựa trên Ohta và cộng sự.

Phản ứng liều lượng của silkrose-BM theo cách tương tự như silkrose của A. yamamai (silkrose-AY) và lipopolysacarit (LPS) của Escherichia coli O26 trong thử nghiệm sản xuất NO sử dụng tế bào RAW264 (Hình 4). Đáng chú ý, giá trị sản xuất NO tối đa với Silkrose-BM và AY là tương tự và cao hơn so với LPS. EC 50 của silkrose-BM, AY và LPS lần lượt là 2,5 μg/mL, 0,0043 μg/mL và 0,011 μg/mL (Bảng 1).

Hình 4. Hoạt động sản xuất NO trong các tế bào RAW264 được kích thích bởi các polysacarit được tinh chế từ nhộng B. mori (hình tròn) và A. yamamai (hình tam giác). LPS của E. coli O26 được sử dụng làm đối chứng dương tính (chéo).

3.2. Hiệu lực của Silkrose-BM đối với bệnh Vibrio trên tôm he

Để khẳng định hiệu quả của silkrose-BM đối với bệnh do vi khuẩn ở tôm He, tôm thẻ chân trắng L. vannamei được cho ăn thức ăn có silkrose-BM (0, 0,0125, 0,25, 5 μg/g) trong 1 tháng, sau đó cho nhiễm một chủng vi khuẩn độc lực Vibrio penaecida (chủng IAYKG13-1) bằng phương pháp ngâm. Silkrose-BM trong khẩu phần ăn không gây ra sự tăng hoặc giảm tốc độ tăng trưởng của tôm phụ thuộc vào liều lượng (Bảng  S1). Sau khi cảm nhiễm, tỷ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể ở các nhóm sử dụng Silkrose-BM so với nhóm đối chứng (Hình 5). Vào ngày sau cảm nhiễm thứ 14, tỷ lệ sống không bao gồm chết ngẫu nhiên là 0% (0/15 con tôm) trong nhóm đối chứng và 90,1% (20/22 con tôm), 89,5% (17/19 con tôm) và 100% (13 con /13 tôm) trong các nhóm 0,0125, 0,25 và 5 μg/g silkrose-BM. 2 con tôm trong nhóm 5 μg/g Silkrose-BM vô tình chết do nhảy ra khỏi bể.

Hình 5. Đường cong tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng L. vannamei sau khi ngâm với chủng Vibrio penaedia IAYKG13-1 (liều lượng đầu vào: 3,8 × 10⁵ tế bào/L). Nhóm đối chứng (hình tròn đầy), nhóm ăn 0,0125 μg/g silkrose-BM (hình vuông mở), nhóm ăn 0,250 μg/g silkrose-BM (tam giác mở) và nhóm ăn 5 μg/g silkrose-BM (vòng tròn mở). Chữ thập biểu thị các trường hợp chết ngẫu  nhiên. Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng bằng kiểm tra thứ hạng log với hiệu chỉnh Bonferroni (p  <0,05). * p  < 0,01, ** p  < 0,001, *** p  < 0,0001.

Đối với việc sử dụng lĩnh vực tiềm năng trong tương lai, chúng tôi đã xác nhận thêm về hiệu quả của nhộng B. mori có chứa silkrose-BM. M. japonicus được nuôi bằng khẩu phần ăn thử nghiệm trong 2 tuần và sau đó cảm nhiễm với Vibrio penaecida bằng cách ngâm. Nhộng B. mori không làm giảm tốc độ tăng trưởng của tôm phụ thuộc vào liều lượng trong thời gian cho ăn 2 tuần, mà thay vào đó cho thấy xu hướng tăng trưởng (Bảng  S2). Sau khi nhiễm bệnh, tỷ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể ở các nhóm ăn khẩu phần ăn nhộng B. mori so với nhóm ăn khẩu phần ăn đối chứng (Hình 6). Tỷ lệ sống vào ngày 21 sau cảm nhiễm là 0% (tôm 0/27) trong nhóm khẩu phần ăn đối chứng và 73,1% (tôm 19/26), 76,9% (tôm 20/26) và 76,0% (tôm 19/25)) trong các nhóm ăn  nhộng B. mori lần lượt là 0,01%, 0,01% và 0,1% .

Hình 6. Đường cong sống sót của M. japonicus sau khi ngâm với chủng Vibrio penaedia IAYKG13-1 (liều lượng đầu vào: 3,6 × 10⁸ tế bào/L). Nhóm khẩu phần ăn đối chứng (hình tròn đầy), nhóm khẩu phần ăn 0,001% nhộng B. mori (hình vuông mở), nhóm khẩu phần ăn 0,01% nhộng B. mori (hình tam giác mở), nhóm khẩu phần ăn 0,1% nhộng B.  mori (hình tròn mở). Dấu hoa thị cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng bằng kiểm tra thứ hạng log với hiệu chỉnh Bonferroni (p  <0,05). * p  < 0,01, ** p  < 0,001, *** p  < 0,0001.

4. Thảo luận

Khái niệm miễn dịch bẩm sinh được xác định là sự kích hoạt được bắt đầu bằng việc nhận biết các chất lạ, được gọi là các mẫu phân tử liên quan đến mầm bệnh (PAMPs), bởi các thụ thể nhận dạng mầm bệnh (PRR). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xác định được một loại polysacarit có hoạt tính sinh học từ nhộng B. mori có thể kích hoạt khả năng miễn dịch bẩm sinh trong các tế bào RAW264 ở chuột. Hơn nữa, việc bổ sung Silkrose-BM vào khẩu phần ăn giúp cải thiện tỷ lệ sống của tôm He sau khi chúng bị nhiễm vi khuẩn Vibrio độc hại. Do đó, phát hiện này cho thấy rằng silkrose-BM đóng vai trò là PAMP cho cả động vật có vú và động vật giáp xác. Nói chung, các polysacarit chứa PAMP ảnh hưởng đến nhiều loại tế bào và loài động vật bao gồm cả động vật có xương sống và động vật không xương sống, như đã báo cáo đối với LPS và β-glucans.

Điều đáng chú ý trong các phân tích này là nhộng B. mori thô có hiệu quả chống lại bệnh vibriosis ở M. japonicus, một loài tôm sú đại diện trong nuôi trồng thủy sản thương mại. Tuy nhiên, chúng tôi không thể loại trừ khả năng các chất khác có trong nhộng B. mori như peptide chống vi khuẩn và chitin đóng vai trò bảo vệ chống vi khuẩn này cùng với Silkrose-BM hoặc các phân tử ức chế không bị biến đổi có thể can thiệp vào hoạt động của Silkrose-BM. Tuy nhiên, những phát hiện này cũng chỉ ra rằng nhộng B. mori có thể được sử dụng mà không cần thanh lọc thêm. Ngoài tính sẵn có của chúng như một sản phẩm phụ của quá trình sản xuất tơ tằm, việc dễ dàng xử lý những con nhộng này sẽ rất thuận lợi cho ứng dụng thực tế của chúng trong nuôi trồng thủy sản.

Chúng tôi đã sử dụng xét nghiệm sản xuất NO sử dụng tế bào RAW264 trong nghiên cứu này để theo dõi kích hoạt miễn dịch bẩm sinh vì những lý do được nêu dưới đây. Trình tự thúc đẩy tổng hợp oxit cảm ứng mã hóa gen ở chuột (iNOS) chứa các vị trí liên kết NF-κB và cảm ứng phiên mã của gen iNOs phụ thuộc hoàn toàn vào việc kích hoạt đường truyền tín hiệu NF-κB. Hơn nữa, chúng tôi đã xác nhận trong các nghiên cứu trước đây rằng các hoạt động sản xuất NO được thúc đẩy bởi dipterose và silkrose có liên quan chặt chẽ với các phản ứng miễn dịch bẩm sinh trong các tế bào RAW264.

Các polysacarit hoạt tính sinh học mà chúng tôi đã xác định được từ côn trùng được đặc trưng bởi các monosacarit cấu thành. Tám trong số chín monosacarit phổ biến giữa silkrose-BM và AY và dipterose của B. cucurbitae (dipterose-BC). Các monosacarit khác nhau giữa các loài này là l-arabinose, axit d-mannuronic và d-ribose nhưng tỷ lệ mol của các phân tử này nhỏ. Do đó, tất cả, hoặc ít nhất là một phần quan trọng, trong số tám monosacarit được chia sẻ sẽ có khả năng tham gia vào việc hình thành các vị trí nhận biết cho PRR. Sự khác biệt rõ ràng trong các polysacarit của Silkrose-BM và AY và diptrose-BC được tìm thấy trong tỷ lệ mol của các monosacarit và trọng lượng phân tử có khả năng giải thích sự khác biệt về hiệu lực, sự liên kết monosacarit và cấu trúc ba chiều của các polysacarit.

Chúng tôi đã không chỉ ra cơ chế nhận dạng tế bào và phân tử của Silkrose-BM trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, phản ứng liều lượng của silkrose-BM trong thử nghiệm sản xuất NO thường có tính chủ vận giống như phản ứng của LPS của E. coli O26 và silkrose-AY, và phù hợp với các quan sát trước đây. Hơn nữa, các monosacarit cấu thành của silkrose-BM gần giống với các monosacarit của silkrose-AY và dipterose-BC, gợi ý các cơ chế nhận dạng tế bào tương tự giữa các polysacarit hoạt tính sinh học này.

Một cơ chế được báo cáo làm cơ sở cho các chức năng của polysacarit hoạt tính sinh học của côn trùng trong các tế bào RAW264 là con đường TLR4/NF-κB. Trong số các phân tử hoạt tính sinh học đặc trưng có chứa polysacarit, LPS của vi khuẩn cũng được biết là kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh trong tế bào động vật có vú thông qua TLR4. Do đó, bằng chứng tích lũy về các hoạt động và chức năng của LPS, chứ không phải là β-glucan bao gồm các polyme glucose tạo thành cấu trúc xoắn ba vòng và được nhận biết thông qua các thụ thể bề mặt tế bào như CR3, lactosylceramide, thụ thể xác thối và dectin-1 ở động vật có xương sống, cung cấp một số manh mối về cơ chế nhận dạng tế bào của tơ tằm và dipterose trong tế bào động vật có vú. Trong quá trình kích hoạt TLR4 bằng LPS, phức hợp nhiều thụ thể đồng nhất và dị loại, kết hợp CD14, MD2 và TLR4 làm phân tử lõi, tạo thành cụm kích hoạt. Chúng tôi suy đoán rằng những  thành phần tham gia phức hợp thụ thể để nhận biết các polysacarit của côn trùng không hoàn toàn trùng lặp với các chất đối với LPS của vi khuẩn do thiếu lipid A trong các polysacarit của côn trùng và sự khác biệt trong các monosacarit cấu thành.

Ở động vật không xương sống bậc cao, các nghiên cứu di truyền ở Drosophila đã tiết lộ rằng ba con đường truyền tín hiệu riêng biệt thông qua Toll, Suy giảm miễn dịch (IMD) và Bộ chuyển đổi tín hiệu và Bộ kích hoạt phiên mã (JAK/STAT) là rất quan trọng đối với phản ứng miễn dịch đối với nhiễm vi khuẩn. Sự phân hủy RNAi của gen Toll L. vannamei (LvToll) làm tăng tỷ lệ chết và giảm khả năng  thải vi khuẩn sau cảm nhiễm với Vibrio harveyi. Hơn nữa, sự biểu hiện của gen LvToll và tôm Trung Quốc, gen Toll Fenneropenaeus chinensis (FcToll) được biến đổi sau nhiễm Vibrio harveyi và Vibrio anguillarum. Những phát hiện này cho thấy khả năng con đường Toll tham gia vào quá trình kích hoạt miễn dịch bẩm sinh và bảo vệ khỏi bệnh vibriosis bởi các polysacarit hoạt tính sinh học của côn trùng. Tuy nhiên, tôm có một loại Toll giống như của côn trùng. Nó không trực tiếp đóng vai trò là cơ quan tiếp nhận các chất lạ. Các phân tử dịch thể, bề mặt tế bào và nội bào khác đã được xác định là PRR ở động vật không xương sống bậc cao. Cho đến nay, 10 họ PRR riêng biệt đã được biết đến ở tôm. Việc làm sáng tỏ PRR và các phản ứng tiếp theo của chúng sẽ rất quan trọng đối với sự hiểu biết đầy đủ hơn của chúng ta về con đường miễn dịch bẩm sinh ở tôm được kích hoạt bởi các polysacarit hoạt tính sinh học của côn trùng.

Việc bảo vệ khỏi bệnh truyền nhiễm trong quá trình nuôi tôm chủ yếu đạt được nhờ tạo ra nguồn giống sạch mầm bệnh đặc hiệu (SPF), cải tiến hệ thống nuôi và kiểm soát chung các bệnh truyền nhiễm. Tuy nhiên, Vibrio spp. hình thành hệ thực vật bình thường trong ao nuôi tôm. Hơn nữa, vi khuẩn có thể thu được các gen độc hại thông qua chuyển gen ngang gây ra bởi sự hấp thu DNA trần, lây nhiễm vi khuẩn và sự tiếp hợp của vi khuẩn giữa các loài đồng nhất và không đồng nhất. Do đó rất khó để loại bỏ hoàn toàn vi khuẩn gây bệnh ra khỏi trại nuôi cá. Các chất kháng sinh có hiệu quả chống lại bệnh do vi khuẩn, nhưng việc sử dụng chúng bị hạn chế để giảm thiểu tác động đến môi trường tự nhiên và ngăn chặn việc tạo ra các chủng kháng kháng sinh. Ngược lại, các hoạt chất sinh học hoạt động thông qua khả năng miễn dịch bẩm sinh không có những lo ngại như vậy. Tóm lại, các hoạt chất sinh học như silkrose sẽ trở thành công cụ quan trọng hơn để bảo vệ bệnh do vi khuẩn trong nuôi tôm trong tương lai.

Theo Muhammad Fariz Zahir Ali, Indri Afrani Yasin, Takashi Ohta, Atsushi Hashizume, Ido Atsushi, Takayuki Takahashi, Chiemi Miura & Takeshi Miura

Nguồn: https://www.nature.com/articles/s41598-018-27241-3

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

• Bốn Cách Để Tối Ưu Hóa Tính Ổn Định Của Hệ Thống Biofloc
• Chatbots AI Và Nuôi Trồng Thủy Sản Chuyên Nghiệp
• Ảnh Hưởng Của Probiotics Đến Sự Phân Hủy Amoniac Trong Nghiên Cứu In Vitro Và Trong Ao Nuôi Tôm Thẻ Chân Trắng