Phần 1: Tác Dụng Của Đậu Răng Ngựa (Vicia faba L.) Lên Kết Cấu Cơ Và Các Chỉ Điểm Sinh Học Xơ Hóa Của Cá Rô Phi (Oreochromis niloticus)

Tóm tắt

Cá rô phi (Oreochromis niloticus) là một loài cá có giá trị với độ cứng và độ dai của cơ cao, đặc biệt khi được nuôi với khẩu phần có bổ sung đậu răng ngựa (Vicia faba L.). Phản ứng căng thẳng của các loài oxy phản ứng (ROS) có thể là một trong những yếu tố sinh lý dẫn đến sự thay đổi độ giòn trong kết cấu cơ. Tuy nhiên, các cơ chế phân tử điều hoà kết cấu cơ của cá, đặc biệt là những cơ chế chịu ảnh hưởng từ đậu răng ngựa trong khẩu phần ăn vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, cá rô phi được cho ăn khẩu phần có hoặc không có đậu răng ngựa trong vòng 80 ngày. Sau đó, các mẫu cá được phân tích kết cấu cơ, cấu trúc vi mô, hàm lượng collagen và phiên mã gen để xác định cơ chế hình thành độ giòn của cơ. Kết quả cho thấy ở nhóm cá được cho ăn đậu răng ngựa, các chỉ số kết cấu cơ như độ cứng, độ đàn hồi, độ dẻo và độ dai đều tăng, đường kính sợi cơ giảm khi mật độ sợi tăng; đồng thời, lượng collagen tổng số trong ma trận ngoại bào cũng tăng đáng kể.  Biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình xơ hóa (col1α1, versican, comp và fibrosin) tăng mạnh, trong khi biểu hiện của gen decorin, vốn có tác dụng ức chế xơ hóa lại giảm ở nhóm cá được cho ăn đậu răng ngựa. Nhìn chung, nghiên cứu này cho thấy việc cho cá rô phi ăn đậu răng ngựa có thể thay đổi chất lượng kết cấu cơ bằng cách thay đổi cấu trúc các sợi cơ và hàm lượng collagen. Đồng thời, nhóm nghiên cứu đã xác định được các gen gây ra những thay đổi trong quá trình xơ hóa cơ liên quan đến chất lượng kết cấu được cải thiện độ giòn ở cá rô phi, cung cấp cơ sở khoa học cho việc điều chỉnh độ giòn của cá rô phi.\

1. Giới thiệu

Cá rô phi (Oreochromis niloticus) được Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên hợp quốc (FAO) khuyến nghị là loài thủy sản quan trọng do tăng trưởng nhanh, nhờ tốc độ tăng trưởng nhanh, khả năng sinh sản và nuôi trồng dễ dàng, cùng hàm lượng protein cao (FAO, 1976). Loài cá này đã được nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ, với sản lượng đạt 6,9 × 10¹⁰ kg trong những năm gần đây (FAO, 2020). Các nghiên cứu cho thấy, cho một số loài cá ăn đậu răng ngựa trong 60–120 ngày có thể tăng mật độ sợi cơ và hàm lượng collagen, đồng thời giảm đường kính sợi cơ và hàm lượng lipid thô. Nhờ đó, độ cứng và độ dai của cơ tăng lên rõ rệt, tạo nên kết cấu giòn đặc trưng (He et al., 2023; Song et al., 2020; Wang et al., 2023b; Xu et al., 2020). Tại Trung Quốc và nhiều quốc gia khác, cá có độ giòn được ưa chuộng vì chất lượng thịt đặc biệt, do đó, việc cho cá rô phi ăn đậu răng ngựa được xem là một giải pháp hiệu quả giúp nâng cao chất lượng thịt và giá trị kinh tế của loài cá này.

Nhiều nghiên cứu đã đánh giá những thay đổi về hiệu suất tăng trưởng, hàm lượng dinh dưỡng, phản ứng sinh lý và sinh hóa, hoạt động của enzyme tiêu hóa và chất lượng cơ của cá rô phi (Li và cộng sự, 2023) và cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idellus) (Yu và cộng sự, 2017a) sau khi cho ăn khẩu phần ăn có độ giòn. Phản ứng với các loài oxy phản ứng (ROS) có thể là một trong những nguyên nhân sinh lý làm nên kết cấu giòn. ROS, bao gồm các anion superoxide (O²⁻), hydrogen peroxide (H₂O₂) và các gốc hydroxyl (OH⁻), có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự biệt hóa sợi cơ (mật độ và đường kính sợi cơ) và tích luỹ collagen. Phân tích proteomic của cá trắm cỏ cho thấy sự tích tụ ROS làm giảm độ nhạy cảm của Ca²⁺ trong các tơ cơ. Sự can thiệp này tiếp tục phá vỡ sự tương tác giữa actin và myosin, dẫn đến giảm đường kính sợi cơ và tăng độ cứng của cơ (Yu và cộng sự, 2020). ROS cũng có thể làm gián đoạn quá trình tái tạo collagen, làm tăng hàm lượng collagen trong cơ và tăng cường độ cứng của cơ (Yu và cộng sự, 2020). Các nghiên cứu trên cá trắm cỏ đã chỉ ra rằng ROS được chuyển từ ruột và gan đến cơ thông qua quá trình lưu thông máu, với ROS tích tụ trong cơ theo thời gian ăn thức ăn giòn (Chen và cộng sự, 2021).

Tuy nhiên, cơ chế phân tử của việc làm giòn cơ cá do ăn đậu răng ngựa vẫn còn rất phức tạp. Một số nghiên cứu đã làm sáng tỏ cơ chế phân tử điều chỉnh những thay đổi trong quá trình phân hóa sợi cơ trong quá trình làm giòn. Trong quá trình ăn thức ăn có độ giòn, sự điều hòa tăng các gen liên quan đến con đường Hippo đã làm tăng số lượng sợi cơ ở cá trắm cỏ (Xu và cộng sự, 2020). Sự gia tăng số lượng sợi cơ này dẫn đến tăng sản cơ, do đó làm thay đổi kết cấu của cơ cá (Wei và cộng sự, 2022). Việc giảm mức độ biểu hiện của chuỗi nặng myosin và chuỗi nhẹ myosin đã góp phần làm giảm đường kính sợi cơ, ngoài ra, sự điều hòa tăng catenin và talin gây ra tăng sản sợi cơ, sau đó làm tăng mật độ sợi cơ (Yu và cộng sự, 2017b).

Tích luỹ collagen là một đặc điểm kiểu hình quan trọng khác xảy ra trong quá trình làm giòn cơ (Wang và cộng sự, 2023b). Collagen đóng vai trò then chốt đến độ cứng của cơ thông qua hàm lượng và độ ổn định của nó (Csapo và cộng sự, 2020). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự gia tăng độ cứng của cơ có mối tương quan tích cực với mức độ biểu hiện của collagen loại I (Peng và cộng sự, 2022). Bên cạnh đó, sự biểu hiện quá mức Smad4 làm tăng mức mRNA và protein của collagen loại I (Yu và cộng sự, 2019). Tình trạng xơ hóa có thể xảy ra ở nhiều cơ quan và được đặc trưng bởi sự tích tụ quá mức các thành phần của ma trận ngoại bào (ECM), bao gồm collagen và fibronectin (Antar và cộng sự, 2023). Do đó, việc hiểu được liệu quá trình xơ hóa cơ có xảy ra trong quá trình làm giòn hay không và xác định các gen liên quan cần được nghiên cứu thêm.

Việc cho ăn đậu răng ngựa có thể gây ra xơ hóa cơ và các con đường tái cấu trúc ECM, cuối cùng làm thay đổi chất lượng kết cấu cơ ở cá rô phi. Để xác nhận các gen ứng cử viên chính, đặc biệt là các gen liên quan đến xơ hóa và chuyển hóa ECM, cũng như chức năng điều hòa của chúng trong quá trình hình thành kết cấu cơ giòn, hiệu suất tăng trưởng, các thông số về kết cấu cơ, vi cấu trúc sợi cơ và hàm lượng collagen của cá rô phi sau 80 ngày cho ăn khẩu phần ăn chứa đậu răng ngựa. Hơn nữa, phân tích phiên mã và phản ứng chuỗi polymerase định lượng phiên mã ngược (RT-qPCR) đã được thực hiện để làm rõ các cơ chế phân tử liên quan. Ngoài ra, việc cho ăn các lượng đậu răng ngựa khác nhau trong khẩu phần ăn cho thấy các hiệu ứng khác nhau. Cá được cho ăn 100% đậu răng ngựa trong nghiên cứu này, do đó, các quan sát có thể khác với các nghiên cứu trước đây trong đó cá được cho ăn đậu răng ngựa với một tỷ lệ nhất định.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tuyên bố đạo đức

Nghiên cứu này đã được Ủy ban đạo đức thí nghiệm trên động vật của Đại học Hải dương Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) chấp thuận (SHOU-DW-2016-004).

2.2. Cá và điều kiện thí nghiệm

Cá rô phi được sử dụng trong thí nghiệm này có nguồn gốc từ Trại Cá Rô phi Maoming Weiye ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc. Nhóm đối chứng được cho ăn thức ăn công thức thương mại dành cho cá rô phi, bao gồm 30% bột đậu nành, 3% bột cá, 12% bột mì, 21,5% cám lúa mì, 30% bột hạt cải dầu, 1,5% Ca(H₂PO₄)₂ và 2% premix vitamin và khoáng chất. Đậu răng ngựa được mua từ Vân Nam, ngâm trong nước lạnh 24 giờ, nghiền nát và sau đó cho cá ăn trực tiếp. Tóm tắt các thành phần dinh dưỡng chính của thức ăn được trình bày trong Bảng 1.

Hai nhóm được sử dụng cho thí nghiệm cho ăn: nhóm đối chứng (CG) và nhóm ăn đậu răng ngựa (FBG), mỗi nhóm có ba lần lặp lại. Mỗi lần lặp lại đại diện cho một đơn vị thí nghiệm riêng biệt (ao bê tông) được phân ngẫu nhiên vào nhóm tương ứng và được duy trì trong điều kiện cho ăn giống hệt nhau trong suốt thí nghiệm, bao gồm mật độ thả, các thông số nước và khẩu phần ăn. Do đó, cả CG và FBG đều bao gồm ba bể độc lập. Tổng cộng, 300 con cá rô phi khỏe mạnh (trọng lượng cơ thể ban đầu: 665 ± 34 g) từ cùng một lô giống, có kích thước tương tự, đã được chọn và nuôi trong ao bê tông ngoài trời (3 × 4 × 1 m) với mật độ 50 con/ao. Trong suốt 80 ngày thí nghiệm cho ăn, nhiệt độ nước dao động từ 27 đến 31°C, mức oxy hòa tan duy trì trên 6 mg/L và độ pH được duy trì trong khoảng từ 6 đến 7,5. Cá được cho ăn hai lần mỗi ngày vào lúc 9:00 sáng và 6:00 chiều, với lượng thức ăn khoảng 3% trọng lượng cơ thể.

Sau 80 ngày cho ăn, cá được cho nhịn đói trong 24 giờ. Các cá thể được chọn ngẫu nhiên thông qua việc gắn thẻ nhận dạng riêng cho từng con, sau đó sử dụng bảng hoặc phần mềm tạo số ngẫu nhiên để xác định số lượng mẫu cần thiết. Những con cá được chọn được bắt nhẹ nhàng bằng lưới mắt mềm để giảm thiểu thiệt hại và xáo trộn cho những con cá còn lại. Trước khi lấy mẫu, cá được gây mê trong dung dịch MS-222 (400 mg/L) cho đến khi mất phản xạ nắp mang khi chạm vào, biểu hiện trạng thái bất tỉnh. Sau đó, những con cá này được cân và đo chiều dài. Các mẫu mô cơ lưng, nằm phía trên đường bên, được thu thập để kiểm tra kết cấu cơ (sử dụng các mẫu cơ tươi), quan sát mô học, xác định hàm lượng collagen và phân tích phiên mã.

Vào các ngày 0, 40 và 80 ngày cho ăn, 10 con cá từ mỗi nhóm được chọn ngẫu nhiên và thu thập mẫu mô cơ lưng. Các mẫu này được đông lạnh ngay trong nitơ lỏng và sau đó được chuyển sang tủ đông -80°C để phân tích RT-qPCR tiếp theo.

2.3. Đo lường hiệu suất tăng trưởng

Trọng lượng và chiều dài cơ thể của từng con cá được đo, cùng với tổng số lượng cá. Tỷ lệ tăng trọng và tỷ lệ sống được tính bằng các công thức sau:

Tỷ lệ sống = N_t /N₀  × 100%.

N _t biểu thị số lượng cá sống sót trong mỗi nhóm tại thời điểm lấy mẫu 80 ngày và N₀ biểu thị số lượng cá trong mỗi nhóm thử nghiệm khi bắt đầu thử nghiệm.

Tỷ lệ tăng trọng = (W_t -W₀)/W₀ .

W_t biểu thị trọng lượng cơ thể của cá trong mỗi nhóm tại thời điểm lấy mẫu 80 ngày và W₀ biểu thị trọng lượng cơ thể ban đầu của cá trong mỗi nhóm khi bắt đầu thí nghiệm.

2.4. Đo lường các thông số kết cấu

Mô cơ lưng tươi được thu thập và phân tích bằng máy phân tích kết cấu CT3 (Brookfield Inc., Middleboro, Hoa Kỳ) để đánh giá các chỉ số khác nhau của kết cấu cơ. Các thông số để phân tích kết cấu tổng thể (TPA) được thiết lập như sau: mức nén mục tiêu được đặt ở mức 4,0 mm, tốc độ đầu dò ở mức 0,5 mm/giây, đường kính của đầu dò tròn ở mức 6 mm, độ dày của mẫu cơ ở mức 5 mm, khoảng thời gian giữa hai lần nén là 2 giây và tỷ lệ nén ở mức 25%. Tại mỗi thời điểm lấy mẫu được chỉ định, 20 con cá được lấy mẫu từ mỗi nhóm thử nghiệm để thử nghiệm. Các chỉ số kết cấu bao gồm độ cứng, lực dính, độ bám dính, độ đàn hồi, độ kết dính, độ đàn hồi, độ đàn hồi, chỉ số đàn hồi, độ dẻo, độ dai và chỉ số dai được ghi lại và tính toán bằng phần mềm được cung cấp cùng với thiết bị phân tích kết cấu.

2.5. Quan sát cấu trúc vi mô của cơ

Một lượng mô cơ lưng thích hợp được ngâm trong dung dịch cố định Bouin (Phygene, Phúc Châu, Trung Quốc) để cố định. Sau 24 giờ, mô được lấy ra và chuyển vào dung dịch ethanol 70%, sau đó được bảo quản ở 4°C để cắt lát trong tương lai. Mô cơ cố định được đưa vào quá trình khử nước theo gradient sử dụng nồng độ ethanol từ 80% đến 100% (phần thể tích), sau đó được làm trong bằng xylen và nhúng trong parafin trong 3 giờ. Các lát cắt có độ dày khoảng 8μm được thực hiện bằng máy cắt vi phẫu Leica RM 2016 (Leica, Wetzlar, Đức). Sau khi nhuộm hematoxylin và eosin (HE), các lát cắt được hàn kín bằng keo trung tính. Sau khi sấy khô, chúng được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quang học Nikon ECLIPSE 80i (Nikon, Tokyo Metropolis, Nhật Bản). Năm trường quan sát được chọn ngẫu nhiên cho mỗi lát cắt và tổng cộng sáu mẫu được đo trong mỗi nhóm. Phần mềm phân tích hình ảnh ImageJ được sử dụng để phân tích 300 sợi cơ trên mỗi mẫu và đo đường kính sợi cơ (gương phản chiếu 20 lần) và mật độ sợi cơ (gương phản chiếu 20 lần).

Đường kính sợi cơ được tính bằng công thức S = πr^2 (S biểu thị diện tích và r là bán kính), với đường kính được xác định là 2r (tính bằng μm). Mật độ được đánh giá bằng cách đếm số sợi cơ (sợi/mm²) trong một diện tích xác định.

2.6. Phân tích phiên mã

2.6.1. Chiết xuất RNA và giải trình tự (RNA-seq)

Ba con cá từ mỗi nhóm FBG và CG được thu thập để giải trình tự phiên mã. Tổng RNA được chiết xuất bằng thuốc thử TRlzol (Life Technologies, Carlsbad, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ và độ tinh khiết của RNA được đo bằng máy NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Hoa Kỳ). Độ toàn vẹn của RNA được đánh giá bằng bộ xét nghiệm RNA Nano 6000 trên hệ thống Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, Hoa Kỳ).

Xây dựng thư viện được bắt đầu sau khi các mẫu được định lượng. Các bước chính như sau: (1) mRNA nhân chuẩn được làm giàu bằng cách sử dụng các hạt từ tính với Oligo(dT); (2) mRNA được phân mảnh ngẫu nhiên bằng cách thêm đệm phân mảnh; (3) sợi cDNA đầu tiên được tổng hợp bằng cách sử dụng mRNA làm khuôn mẫu, sau đó là tổng hợp cDNA sợi đôi và tinh chế tiếp theo; (4) cDNA sợi đôi đã tinh chế được sửa chữa đầu cuối, thêm đuôi A và nối các mối nối giải trình tự, sau đó là lựa chọn kích thước đoạn bằng hạt AMPure XP; (5) cuối cùng, thư viện cDNA thu được sau khi làm giàu bằng PCR. Sau khi hoàn tất việc xây dựng thư viện, một chất định lượng huỳnh quang Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Hoa Kỳ) đã được sử dụng để định lượng sơ bộ, đảm bảo rằng nồng độ yêu cầu vượt quá 1 ng/μL. Sau đó, các đoạn chèn của thư viện được phân tích bằng hệ thống phân tích thông lượng cao Qsep400. Sau khi vượt qua đánh giá chất lượng, quá trình giải trình tự được tiến hành ở chế độ PE150 bằng nền tảng giải trình tự Illumina NovaSeq6000.

2.6.2. Phân tích và xác thực dữ liệu

Các đoạn đọc sạch chất lượng cao đã được thu thập sau một loạt quy trình kiểm soát chất lượng. Phần mềm HISAT2 đã được sử dụng để căn chỉnh các đoạn đọc sạch với bộ gen tham chiếu (Oreochromis_niloticus .O_niloticus_UMD_NMBU.genome.fa). Các đoạn đọc được căn chỉnh thành công với bộ gen tham chiếu được gọi là dữ liệu đã lập bản đồ. Dựa trên dữ liệu đã lập bản đồ này, các mẫu riêng lẻ được phân tích mức độ biểu hiện gen bằng phần mềm RSEM; biểu hiện gen được ước tính bằng số trình tự được lập bản đồ trên mỗi kilobase của bản sao trên một triệu. Các phân tích biểu hiện khác biệt được thực hiện bằng phần mềm DESeq2.

Năm gen biểu hiện khác biệt (DEG) giữa CG và FBG được chọn ngẫu nhiên cho RT-qPCR để xác nhận kết quả của RNA-seq. Các đoạn mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen từ dữ liệu phiên mã và được tổng hợp bởi Công ty Sinh học Jinweizhi Thượng Hải (Công ty Sinh học Jinweizhi Thượng Hải, Thượng Hải, Trung Quốc). Trình tự của các cặp mồi được sử dụng được trình bày trong Bảng 2. β -actin được sử dụng làm gen tham chiếu nội bộ. Hệ thống RT-qPCR 20,0 μL bao gồm 2× SYBR Green Prc Taq HS Premix (10 μL), cDNA (1 μL), Primer F (0,4 μL), Premix R (0,4 μL) và nước không chứa RNase (8,2 μL). Chương trình phản ứng như sau: 95°C trong 30 giây; tiếp theo là 40 chu kỳ ở 95°C trong 8 giây và 56°C trong 30 giây. Biểu hiện tương đối của gen mục tiêu được tính toán bằng phương pháp 2^-ΔΔCt và ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng t-test (P  < 0,05).

2.7. Xác định hàm lượng tổng collagen

Hydroxyproline (HYP), một axit amin ổn định, chiếm khoảng 13,4% tổng thành phần axit amin của collagen. Do đó, HYP thường được sử dụng làm dấu ấn sinh học để đánh giá hàm lượng collagen. Hàm lượng collagen được định lượng bằng bộ dụng cụ (Mã số A030–2-1; Viện Kỹ thuật Sinh học Kiến Thành Nam Kinh, Nam Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.8. Phân tích biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình xơ cơ

Cá được chọn ngẫu nhiên từ CG và FBG vào các thời điểm 0 ngày, 40 ngày và 80 ngày. Năm gen biểu hiện khác biệt liên quan đến xơ hóa, bao gồm các gen xơ hóa col1α1, comp,  fibrosin và versican, cũng như gen chống xơ hóa decorin, đã được chọn để phân tích dựa trên kết quả của bản phiên mã. Các đoạn mồi được thiết kế bằng PrimerPremier 6.0 và được tổng hợp bởi Công ty Sinh học Jinweizhi Thượng Hải (Shanghai Jinweizhi Biological Company, Thượng Hải, Trung Quốc). Trình tự của các cặp mồi được trình bày trong Bảng 2. Hệ thống RT-qPCR được sử dụng đã được mô tả trước đó trong phần trước.

2.9. Phân tích thống kê

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm SPSS Statistics for Windows (phiên bản 26.0). Kiểm định T được sử dụng để so sánh hiệu suất tăng trưởng, kết cấu cơ, cấu trúc vi mô của sợi cơ, hàm lượng collagen và biểu hiện gen tương đối giữa CG và FBG tại cùng một điểm lấy mẫu, cũng như giữa các điểm lấy mẫu khác nhau trong cùng một nhóm cho ăn. Kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn, với giá trị P<0,05 cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê.

…Còn tiếp…

Theo Ning-xin Guo, Wen-bin Luo, Jin-hua Gao, Gazahegn-Wakjira Yadata, Xiao-li Yao, Zhi-chao Meng, Yan Zhao, Jin-liang Zhao

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2666566225000760

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Xem thêm:

• Đánh Giá Việc Bổ Sung Lecithin Đậu Nành Vào Cá Rô Phi Sông Nile Được Nuôi Ở Nhiệt Độ Không Tối Ưu
• Việc Bổ Sung Axit Fumaric Vào Khẩu Phần Ăn Ảnh Hưởng Như Thế Nào Đến Cá Rô Phi Con
• Hiệu Ứng Tích Lũy Và Điều Hòa Từ Hỗn Hợp Kim Loại Zn, Pb Và Cd Trong Tôm Nhiệt Đới Penaeus vannamei