TÓM TẮT

Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), là mầm bệnh vi bào tử trùng (microsporiadian) mới nổi gây ra bệnh nhiễm vi bào tử trùng gan tụy (HPM) ở tôm và có liên quan đến sự chậm phát triển nghiêm trọng. Bệnh gây ra thiệt hại về kinh tế trong nuôi tôm. Trong nghiên cứu này, sự nảy mầm của bào tử EHP được chứng minh có thể xảy ra nhờ vào kính hiển vi điện tử quét (SEM). Các ion (cation + và anion -) được tạo ra bởi các điện tử năng lượng cao trong quá trình phóng xạ nước đông lạnh (frozen water radiolysis) trong buồng mẫu SEM gây ra sự nảy mầm của bào tử EHP. Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên chứng minh có thể gây ra cảm ứng nảy mầm trên vi bào tử microsporidian bằng các ion được tạo ra trong SEM. Nghiên cứu này sẽ nâng cao hiểu biết của chúng ta về sinh học, vòng đời của EHP và sự phát triển thuốc dự phòng, cũng như các biện pháp để kiểm soát EHP. Ngoài ra, phương pháp này sẽ giúp tiêu chuẩn hóa việc nghiên cứu sự nảy mầm trên các vi bào tử trùng khác.

1/ Giới thiệu

Vi bào tử trùng là sinh vật đơn bào, nhân thực, có phạm vi vật chủ rộng và phân bố trên toàn cầu. Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) là một vi bào tử trùng gây ra bệnh vi bào tử trùng gan tụy (HPM), dẫn đến chậm phát triển và giảm sản lượng nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản (Patil và cộng sự, 2021).

Giai đoạn lây nhiễm của vi bào tử trùng là bào tử, được đặc trưng bởi cơ quan hỗ trợ xâm nhập – vòi phân cực – giúp xâm nhập vào tế bào chủ trong quá trình nảy mầm (Vavra và Lukes, 2013). Sự nảy mầm của bào tử là khả năng độc đáo của các vi bào tử trùng, trong đó vòi phân cực xâm nhập và tiêm các bào tử lây nhiễm vào tế bào chất của vật chủ (Weiss và cộng sự, 2014).

Bào tử lây nhiễm có cấu trúc giống như bình áp suất nhỏ gọn, có thể tồn tại bên ngoài tế bào chủ trong điều kiện “nghỉ” (không hoạt động) (Vavra và Larsson, 2014). Quá trình nảy mầm rất quan trọng đối với sự truyền mầm bệnh và cho biết khả năng tồn tại của bào tử. Sự nảy mầm của bào tử có thể được kích hoạt một cách tự nhiên bởi nhiều tác nhân kích thích từ môi trường, các tác nhân này rất khác nhau tùy theo loài và môi trường sống (Keeling và Fast, 2002).

Sự nảy mầm nhân tạo của vi bào tử đã được chứng minh có thể được gây ra bởi nhiều yếu tố kích ứng vật lý và hóa học (Cali và Takvorian, 2014; Keeling và Fast, 2002; Vavra và Larsson, 2014; Weiss và cộng sự, 2014). Theo hiểu biết tốt nhất của chúng tôi, nghiên cứu này lần đầu tiên báo cáo sự nảy mầm nhân tạo của bào tử EHP do các ion tạo ra dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM).

2/ Vật liệu và phương pháp

2.1 Thu thập mẫu

Năm mươi con tôm giống (16g) ở ngày nuôi thứ 65 được thu thập từ một trang trại thẻ Penaeus vannamei bị nhiễm EHP gần Ponneri, quận Thiruvallur, Tamil Nadu. Tôm được đưa về phòng thí nghiệm trong tình trạng còn sống và được nuôi trong bể xi măng 500L ở điều kiện tối ưu (độ mặn 25 ppt, pH 7,5, nhiệt độ 25◦C).

2.2 Kính hiển vi ánh sáng

Gan tụy của tôm được mổ vô trùng. Phết mẫu gan tụy và phân trên lam kính sạch. Sau đó, chúng được nhuộm bằng dung dịch CFW và Giemsa, theo quy trình tiêu chuẩn (Rajendran và cộng sự, 2016; Sathish Kumar và cộng sự, 2022) và được quan sát bằng kính hiển vi (EVOS FL Auto, Thermo Fisher Scientiﬁc, Hoa Kỳ). Một phần gan tụy được cố định trong ethanol để chẩn đoán phân tử.

2.3 Tách chiết DNA và khuếch đại PCR

Tổng bộ gen DNA được tách chiết từ gan tụy tôm bằng phương pháp ly giải CTAB (Sathish Kumar và cộng sự, 2022) và được lưu trữ ở -20◦C cho đến khi sử dụng tiếp. Độ tinh khiết và nồng độ của DNA chiết xuất được đánh giá bằng máy quang phổ nano giọt (Thermo Fisher Scientiﬁc, Hoa Kỳ). Quá trình khuếch đại PCR được thực hiện trong 25 µl thể tích phản ứng bao gồm dung dịch Master Mix RED (Ampliqon A /S, Đan Mạch), 10 µM mồi thuận (forward primers) và 10 µ M mồi ngược (reverse primers) (Jaroenlak và cộng sự, 2016) và 100 ng nền mẫu.

Phản ứng PCR được thực hiện trong máy luân nhiệt (Eppendorf, Mỹ). Các amplicon sau đó được phân giải bằng điện di trên gel agarose 1,8% và được tạo ảnh dưới hệ thống tài liệu gel (Phòng thí nghiệm Bio Rad, Hoa Kỳ).

2.4 Tinh sạch bào tử

Việc tinh sạch bào tử EHP được thực hiện theo Sathish Kumar và cộng sự (2022) với những sửa đổi nhỏ. Gan tụy đã mổ vô trùng (n = 45) được đồng nhất bằng cối và chày, và được lọc qua lưới. Dịch lọc được trộn với một thể tích bằng etyl axetat và được ly tâm ở tốc độ 8000 vòng / phút trong 10 phút ở 15◦C. Kết tủa lơ lửng trong ly tâm percoll (100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 50%) được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Cytiva, Hoa Kỳ) và được ly tâm ở 21.000 vòng / phút cho 30 phút. Lớp bào tử EHP được thu cẩn thận, rửa sạch bằng nước cất và ly tâm để thu được các bào tử tinh sạch. Các bào tử được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách sử dụng kính hiển vi ánh sáng và kính hiển vi điện tử quét; và được pha loãng thêm để thu được nồng độ cuối cùng là 10⁴ml^-1. Các bào tử đã tinh sạch được đếm bằng máy đo huyết cầu.

2.5 Nảy mầm nhân tạo / cảm ứng

Nảy mầm nhân tạo của bào tử EHP được thực hiện dưới kính hiển vi điện tử quét JSM IT 300 LV (Jeol, Nhật Bản). 10µl bào tử tinh sạch (10⁴ml^-1) được đặt trên một linh kiện bán dẫn hoạt động theo hiệu ứng peltier (Deben, Vương quốc Anh) và đông lạnh đến -15◦C. Linh kiện nêu trên với các bào tử đông lạnh ngay lập tức được chuyển vào buồng mẫu. Buồng mẫu được rút khí để đạt được độ chân không cao 10⁴ pa, và các bào tử được quan sát thấy ở điện áp gia tốc 15 kv.

Một mẫu không đông lạnh (10µl) của các bào tử tinh sạch (10⁴ ml ^-1) (được giữ trong linh kiện) được duy trì ở nhiệt độ phòng, và một mẫu khác (10µl) của các bào tử tinh sạch (10⁴ ml^-1) được đông lạnh ở 15◦C và đưa về nhiệt độ phòng. Cả hai mẫu đều được giữ riêng lẻ bên trong buồng mẫu và được quan sát trong SEM ở cùng điều kiện thực hiện như đối chứng.

3/ Kết quả

3.1 Soi kính hiển vi và khuếch đại PCR

Vết phết với Calcoﬂuor và phết tế bào nhuộm Giemsa của gan tụy và các sợi phân cho thấy sự hiện diện của các bào tử EHP trưởng thành, dày đặc trong kính hiển vi ánh sáng (Hình 1A). Chẩn đoán phân tử bằng cách sử dụng SWP-PCR chứng minh rằng các mẫu tôm là có bệnh, xác nhận sự hiện diện của nhiễm EHP.

Hình 1. A- Vết phết HP được nhuộm bằng CFW. B & C – Bào tử EHP đông lạnh – quan sát sự nảy mầm và sự “đẩy” chất của vòi phân cực, D- Bào tử EHP không đông lạnh trong SEM cho thấy không có sự “đẩy” của vòi phân cực. S- Bào tử, PT- Vòi phân cực.

3.2 Sự nảy mầm của bào tử

Bào tử EHP (10µl) được đông lạnh ở -15◦C trong linh kiện nhiệt điện và cho thấy sự thăng hoa chậm của nước đá sau khi hút chân không trong SEM. Mẫu đông lạnh hoàn toàn thăng hoa trong vòng 4 phút. Đồng thời, nước trong 10 µl bào tử EHP ở cả hai mẫu đối chứng ở trong linh kiện nhiệt điện ở nhiệt độ phòng ngay lập tức bị bốc hơi trước khi quan sát SEM. Sau khi bật súng phát xạ nhiệt điện tử, sự nảy mầm của bào tử EHP được quan sát thấy rõ ràng với sự “đẩy” vòi / sợi phân cực trong các mẫu đông lạnh (Hình 1 B, C). Trong khi đó, trong mẫu chưa đông lạnh và mẫu đông lạnh trước đó, các bào tử EHP được quan sát thấy không có dấu vết của nước và các bào tử được quan sát không có sự nảy mầm / “đẩy” vòi phân cực (Hình 1 D).

4/ Thảo luận

Vi bào tử là giai đoạn không hoạt động nhưng có khả năng lây nhiễm của vi bào tử trùng, có khả năng chống chọi và tồn tại trong môi trường ngoại bào khắc nghiệt trong thời gian dài (Vavra và Larsson, 2014). Bào tử EHP trưởng thành chứa một nhân đơn, 5–6 cuộn dây sợi cực, không bào phía sau, đĩa neo phía trước và thành dày, bao gồm nội bào tử (10 nm) và ngoại bào tử (2 nm) (Tourtip và cộng sự, 2009). Sự nảy mầm của bào tử là một sự kiện quan trọng mà qua đó vi bào tử chuyển mầm bào tử sang vật chủ thông qua 1 vòi phân cực. Sự nảy mầm bắt đầu bằng sự trương lên của nguyên bào phân cực, tiếp đến là sự phồng lên của không bào ở đầu sau. Sau đó, sự mở rộng của không bào phía sau tiếp tục tống xuất bào tử chất qua vòi phân cực (Weiss và cộng sự,2014). Chiều dài của vòi phân cực bị đẩy ra có thể là 50–500 µ m. Vòi phân cực có thể xuyên qua hầu hết các chướng ngại vật, bao gồm cả các bào tử vi bào tử trùng khác , và tiêm thể bào vào tế bào chất của tế bào chủ (Vavra và Lukes, 2013).

Sự nảy mầm của bào tử là một quá trình thẩm thấu được kích hoạt bởi nhiều tác nhân /yếu tố kích thích khác nhau; có thể khác nhau giữa các loài và môi trường sống. Sự nảy mầm của vi bào tử được gây ra bởi nhiều yếu tố vật lý và hóa học như thay đổi pH, mất nước, điều kiện tăng thẩm thấu, sự hiện diện của các ion, ánh sáng UV, peroxit và sự kết tụ (Keeling và Fast, 2002; Vavra và Larsson, 2014). Ngoài ra, áp lực cơ học, áp suất cao và thậm chí cả áp lực ngón tay cái lên llam kính lamen cũng được báo cáo là dẫn đến nảy mầm (Cali và Takvorian, 2014; V´ avra và Larsson, 2014; Weiss và cộng sự, 2014). Trong cơ thể vật chủ, các enzym tiêu hóa, các sản phẩm tiêu hóa và sự gia tăng các ion canxi trong quá trình chết của tế bào có thể tạo ra sự nảy mầm (Cali và Takvorian, 2014). Aldama-Cano và cộng sự. (2018) đã tái hiện và chứng minh sự nảy mầm của bào tử EHP bằng thuốc nhuộm Phloxin B và carboxymethylcellulose. Tuy nhiên, nghiên cứu không thể giải thích cơ chế gây ra sự nảy mầm của bào tử EHP.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh sự nảy mầm của bào tử EHP dưới kính hiển vi điện tử quét. Điều thú vị là sự nảy mầm chỉ được quan sát thấy trong các bào tử được đông lạnh ở 15°C, trong khi các bào tử ở nhiệt độ phòng không nảy mầm. Ở nhiệt độ phòng, nước bay hơi nhanh khi hút chân không. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn, nước đóng băng sẽ thăng hoa từ từ hoặc dừng hoàn toàn ở áp suất thấp hơn. Kết hợp với giai đoạn làm nguội peltier, nhiệt độ mẫu có thể được giảm xuống và được kiểm soát theo SEM. Ngoài ra, trong kính hiển vi điện tử, các điện tử năng lượng cao đã được báo cáo là gây ra sự phóng xạ nước và trải qua quá trình ion hóa, kích thích và tạo ra các ion (ion cat- và anion) như H₃0⁺, OH^–và các điện tử solvat hóa và H₂0₂(Galli và cộng sự, 2018; Lee và cộng sự, 2021). Do đó, nhiều cation và anion khác nhau đã được báo cáo có thể thúc đẩy sự phát triển ngoại bào tử microsporidian (Weiss và cộng sự, 2014). Hơn nữa, sự di chuyển tự do của các cation và anion vào trong bào tử sẽ kích hoạt bào tử (Weiss và cộng sự, 2014). Ngay cả hydrogen peroxide (H202) cũng được báo cáo là có thể gây ra sự nảy mầm của bào tử; tuy nhiên, H202 được quan sát là một phần nhỏ của quá trình phân giải phóng xạ (Galli và cộng sự, 2018). Sự khác biệt duy nhất giữa mẫu đối chứng và mẫu đông lạnh là sự thăng hoa của nước đông lạnh. Do đó, bức xạ chùm điện tử được báo cáo là gây ra sự thăng hoa cùng với sự phân giải phóng xạ (Galli và cộng sự, 2018). Do đó, các ion (cation và anion) được tạo ra trong quá trình tương tác của chùm điện tử năng lượng cao với nước đông lạnh thăng hoa chậm có thể tạo ra sự nảy mầm của bào tử trong các bào tử EHP đông lạnh trong chân không. Trong mẫu chưa đông lạnh, nước bay hơi nhanh chóng trước khi tương tác nước-electron có thể xảy ra, và do đó không quan sát thấy sự nảy mầm của bào tử. Điều này cũng loại trừ vai trò của đông lạnh trong sự nảy mầm của bào tử vì mẫu đông lạnh trước đó (đối chứng) không nảy mầm khi được kiểm tra dưới SEM. Trong phương pháp này, sự nảy mầm được tạo ra dưới SEM, việc đánh giá khả năng sống và sự nảy mầm sẽ dễ dàng hơn so với các phương pháp nảy mầm khác, trong đó sự nảy mầm chủ yếu được gây ra bên ngoài và sau đó được quan sát dưới kính hiển vi. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu thiết bị SEM.

Kết luận

Nghiên cứu này chứng minh có thể kích thích nảy mầm nhân tạo của bào tử EHP dưới phạm vi vi điện tử quét. Chúng tôi suy đoán rằng các ion (cation và anion) được tạo ra trong quá trình phân giải phóng xạ của nước đông lạnh có thể đã gây ra sự nảy mầm của bào tử. Đây là nghiên cứu đầu tiên chứng minh sự nảy mầm của một bào tử vi bào tử với SEM và sẽ hữu ích trong việc nghiên cứu sinh học, vòng đời và sự phát triển của các phương pháp điều trị / dự phòng cho việc kiểm soát EHP. Ngoài ra, phương pháp này có thể được sử dụng trong việc tiêu chuẩn hóa sự nảy mầm của bào tử của các vi khuẩn khác lây nhiễm cho động vật có xương sống và động vật không xương sống.

Tác giả: T. Sathish Kumar*, P. Ezhil Praveena, M. Makesh, M. Poornima, KP Jithendran

Biên dịch: Trầm Minh Nhựt – Công ty TNHH PTTS Bình Minh.

Từ khóa: Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), Penaeus vannamei, Vi bào tử trùng, Sự nẩy mầm của bào tử, Sự phân ly do phóng xạ (Radiolysis)

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức

Gây nảy mầm nhân tạo bào tử Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) bằng các ion thông qua kính hiển vi điện tử quét SEM.