Tác động của khẩu phần ăn của chiết xuất lá hương nhu tía Ocimum tenuiflorum lên các chỉ số tăng trưởng và phản ứng miễn dịch của tôm (Penaeus monodon) chống lại vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV)

Tóm tắt

Nghiên cứu hiện tại được tiến hành để đánh giá hiệu quả của chiết xuất Ocimum tenuiflorum chống lại virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) ở tôm sú (Penaeus monodon) sau khi thử nghiệm qua đường miệng in vivo. Chiết xuất methanol thu được từ quá trình chiết xuất được phun vào thức ăn ở nồng độ 0,0%, 0,05% và 0,1%. Thử nghiệm cho ăn được tiếp tục trong bốn tuần, sau đó tôm được tiêm WSSV và tỷ lệ chết được kiểm tra hai tuần sau thử nghiệm. Các phát hiện cho thấy tôm được cho ăn chiết xuất đã cải thiện đáng kể (p < 0,05) các thông số tăng trưởng (tăng trọng, tốc độ tăng trưởng riêng) và hiệu quả sử dụng thức ăn (tỷ lệ chuyển đổi thức ăn thấp hơn, tỷ lệ hiệu quả protein cao) so với nhóm đối chứng. Chiết xuất cải thiện đáng kể khả năng miễn dịch của tôm, được chứng minh bằng sự gia tăng các thông số miễn dịch bao gồm số lượng tế bào máu tổng số, hoạt động của prophenoloxidase, hoạt động của superoxide dismutase và điều hòa tăng các gen liên quan đến miễn dịch, cuối cùng làm tăng khả năng kháng bệnh ở Penaeus monodon chống lại WSSV. Dựa trên thí nghiệm, chiết xuất 0,1% có khả năng sinh trưởng và đáp ứng miễn dịch cao nhất đối với WSSV, tiếp theo là Nghiệm thức 1 và đối chứng. Do đó, chiết xuất Ocimum tenuiflorum có thể được sử dụng làm chất kích thích miễn dịch với thức ăn để thúc đẩy khả năng sinh trưởng và sức đề kháng của tôm đối với WSSV cũng như cho sản xuất tôm bền vững.

1. Giới thiệu

Nuôi tôm đã được mở rộng toàn cầu trong hai thập kỷ qua. Nuôi tôm mở rộng được thúc đẩy bởi nhu cầu toàn cầu gia tăng do dân số và phát triển kinh tế, trong khi nguồn cung tôm tự nhiên vẫn trì trệ. Tôm chiếm hơn 16,4% giá trị thương mại của các sản phẩm hải sản và thủy sản trên toàn thế giới, định vị nó là mặt hàng thực phẩm thương mại quan trọng thứ hai sau cá ngừ. Penaeus monodon, được gọi là tôm sú, là một loài rất quý trong ngành thương mại và sản lượng của nó vượt quá 717,1 nghìn tấn, chiếm 6,4% tổng sản lượng giáp xác. Bên cạnh thu nhập xuất khẩu, nuôi tôm tạo ra cơ hội việc làm, an ninh lương thực và thu nhập cho người dân nông thôn ở các vùng ven biển thiếu các nguồn khả năng sinh kế khác. Tuy nhiên, hệ thống nuôi tôm thâm canh gia tăng nhanh chóng dẫn đến sự xuất hiện và bùng phát của các bệnh do vi-rút và vi khuẩn gây ra mối nguy hiểm đáng kể nhất đối với ngành nuôi tôm trên toàn thế giới. Bệnh đốm trắng (WSD) là bệnh truyền nhiễm và phổ biến nhất đối với sản xuất tôm toàn cầu do vi-rút gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây ra, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể và vật chủ chết trong thời gian giới hạn (3–10 ngày) sau khi biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng. WSSV là đại diện duy nhất được biết đến của chi Whispovirus và họ Nimaviridae, là một loại vi-rút DNA dạng sợi kép, hình que và tròn. Do có nhiều loại vật chủ hiện có và nhân lên nhanh chóng, loại vi-rút này dường như khó ngăn ngừa và lây lan trong hệ thống nuôi trồng. Thiệt hại kinh tế trên toàn thế giới do bệnh WSD gây ra đã vượt quá 3 tỷ đô la mỗi năm, ảnh hưởng đáng kể đến một ngành toàn cầu có giá trị 19 tỷ đô la mỗi năm. Hành động đầu tiên được sử dụng để ngăn chặn sự lây lan của WSSV trong các trang trại là thực hiện các hướng dẫn an toàn sinh học, bao gồm các quy trình kiểm dịch nghiêm ngặt, khử trùng thiết bị và đưa đàn tôm không bị bệnh vào ao. Để tăng sản lượng tôm, việc sử dụng kháng sinh, thuốc thú y và thuốc khử trùng đang gia tăng trong đó việc sử dụng sai các hợp chất này đã dẫn đến tình trạng tôm kháng thuốc và ô nhiễm môi trường gia tăng, có khả năng gây nguy hiểm cho sự an toàn của con người và sự phát triển bền vững của hệ thống nuôi tôm (xem Hình 3).

Vì những lý do này, cần phải tạo ra các liệu pháp mới ngay lập tức để tránh và quản lý nhiễm WSSV. Hiện tại, không có thuốc kháng vi-rút nào được cấp phép để phòng ngừa các đợt bùng phát vi-rút trong nuôi tôm, do đó, rất cần phải phát triển các tác nhân kháng vi-rút có thể kiểm soát nhiễm WSSV trong nuôi tôm. Do có một số ưu điểm như an toàn tự nhiên, thường có sẵn, không độc tính và nhiều hợp chất hoạt tính sinh học, thuốc thảo dược có thể là giải pháp quan trọng cho các tác nhân thân thiện với môi trường và không gây ô nhiễm cùng với các lợi ích khác bao gồm thúc đẩy tăng trưởng, kháng bệnh, kích thích sự thèm ăn và kích thích miễn dịch ở tôm. Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ một số loại thực vật như Cynodon dactylon, Gracilaria corticata, Gynura bicolor, Ceriops tagal, Zingiber officinale cho thấy hoạt động đáng kể chống lại nhiễm trùng WSSV ở tôm.

Ocimum tenuiflorum được công nhận rộng rãi là “Biểu tượng của các loại thảo mộc” do các đặc tính y học rộng rãi và ý nghĩa lịch sử quan trọng của nó. Do ý nghĩa tâm linh của nó trên tiểu lục địa Ấn Độ, loài cây này được biết đến rộng rãi với tên gọi “Húng quế thánh”, “tulasi” hoặc “tulsi”. Loài cây này thuộc họ Lamiaceae và là cây lâu năm có mùi thơm. Nó thường được tìm thấy ở nhiều vùng Đông Nam Á. Ocimum tenuiflorum được sử dụng để điều trị nhiều loại bệnh chữa bệnh như cảm lạnh, đau đầu, biến chứng đường tiêu hóa, tình trạng viêm, rối loạn tim mạch, ngộ độc và sốt rét cũng như làm giảm đau khổ về mặt tâm lý-thể chất, viêm kết mạc và hen suyễn do đặc tính y học chữa bệnh của nó. Ocimum tenuiflorum làm giảm các gốc tự do, bảo vệ chống lại tổn thương oxy hóa và duy trì sự cân bằng của các enzym chống oxy hóa. Các thành phần của chiết xuất lá O. tenuiflorum bao gồm axit oleanolic, axit ursolic, eugenol, linalool và các hợp chất khác. Ocimum tenuiflorum đã được chứng minh có tiềm năng ức chế sự lây truyền của các loại vi-rút gây chết người bao gồm HSV, IHNV, Adenovirus, Enterovirus 71, H9N2, viêm gan B, vi-rút viêm gan C và SARS-CoV-2 trong số những loại khác. Trước đây, việc kết hợp cây O. tenuiflorum với các loại cây khác có thể làm giảm tỷ lệ chết của tôm khi tiếp xúc với WSSV. Mặc dù O. tenuiflorum thể hiện các đặc tính kháng vi-rút mạnh, nhưng hiệu quả của nó đối với WSSV ở tôm vẫn chưa được đánh giá thông qua đường miệng. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện để kiểm tra tác động của O. tenuiflorum đối với sự tăng trưởng của tôm, phản ứng miễn dịch và khả năng kháng bệnh đối với WSSV.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Chuẩn bị chiết xuất tenuiflorum thông qua chiết xuất quy mô lớn

Lá O. tenuiflorum tươi được thu thập từ Khulna, Bangladesh và được phân loại bởi Viện thảo dược quốc gia Bangladesh (BNH), Mirpur, Dhaka, nơi các mẫu được gửi đến thư viện của BNH (DACB 51327). Các lá được rửa sạch, sấy trong lò ở 40℃ và nghiền thành bột bằng máy xay cơ học. Khoảng 150 g bột khô được trộn với 1,5 L metanol ~ 100% (vì metanol là dung môi mạnh nhất để chiết xuất chống lại WSSV, đã được xem xét trong Tài liệu tham khảo) trong chai thủy tinh 2,5 L, sử dụng sóng siêu âm (30 phút) bốn lần cách nhau 6 giờ và đi qua vải mỏng sau khi lọc giấy. Sau đó, dung môi hóa học được bốc hơi bằng máy hóa hơi chân không quay (Hahnvapor, Hahnshin, Hàn Quốc) và toàn bộ quá trình được lặp lại cho đến khi sản lượng trở nên không đáng kể. Sản lượng chiết xuất là 7%. Các chất còn lại được bảo quản ở nhiệt độ -20℃ cho đến khi sử dụng.

2.2 Chuẩn bị khẩu phần ăn

Lượng chiết xuất cần thiết từ quá trình chiết xuất O. tenuiflorum quy mô lớn được hòa tan trong etanol và chiết xuất này được phun vào thức ăn dạng viên bao gồm protein (32%), chất béo thô (7%) và độ ẩm (12%) (phương pháp AOAC) bằng bình phun và trộn đều. Hai khẩu phần ăn thử nghiệm được lập công thức theo liều lượng chiết xuất như 0,05% (Nghiệm thức 1, OTT1) và 0,1% (Nghiệm thức 2, OTT2) với thức ăn cho tôm. Sau khi phun vào thức ăn, viên ẩm ban đầu được phơi khô trong không khí và sau đó được sấy khô trong lò ở nhiệt độ 40℃. Thức ăn đối chứng là phun một lượng etanol giống hệt mà không thêm chiết xuất. Độ ổn định của thức ăn trong nước được đánh giá theo phương pháp do Mohamad và cộng sự vạch ra. Khoảng 2 g viên thức ăn được ngâm trong một khoảng thời gian cụ thể trong bình (250 mL), bao gồm 100 mL nước. Sau thời gian rò rỉ được chỉ định, viên thức ăn ngập nước được lọc bằng giấy lọc. Mẫu thức ăn thu được được khử nước trong lò ở 100℃ trong 24 giờ. Chất rắn thu được được kiểm tra để xác định độ ổn định của viên thức ăn liên quan đến khả năng giữ lại vật liệu khô, bằng cách áp dụng công thức [Thức ăn còn lại (g)/thức ăn ban đầu (g)] × 100]. Gel liên kết được áp dụng cho khẩu phần ăn để hạn chế lượng chiết xuất bị mất trong nước.

2.3 Thu thập tôm và quản lý chăn nuôi

Tôm khỏe mạnh, có kích thước tương đương (2,1 g) sạch bệnh được mua từ một trại nuôi tôm và vận chuyển đến cơ sở nghiên cứu bằng cách sục khí. Tôm được đánh giá WSSV qua các chỉ số bên ngoài và được xác nhận bằng phân tích PCR. Độ mặn được duy trì ở mức 10 ppt bằng cách thêm nước ngọt có chứa nước muối đã thu thập (độ mặn = 150–200 ppt). Nước được xử lý bằng tia cực tím có thể uống được trước khi được chuyển vào các bể nghiên cứu (60L). Để duy trì nhiệt độ nước cần thiết, một máy nước nóng chìm mini đã được lắp đặt trong mỗi bể. Trước khi tiến hành nghiên cứu, 10 con tôm giống đã được thả vào mỗi bể và thích nghi trong mười ngày. Trong thời gian thích nghi, tôm được giữ lại để thay thế bất kỳ con tôm nào đã chết trong các bể thử nghiệm. Tôm được cho ăn với tỷ lệ 5% trọng lượng cơ thể của tôm hai lần một ngày và lượng thức ăn được kiểm tra thường xuyên sau khi cho ăn. Chất thải được loại bỏ hai lần một ngày trước khi cho ăn bằng cách hút nước. Để đảm bảo các thông số chất lượng nước được duy trì ở mức tốt nhất, thường xuyên thay 25% lượng nước trong bể. Một viên đá sục khí riêng lẻ đảm bảo oxy hóa liên tục trong mỗi bể để duy trì mức DO thích hợp trong suốt quá trình thí nghiệm. Các phép đo và ghi chép hàng ngày được thực hiện trên nhiều biện pháp đo chất lượng nước, với các giá trị sau được duy trì: Nhiệt độ: 28–30℃, pH: 8–8,5, Độ mặn: 10–12 ppt, Oxy hòa tan: >6 mg/L, Amoniac: <0,1 mg/L.

2.4 Công thức mẫu WSSV và hướng dẫn cảm nhiễm

Các nền nuôi cấy WSSV được tạo ra bằng cách sử dụng các hướng dẫn do Tsai và cộng sự thiết lập và Kang và cộng sự. Tóm lại, 0,5 g mang P. monodon bị nhiễm bệnh đã được nghiền nát và đồng nhất với 4,5 mL PBS. Sau đó, mẫu được ly tâm ở tốc độ 400×g trong 10 phút ở 4℃. Chất lỏng thu được, lọc qua bộ lọc lỗ 0,45 μm và sau đó pha loãng gấp mười lần để gây nhiễm cho tôm thử nghiệm với liều lượng 5 μL/g trọng lượng tôm. Tiêm vào phần lưng bên của phần bụng thứ 4 của tôm.

2.5 Đánh giá hoạt động kháng vi-rút bằng cách đưa thuốc qua đường ăn uống

Ngay sau khi tôm đã thích nghi, chúng được chia thành ba nhóm thử nghiệm khác nhau, mỗi nhóm có mười con tôm giống với ba lần lặp lại. Nhóm I được cho ăn khẩu phần ăn đối chứng, không chứa chiết xuất trong suốt thời gian kết thúc thí nghiệm được coi là nhóm đối chứng (C). Tôm ở nhóm II (nghiệm thức 1, T1) và nhóm III (nghiệm thức 2, T2), tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung chiết xuất với tỷ lệ lần lượt là 0,05% và 0,1% trong 4 tuần. Sau thời gian cho ăn, mỗi nhóm tôm được cảm nhiễm với WSSV thông qua tiêm và theo dõi trong hai tuần sau khi nhiễm bệnh. Thức ăn được sử dụng trước khi cảm nhiễm cũng được sử dụng sau khi cảm nhiễm và tiếp tục cho đến khi hoàn thành nghiên cứu.

2.6 Các số liệu về tăng trưởng và sử dụng thức ăn

Trước khi tôm được cảm nhiễm, dữ liệu về hiệu suất tăng trưởng đã được thu thập và một số biến đã được xác định, bao gồm tăng trọng (WG) và tốc độ tăng trưởng riêng (SGR). Việc sử dụng thức ăn được đánh giá bằng cách sử dụng các số liệu bao gồm tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) và tỷ lệ hiệu quả protein (PER). Công thức như sau:

WG = Wt– W0 SGR = ((ln(Wt) – ln(W0) / t x 100)

FCR = TFG/ TWG

PER = WG (g)/lượng protein hấp thụ (g)

Trong đó TFG biểu thị Tổng lượng thức ăn cho ăn và TWG biểu thị Tổng trọng lượng tôm tăng thêm

Tỷ lệ sống (%) = (Nt / N0) X 100%

Trong đó Nt biểu thị lượng tôm cuối cùng và N0 biểu thị lượng tôm ban đầu.

2.7 Phân tích huyết học và miễn dịch

Các thông số huyết học, bao gồm tổng số lượng tế bào máu (THC), thời gian đông máu (HCT) và các xét nghiệm miễn dịch như hoạt động của prophenoloxidase (proPO), hoạt động của superoxide dismutase (SOD) đã được đánh giá trước và sau khi cảm nhiễm.

2.7.1 Thu thập máu và xác định tổng số lượng tế bào máu (THC)

Hemolymp (100 μL) được thu thập từ phần bụng của tôm bằng cách sử dụng kim 26-gauge bên trong ống tiêm 1 mL có chất chống đông. Để đếm THC ngay lập tức, hemolymp được thu thập và trộn trong ống theo tỷ lệ 2:1 của chất chống đông và hemolymp. 20μL hemolymp hỗn hợp thu thập được được kết hợp với một giọt dung dịch (thuốc nhuộm Rose Bengal) để tăng khả năng hiển thị của hemoglobin để đếm. Một giọt mẫu hỗn hợp được đặt trên máy đo hemolymp (Precicolor HBG, Đức), được bọc trong thủy tinh và đặt bên dưới kính hiển vi (Labomed, Hoa Kỳ) để tiến hành THC. THC và hệ số điều chỉnh pha loãng được xác định bằng cách sử dụng các công thức đã chỉ định, với THC được biểu thị dưới dạng tế bào/mL.

THC = ((A + B + C + D) / 4) x 104 x Dcf

A B C D = Khối tế bào máu

Dcf = (thể tích chất chống đông + thể tích máu)/ thể tích máu

2.7.2 Xác định thời gian đông máu (HCT)

HCT được đánh giá bởi Liu và cộng sự. 100 μL hemolymp được thu thập và cho vào ống Eppendorf lạnh trước khi cho 25 μL mẫu vào ống mao quản thủy tinh đã được làm lạnh, sau đó đặt thẳng đứng sao cho lực hấp dẫn có thể khiến hemolymp chảy từ trên xuống dưới. Khi hemolymp chạm vào đầu dưới, ống được lật ngược một lần nữa và lặp lại quy trình cho đến khi máu đông lại.

2.7.3 Xác định hoạt động của prophenoloxidase (proPO) và superoxide dismutase (SOD)

Hoạt động của prophenoloxidase (proPO) trong hemolymp được xác định bằng máy quang phổ (Peak instruments, C-7200, Hoa Kỳ) và phương pháp của Le Moullac và cộng sự bằng cách giữ nguyên dopachrome từ L-dihydrophenylalanine (L-DOPA). Zymosan (0,1%) được tổng hợp trong đệm cacodylate và sau đó ly tâm ở tốc độ 2000g trong 10 phút. Phần dịch nổi thu được được sử dụng làm tác nhân để xác định proPO. Hemolymp được lấy ra ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 1000g ở 50℃. Sau thời gian ủ, hỗn hợp được ly tâm trong 5 phút ở tốc độ 700g. Sau đó, 180 μL chất lỏng thu được được chuyển vào ống Eppendorf và 75 μl L-DOPA được đưa vào. Sau 10 phút, thêm một thể tích 900 μL đệm cacodylate và đo OD ở bước sóng 490 nm bằng máy quang phổ.

SOD của cơ tôm được xác định bằng hướng dẫn của Creative BioMart, Inc., Hoa Kỳ (EC 1.15.1.1), được Marklund và Marklund và Jing và Zhao điều chỉnh. Thử nghiệm này đánh giá mối quan hệ giữa quá trình tự oxy hóa pyrogallol bởi O₂ − và quá trình chuyển đổi gốc bởi SOD, với sự ức chế tự oxy hóa 50% của pyrogallol được gọi là một đơn vị hoạt động SOD. Tốc độ oxy hóa của các mẫu được xác định bằng cách đưa 20 μL dung dịch thử nghiệm vào 2,35 mL dung dịch A, kèm theo 1,80 mL nước tinh khiết và sau đó kết hợp 0,15 mL dung dịch B. Độ hấp thụ ở 325 nm được đánh giá bằng cách sử dụng máy quang phổ (C-7200, Hoa Kỳ) để đánh giá tốc độ tự oxy hóa pyrogallol bằng cách phân tích sự thay đổi độ hấp thụ giữa mẫu trắng và mẫu được kiểm tra sau thời gian 1 phút. Hoạt động SOD được tính bằng công thức.

2.8 Phát hiện WSSV bằng PCR

Phân tích PCR được thực hiện sau thí nghiệm cảm nhiễm cho thấy sự hiện diện của nhiễm WSSV ở tôm. DNA được phân lập từ mang và chân chèo của tôm, được kết hợp, sử dụng Bộ dụng cụ tinh chế DNA (Monarch^® Genomic, Cat no: T3010S, Hoa Kỳ) theo quy trình do nhà sản xuất cung cấp. Nồng độ và độ tinh khiết của DNA được đo bằng cách xác định tỷ lệ A260/280 nm bằng Nanodrop (Nabi, Hàn Quốc). Vòng PCR đầu tiên và thứ hai (Lồng ghép) được thực hiện trên từng chiết xuất DNA riêng lẻ với bộ mồi WSSV được OIE khuyến nghị. Tổng thể tích của hỗn hợp là 25 μL (Bộ dụng cụ HotStarTaq^® Master Mix, Đức) bao gồm các mồi (0,5 μL, xuôi và ngược), nước không có RNase/DNase (9,5 μL), khuôn DNA (2 μL). Một máy chu trình nhiệt (Bio-Rad T100 PCR) đã được sử dụng và các điều kiện là 94℃ (3 phút), 94℃ (20 giây, 40 chu kỳ), 62℃ (20 giây) và 72℃ (30 giây), 72℃ (3 phút) và duy trì ở 4℃. Các mẫu dương tính dự kiến sẽ tạo ra đầu ra 1447 bp trong chu kỳ PCR đầu tiên và đầu ra 941 bp trong PCR lồng nhau. Sau đó, các sản phẩm được phân tách trong gel agarose 2%, nhuộm bằng thuốc nhuộm tải gel và quan sát bằng đèn chiếu tia cực tím.

2.9 Biểu hiện gen miễn dịch bằng PCR định lượng (qPCR)

Biểu hiện của một số gen miễn dịch đã được đánh giá bằng cách sử dụng qPCR. Gan tụy của tôm đã được sử dụng để chiết xuất tổng RNA bằng Trizol theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, cDNA sợi đầu tiên được tạo ra bằng cách sử dụng Bộ tổng hợp cDNA (ProtoScript^® II, Mã số Cat: E6560S, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất và bảo quản ở nhiệt độ -80℃ để thực hiện RT-PCR thời gian thực trong tương lai. PCR định lượng được thực hiện bằng HYRIS bCUBE™ (Anh), bao gồm hỗn hợp phản ứng gồm 2x Luna^® Universal qPCR Master Mix, các đoạn mồi xuôi và ngược, 6,5 μL nước (khử ion) và 2 μL khuôn mẫu (cDNA), tạo thành 20 μL. Là một gen quản gia, 16S rRNA đã được sử dụng và biểu hiện gen tương đối được xác định bằng phương trình bên dưới [47]. Biểu hiện tương đối của các gen ứng viên = 2^{-[ΔCt mẫu-ΔCt đối chứng]}

2.10 Phân tích thống kê

Dữ liệu được kiểm tra bằng ANOVA một chiều trong SPSS và hiển thị dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (Phiên bản 16). Kiểm định so sánh bội (Tukey) được triển khai để xác định xem có sự khác biệt đáng kể nào giữa các nhóm thử nghiệm hay không. Trước khi phân tích, tỷ lệ dữ liệu sống sót được chuẩn hóa trong Excel bằng phép biến đổi arcsin. Các giá trị trung bình trước và sau cảm nhiễm được đánh giá bằng kiểm định Student t-test. Giá trị p < 0,05 được sử dụng để xác định ý nghĩa của sự khác biệt.

3. Kết quả

3.1 Tác động của chiết xuất O. tenuiflorum đến hiệu suất tăng trưởng và sử dụng thức ăn của tôm

Tác động của chiết xuất O. tenuiflorum đến tăng trưởng, sử dụng thức ăn của tôm sau bốn tuần nuôi (trước khi cảm nhiễm) được hiển thị trong Bảng 1. Có sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) về tăng trưởng và sử dụng thức ăn của tôm giữa các nhóm thử nghiệm. Tăng trọng và SGR của tôm được xử lý bằng chiết xuất lớn hơn đáng kể (p < 0,05) so với tôm của nhóm đối chứng. Không thấy sự khác biệt đáng kể (p > 0,05) về trọng lượng ban đầu của tôm giữa các nhóm; tuy nhiên, sau 4 tuần nuôi, tôm ở nghiệm thức 2 (OTT2) cho thấy tăng trọng trung bình cao nhất (3,0 g) và SGR (3,18%), trong khi đối chứng có mức thấp nhất. Tương tự, tôm ở T2 có FCR giảm (2,3) và PER cao nhất (1,45) cho thấy sử dụng thức ăn tốt hơn trong khi tôm đối chứng có FCR tối đa (3,2) và PER giảm (1,01). Tỷ lệ sống của tôm thả là 85–100%, không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) trước khi cảm nhiễm.

3.2 Tác dụng của chiết xuất O. tenuiflorum lên tổng số tế bào máu (THC) của tôm

Chiết xuất từ O. tenuiflorum trong khẩu phần ăn có tác động đáng kể đến THC (p < 0,05) trong cả hai điều kiện (trước và sau cảm nhiễm) của tôm với WSSV (Hình 1). Mức THC trong tôm được cho ăn thức ăn đối chứng thấp hơn đáng kể (p < 0,05) so với mức THC trong tôm ở cả hai nghiệm thức. Tôm trong T2 (chiết xuất 0,1%) có nồng độ THC tối đa (p < 0,05), tiếp theo là T1 (0,05%) và đối chứng (0%). Mức THC giảm sau khi tôm cảm nhiễm ở toàn bộ các nhóm, có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với cảm nhiễm trước đó (xem Hình 2).

3.3 Tác động của chiết xuất từ O. tenuiflorum đến thời gian đông máu (HCT) của tôm

HCT của P. monodon thay đổi đáng kể (p < 0,05) bởi chiết xuất từ O. tenuiflorum trong khẩu phần ăn ở cả hai tình huống (trước và sau cảm nhiễm). Tôm đối chứng có thời gian đông máu dài nhất (115 giây trước khi cảm nhiễm và 167 giây sau khi cảm nhiễm) (p < 0,05), trong khi tôm được nuôi bằng khẩu phần ăn bổ sung 0,1% chiết xuất (T2) có thời gian đông máu ngắn nhất (lần lượt là 41 và 57 giây trước và sau khi cảm nhiễm). So với tôm trước khi cảm nhiễm, HCT cao hơn đáng kể (p < 0,05) ở tôm sau khi cảm nhiễm. HCT giảm khi tăng nồng độ (ở T1 và T2) của chiết xuất và luôn thấp hơn nhóm đối chứng.

3.4 Ảnh hưởng của chiết xuất O. tenuiflorum đến hoạt động prophenoloxidase (proPO) của tôm

Chiết xuất O. tenuiflorum trong khẩu phần ăn có tác động đáng kể (p < 0,05) đến proPO của tôm trong cả hai điều kiện (trước và sau khi cảm nhiễm với WSSV). Tôm ở T2 (chiết xuất 0,01%) có mức proPO cao nhất (p < 0,05), tiếp theo là T1, trong khi nhóm đối chứng biểu hiện mức ProPO giảm. Các giá trị cao hơn ở tôm sau khi cảm nhiễm so với tôm trước khi cảm nhiễm trong các nghiệm thức và cho thấy sự khác biệt đáng kể (p < 0,05) ngoại trừ nhóm đối chứng.

3.5 Ảnh hưởng của chiết xuất O. tenuiflorum đến hoạt động của superoxide dismutase (SOD)

Chiết xuất khẩu phần ăn của O. tenuiflorum có tác dụng đáng kể đến SOD (p < 0,05) giữa các nghiệm thức và đối chứng trong trước và sau cảm nhiễm WSSV. Nghiệm thức T2 (chiết xuất 0,1%) biểu hiện lượng SOD cao nhất (p < 0,05), trong khi tôm đối chứng biểu hiện mức SOD thấp nhất trong cả hai điều kiện. Giá trị SOD thể hiện mối tương quan tích cực với hàm lượng chiết xuất trong khẩu phần ăn. Giá trị SOD tăng sau khi cảm nhiễm với WSSV so với nhóm trước cảm nhiễm, không bao gồm nhóm đối chứng, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) (xem Hình 4).

3.6 Tác động của chiết xuất O. tenuiflorum đến biểu hiện tương đối của các gen liên quan đến miễn dịch

Biểu hiện tương đối của nhiều gen miễn dịch khác nhau (Lysozyme, penaeidin, proPO) đã được phân tích, kết quả được trình bày trong Hình 5. Chiết xuất từ O. tenuiflorum trong khẩu phần ăn có ảnh hưởng đáng kể đến biểu hiện của nhiều gen khác nhau của tôm. So với T1 và nhóm đối chứng, biểu hiện của các gen được chứng minh là cao nhất ở T2. Không giống như biểu hiện của các gen khác nhau, gen proPO biểu hiện mức độ biểu hiện cao hơn ở tôm được xử lý.

3.7 Ảnh hưởng của chiết xuất O. tenuiflorum đến tổng tỷ lệ tôm chết trong thí nghiệm cảm nhiễm WSSV

Tỷ lệ tôm chết được ghi nhận sau khi cảm nhiễm WSSV trong tối đa hai tuần (14 ngày) (Hình 6). Tỷ lệ chết tích lũy khác nhau giữa các nhóm thử nghiệm. Nhóm Nghiệm thức 2 (OTT2) có tỷ lệ chết tích lũy thấp nhất (55%) (p < 0,05), tiếp theo là Nghiệm thức 1 (75%), trong khi nhóm đối chứng có tỷ lệ chết cao nhất (100%) sau hai tuần cảm nhiễm với WSSV. Tổng tỷ lệ chết của tôm trong nhóm đối chứng được quan sát trong khoảng thời gian sáu ngày. Trong nhóm đối chứng, tôm chết ban đầu được nhìn thấy hai ngày sau khi cảm nhiễm, nhưng trông các nghiệm thức, tôm chết đầu tiên sau bốn hoặc năm ngày sau đó. Tuy nhiên, cho đến khi hoàn thành thí nghiệm, không có tôm nào chết ở nhóm tôm không được cảm nhiễm (đối chứng âm tính). Với mục đích xác nhận tình trạng nhiễm trùng, phân tích PCR đã được thực hiện trên cả tôm không được cảm nhiễm và tôm được cảm nhiễm với WSSV. Tất cả tôm được cảm nhiễm với WSSV đều được quan sát thấy biểu hiện dải ở 941 bp trong PCR lồng nhau, nhưng đối chứng âm tính thì không.

4. Thảo luận

Trong thời điểm hiện tại, với quy mô nuôi tôm liên tục mở rộng, tỷ lệ tái phát của các bệnh nhiễm vi-rút đã trở thành mối quan tâm đáng kể nhất đe dọa sự phát triển nhanh chóng của nghề nuôi tôm. Do không có bất kỳ phương pháp điều trị nào hiện tại, điều quan trọng là cần có một loại thuốc điều trị để tiêu diệt WSSV hiệu quả trong tôm. Các nghiên cứu gần đây sử dụng các biện pháp khắc phục bằng thảo dược hoặc chiết xuất thô của chúng có thể như một phương tiện để ngăn ngừa hoặc điều trị WSSV.

Nghiên cứu này chứng minh rằng tôm được bổ sung O. tenuiflorum (T2) có tốc độ tăng trưởng (WG, SGR) và hiệu quả thức ăn (FCR, PER) vượt trội so với nhóm đối chứng. Kết quả của nghiên cứu này tương tự như các kết quả được thấy trong các nghiên cứu trước đây khi kiểm tra hiệu quả của khẩu phần ăn bổ sung chiết xuất như Syzygium cumini, Forsythia suspensa, Phyllanthus amarus, Moringa oleifera, Zingiber officinale trong việc thúc đẩy sự tăng trưởng của tôm. Trong một nghiên cứu trước đây của Abdel-Tawwab và cộng sự, đã chỉ ra rằng các chỉ số về tăng trưởng và sử dụng thức ăn không cao khi tôm Ấn Độ (Penaeus indicus) được cho ăn một loài húng quế khác (Ocimum basilicum). Tuy nhiên, trong nghiên cứu hiện tại, các thông số này đã tăng lên. Tăng trưởng và hiệu quả thức ăn tốt hơn trong nghiên cứu hiện tại có thể liên quan đến quá trình tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn có trong khẩu phần ăn bổ sung chiết xuất, thúc đẩy hoạt tính của các enzym tiêu hóa nằm trong tuyến tiêu hóa của gan tụy. Việc trộn chiết xuất O. tenuiflorum với lượng cao hơn (trong nghiên cứu này) vào thức ăn có thể thúc đẩy giải phóng các enzym tiêu hóa, như lipase, amylase và protease, và hoạt động như một chất khai vị, tăng cường sự phát triển và sử dụng khẩu phần ăn.

Ở tôm, tế bào máu đóng vai trò là thành phần cơ bản của khả năng miễn dịch và các tế bào này tham gia vào các quá trình thực bào, bao bọc, phát triển các nốt sần, chữa lành vết thương, đông máu, giao tiếp tế bào-tế bào và kích hoạt proPO. Ở giáp xác, lượng tế bào máu lưu thông thấp hơn bình thường phần lớn có liên quan đến khả năng chống lại nhiễm trùng thấp hơn. Mối tương quan này đáng kể khi khả năng chống lại nhiễm trùng kém. Trong nghiên cứu này, nồng độ THC ở tôm được xử lý bằng chiết xuất tăng đáng kể so với nhóm đối chứng trước và sau khi cảm nhiễm. Các kết quả song song trước đây đã được nêu trong các nghiên cứu khác, trong đó nồng độ THC tăng lên khi tôm được cho ăn khẩu phần ăn bổ sung bao gồm Cynodon dactylon, Gynura bicolor và Cystoseira trinodis trong khi tiến hành thí nghiệm với WSSV. Trong khi các nghiên cứu khác đã ghi nhận sự gia tăng nồng độ THC ở tôm do các chiết xuất khác nhau, hiện tại không có thông tin nào về tác động của O. tenuiflorum đối với nồng độ THC khi tiếp xúc với WSSV. Nồng độ THC tăng cao ở tôm được xử lý có thể do mô tạo máu ở tôm trưởng thành nhanh chóng các tiền chất của tế bào máu, sau đó giải phóng hoặc chuyển các tế bào từ mô sang hemolymp, do hệ tuần hoàn máu mở của tôm, nơi chúng giúp duy trì số lượng và chức năng của tế bào máu ổn định. Ngược lại, nồng độ THC của tôm sau khi cảm nhiễm thấp hơn so với tôm trước khi cảm nhiễm. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng nồng độ THC đã giảm ở tôm tiếp xúc với WSSV. Theo phát hiện của Chang và cộng sự, nồng độ THC giảm mạnh xuống 60% sau 24 giờ cảm nhiễm với WSSV khi so sánh với nồng độ trước khi nhiễm P. monodon. Tế bào máu giảm ở tôm bị nhiễm có thể xảy ra do tế bào máu tích tụ tại vị trí tiêm để chữa lành vết thương và bao bọc các hạt lạ, hoặc do tế bào máu già hơn trong mô tạo máu đã đến cuối vòng đời của chúng. Vì vậy, nó có thể dẫn đến sự tăng sinh của các tế bào máu trẻ hơn và hoạt động nhiều hơn trong các nghiệm thức so với đối chứng.

HCT của tôm đã được xử lý bằng chiết xuất ngắn hơn đáng kể so với đối chứng, cả trước và sau khi cảm nhiễm với WSSV. Điều này phù hợp với các phát hiện của Balasubramanian et al. đối với Cynodon dactylon và Velmurugan et al. đối với Enteromorpha flexuosa, chứng minh rằng HCT giảm đáng kể ở tôm được cho ăn chiết xuất chống lại WSSV. Tôm được cho ăn với mức chiết xuất tối đa (T2) có ít HCT hơn, có lẽ là số lượng tế bào máu nhiều hơn và/hoặc nồng độ protein hemolymp cao hơn trong khẩu phần ăn này đối với tôm. HCT cũng tăng lên ở tôm sau khi chúng được cảm nhiễm với WSSV, tương tự như kết quả của Yoganandhan et al. và Hameed et al., đã quan sát thấy rằng HCT tăng lên ở tôm được tiêm WSSV so với tôm không được cảm nhiễm. Điều này có thể là do tôm đối chứng bị nhiễm bệnh có tải lượng vi-rút cao hơn và số lượng tế bào máu thấp hơn trong hemolymp của chúng, khiến hemolymp của chúng mất nhiều thời gian hơn để đông lại so với hemolymp của tôm được bổ sung chất kích thích miễn dịch.

Trong nghiên cứu hiện tại, proPO của tôm được xử lý bằng chiết xuất đã tăng lên trong cả hoàn cảnh trước và sau cảm nhiễm so với nhóm đối chứng. Tương tự như vậy, Balasubramanian et al. phát hiện ra rằng khẩu phần ăn giàu Cynodon dactylon đã thúc đẩy đáng kể hoạt động proPO ở tôm bị nhiễm WSSV so với nhóm đối chứng. Tương tự như vậy, proPO đã được thúc đẩy khi tôm được cho ăn Argemone mexicana, Gracilaria tenuistipitata cũng như khẩu phần ăn giàu thảo dược Cystoseira trinodis để bảo vệ chúng khỏi nhiễm WSSV. Do đó, trong nghiên cứu hiện tại, chiết xuất của O. tenuiflorum đóng vai trò là chất thúc đẩy và hỗ trợ nâng cao mức độ enzyme proPO được tiết ra.

SOD là một trong những enzyme chống oxy hóa quan trọng nhất và là một dấu ấn sinh học có thể được sử dụng để đánh giá thiệt hại oxy hóa của các loài thủy sinh. Nghiên cứu hiện tại đã chứng minh rằng việc bổ sung chiết xuất O. tenuiflorum vào khẩu phần ăn giúp tăng cường chức năng SOD ở tôm, dẫn đến phản ứng miễn dịch mạnh mẽ chống lại WSSV. Tương tự, tôm có khẩu phần ăn bao gồm chiết xuất của Cynodon dactylon, Gynura bicolor, Gracilaria corticata và Cystoseira trinodis, Zingiber officinale, đã có sự gia tăng hoạt tính của enzym SOD chống lại WSSV. Trong một nghiên cứu do Abdel-Tawwab và cộng sự thực hiện, phát hiện ra rằng SOD và glutathione peroxidase tăng đáng kể ở tôm Ấn Độ ăn dầu Ocimum basilicum (Penaeus indicus) với các giá trị tối đa tìm thấy trong các nghiệm thức (2,5–5,0 g/kg khẩu phần ăn). Do đó, chiết xuất trong khẩu phần ăn làm tăng mức độ hoạt tính của enzym ở tôm so với nhóm đối chứng trong nghiên cứu hiện tại. SOD tăng cao ở tôm sau khi được cảm nhiễm trong nghiên cứu này có thể được quy cho sự biểu hiện lớn hơn của hoạt tính enzyme do chất kích thích miễn dịch tạo ra khi bị stress, trái ngược với điều kiện bình thường, như đã được xác nhận bởi các nghiên cứu khác.

Nghiên cứu hiện tại phát hiện ra rằng các gen miễn dịch tăng lên ở những con tôm được bổ sung chiết xuất. Trước khi được thử nghiệm, gen proPO đã tăng đáng kể ở những con tôm được bổ sung chiết xuất Sargassum wightii so với tôm đối chứng. Một số gen liên quan đến miễn dịch tăng lên ở những con tôm được xử lý bằng chiết xuất khẩu phần ăn của Gynura bicolor, Cystoseira trinodis trong khi được cảm nhiễm WSSV. Sự kết hợp giữa chiết xuất và thức ăn có hiệu quả trong việc biểu hiện các gen liên quan đến miễn dịch ở tôm. Điều này xảy ra thông qua việc tăng cường hoạt động miễn dịch hoặc kích hoạt các tế bào chuyên biệt miễn dịch, cả hai đều góp phần vào cơ chế phòng vệ của tôm.

Ocimum tenuiflorum bao gồm nhiều chất bao gồm flavonoid và nhóm phenolic giúp tăng cường hoạt động thực bào và loại bỏ mầm bệnh cũng như trung hòa các gốc tự do trong cơ thể tôm dẫn đến giảm căng thẳng oxy hóa, cuối cùng tăng cường hệ thống miễn dịch. Ocimum tenuiflorum chứa các chất hoạt tính sinh học làm tăng sản xuất các gen liên quan đến miễn dịch, dẫn đến tổng hợp các peptide kháng khuẩn, prophenoloxidase và các chất khác giúp tăng cường hệ thống miễn dịch và giúp tôm chống lại các bệnh nhiễm trùng như WSSV hiệu quả. Chiết xuất của O. tenuiflorum có thể làm tăng tổng hợp các peptide kháng khuẩn (AMP). Các peptide này đóng vai trò là cơ chế phòng thủ ban đầu và chống lại các vi sinh vật, bao gồm cả tải lượng vi-rút trong cơ thể tôm.

Những phát hiện từ nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ chết tích lũy của tôm được xử lý bằng chiết xuất O. tenuiflorum giảm đáng kể so với tôm được sử dụng làm đối chứng, một phát hiện đã được xác nhận bởi một số nghiên cứu khác được tiến hành trong quá trình cảm nhiễm WSSV. Tỷ lệ chết tích lũy thấp hơn đáng kể đã được tìm thấy khi cảm nhiễm WSSV khi tôm được cho ăn chiết xuất của Ceriops tagal, Cynodon dactylon, Gynura bicolor, Gracilaria tenuistipitata cho thấy phản ứng miễn dịch tốt hơn. Trong nghiên cứu này, tôm đối chứng đã chết vì nhiễm WSSV trong vòng ba đến bốn ngày sau khi tiếp xúc với vi-rút, trong khi tôm được xử lý có khả năng miễn dịch nên sống sót qua cảm nhiễm. Do đó, một số chiết xuất có thể nâng cao khả năng kháng bệnh WSSV của tôm. Đây là kết quả cuối cùng khi kết hợp của một số thông số và khả năng này có thể được tăng lên bằng chiết xuất thực vật. Các tác nhân chống vi-rút ức chế hoặc tiêu diệt vi-rút chủ yếu thông qua ba cơ chế: phá hủy trực tiếp vi-rút; ngăn chặn sự bám dính và xâm nhập vào tế bào vật chủ; và ngăn ngừa sự sinh sản của vi-rút và quá trình tổng hợp sinh học của chúng hoặc ức chế sự phát triển và thải vi-rút. Các chiết xuất nhắm vào các thành phần vi-rút có thể ức chế sự lây truyền vi-rút tiếp theo và hoạt động như một phương pháp hiệu quả để bảo vệ vật chủ.

Trong suốt quá trình thử nghiệm, không thể nghiên cứu đầy đủ về tính khả dụng sinh học và dược động học của các chiết xuất/hợp chất trong cơ thể tôm. Nghiên cứu sâu hơn nên tập trung vào việc nghiên cứu cơ chế mà chiết xuất và các hợp chất được phát hiện hoạt động, cũng như nghiên cứu hiệu quả in vivo của các hợp chất này đối với WSSV trong nuôi tôm. Để xác minh hiệu quả của chiết xuất, cần phải thực hiện toàn bộ chu kỳ nuôi tôm trong ao hoặc trang trại của người nuôi.

4. Kết luận

Nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng bổ sung chiết xuất O. tenuiflorum trong khẩu phần ăn làm tăng tốc độ tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của tôm. Chiết xuất này thúc đẩy khả năng miễn dịch của tôm, được chứng minh bằng các thông số miễn dịch được cải thiện và tăng các gen miễn dịch, phát triển khả năng kháng bệnh ở P. monodon chống lại WSSV với tỷ lệ chết giảm. Theo các thiết lập thử nghiệm hiện tại, liều bổ sung chiết xuất tốt nhất vào khẩu phần ăn là 0,1% về mặt tăng trưởng và khả năng miễn dịch của tôm. Những phát hiện của nghiên cứu này cung cấp những hiểu biết có giá trị về tác động của chiết xuất O. tenuiflorum như một chất phụ gia thức ăn cho tôm, cụ thể là chất tăng trưởng và chất kích thích miễn dịch, để thúc đẩy sản xuất tôm bền vững.

Theo Md Rejwanul Haque Galib, Alokesh Kumar Ghosh, Wasim Sabbir

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844024176141

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức