Phần 2: Glutamate tăng cường khả năng kháng khuẩn của tôm bằng cách tăng cường khả năng miễn dịch tế bào của tôm

Kết quả

Mối tương quan giữa mức glutamate hemolymp của tôm và tổng số tế bào máu của nó

Nồng độ glutamate hemolymp trong tôm lấy mẫu dao động từ 8 đến 17 mM, trong khi giá trị THC thay đổi từ 0,8 × 10⁷ tế bào / ml đến 3,6 × 10⁷ tế bào / ml (Hình 1). Phân tích hồi quy tuyến tính về mối quan hệ giữa nồng độ glutamate hemolymp và THC đã chứng minh mối tương quan tích cực giữa hai biến này.

Hình 1. Mối tương quan giữa glutamate hemolymp tôm và tổng số tế bào máu. Hemolymp từ 20 con tôm được thu thập và tiến hành phân tích hàm lượng glutamate và tổng số tế bào máu, và mối quan hệ của chúng được kiểm tra bằng phân tích hồi quy tuyến tính.

Cải thiện hiệu suất tăng trưởng, hương vị và tổng số tế bào máu của tôm nhờ vào sự kích hoạt GRIK2 do glutamate tác động

Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, so với glycine, việc tiêm glutamate làm tăng đáng kể mức THC sau 2 giờ tiêm. Hơn nữa, việc sử dụng đồng thời WAY-303,290 đã làm giảm hiệu quả gia tăng này (Hình 2A). Thêm vào đó, tiêm glutamate đã làm tăng sự điều hòa một số gen liên quan đến chu kỳ tế bào và con đường truyền tín hiệu Hippo, trong khi sự biểu hiện của các gen này bị ức chế khi có mặt của WAY-303,290 (Hình 2B). Cụ thể, các gen bị ảnh hưởng bao gồm: Sphase kinase-associated protein 2-like (ncbi_113,826,388), đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự tiến triển chu kỳ tế bào thông qua việc phân hủy các protein bằng cách nhắm mục tiêu vào các phân tử qua trung gian ubiquitin, đặc biệt trong pha S. Protein phosphatase đặc hiệu kép giống 7 (ncbi_113,827,639), có liên quan đến quá trình khử phosphoryl hóa các gốc tyrosine và serine/threonine, góp phần vào điều hòa chu kỳ tế bào và các con đường truyền tín hiệu, giúp duy trì cân bằng nội môi tế bào. Cyclin-E giống G1/S đặc hiệu (ncbi_113,822,658), cần thiết cho sự chuyển đổi từ pha G1 sang pha S, thúc đẩy tiến trình chu kỳ tế bào thông qua việc kích hoạt các kinase phụ thuộc cyclin (CDK), đóng vai trò quan trọng trong quá trình sao chép DNA. Các gen liên quan đến con đường truyền tín hiệu Hippo, chẳng hạn như yếu tố tăng cường phiên mã giống TEF-1 (ncbi_113,823,667), cũng được phát hiện là gia tăng sau khi tiêm glutamate, trong khi sự biểu hiện của chúng bị ức chế khi có sự hiện diện của WAY-303,290 (Hình 2B).

Hình 2. Glutamate làm tăng tổng số tế bào máu ở tôm thông qua Girk2. (A) Cảm ứng tổng số tế bào máu ở tôm bằng cách tiêm glutamate. Tôm được tiêm glycine, glutamate và glutamate + WAY-303,290 riêng biệt. Hemolymp từ mỗi con tôm được thu thập sau 0, 2, 4, 8 giờ sau khi tiêm và tế bào máu trong hemolymp được đếm và ghi lại. (B) Mức độ biểu hiện của protein giống S-phase kinase-associated protein 2, protein phosphatase đặc hiệu kép giống 7, cyclin-E giống G1/Sspecific và yếu tố tăng cường phiên mã TEF-1 ở tôm không được xử lý, xử lý bằng glycine, xử lý bằng glutamate và xử lý bằng glutamate + WAY-303,290. Các tế bào máu từ tôm với các nghiệm thức khác nhau được thu thập sau 2 giờ tiêm để chuẩn bị cDNA và phân tích qPCR. Giá trị biểu hiện được chuẩn hóa theo giá trị của EF-1α bằng phương pháp 2^-ΔΔCT và thanh biểu thị ± SD của giá trị trung bình (n = 3). Ý nghĩa của sự khác biệt được xác định bằng Student t-test hai đuôi không ghép đôi so với đối chứng và được biểu thị bằng dấu hoa thị (ns > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Chúng tôi tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng của glutamate trong nuôi tôm. Cụ thể, chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung glutamate đến hiệu suất tăng trưởng và thành phần cơ của tôm. Kết quả cho thấy phần lớn các chỉ tiêu liên quan đến tăng trưởng không có sự khác biệt rõ rệt giữa các mức bổ sung glutamate khác nhau, ngoại trừ histidine (HIS) tăng lên khi bổ sung glutamate (Bảng 2). Phân tích thành phần cơ cho thấy tỷ lệ protein thô tăng đáng kể khi hàm lượng glutamate bổ sung vượt quá 0,25% (Bảng 3). Đặc biệt, nồng độ glutamate trong cơ tôm cũng tăng lên rõ rệt khi mức bổ sung đạt từ 0,25% trở lên (Bảng 5). Những phát hiện này gợi ý rằng glutamate không chỉ có khả năng ảnh hưởng đến hoạt động của tế bào máu thông qua kích hoạt Grik2, mà còn tác động tích cực đến thành phần cơ, đặc biệt là hàm lượng protein và histidine.

**Tác dụng chống Vibrio khi bổ sung glutamate**

Tế bào máu đóng vai trò thiết yếu trong cơ chế bảo vệ tự nhiên của tôm trước sự xâm nhập của các loài vi khuẩn Vibrio. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã bổ sung glutamate vào khẩu phần ăn của tôm với các nồng độ khác nhau (0; 0,10%; 0,25%; 0,50% và 1,00%) nhằm đánh giá ảnh hưởng của glutamate đến khả năng kháng Vibrio của tôm (Bảng 1). Việc bổ sung glutamate không làm thay đổi đáng kể thành phần dinh dưỡng tổng thể của thức ăn (Bảng 1), nhưng đã làm gia tăng rõ rệt hàm lượng glutamate trong khẩu phần ăn, từ 7,83% lên 8,72% khi bổ sung 1,00% glutamate (Bảng 4). Sau 35 ngày cho ăn, tổng số lượng tế bào máu (THC) được đo lường. Kết quả cho thấy THC tăng đáng kể ở các nhóm được bổ sung 0,10% và 0,25% glutamate, trong khi hiệu quả này giảm dần ở các mức bổ sung cao hơn như 0,50% và 1,00% (Hình 3A). Đặc biệt, trong các thí nghiệm cảm nhiễm với Vibrio, chỉ nhóm tôm được bổ sung 0,25% glutamate thể hiện khả năng kháng khuẩn vượt trội có ý nghĩa thống kê (Hình 3B).

Hình 3. Tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0,25% glutamate có hàm lượng THC cao nhất và khả năng kháng Vibrio tốt nhất. (A) Tôm THC với khẩu phần ăn có chứa 0%, 0,10%, 0,25%, 0,50%, 1,00% glutamate. Tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0%, 0,10%, 0,25%, 0,50%, 1,00% glutamate trong 35 ngày. Sau đó, thu thập và đếm các tế bào máu. Mức độ khác biệt có ý nghĩa được xác định bằng Student t-test hai đuôi không ghép đôi so với đối chứng và được biểu thị bằng dấu hoa thị (ns > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). (B) Đường cong sống sót của tôm được tiêm V. parahaemolyticus. Tôm được cho ăn khẩu phần ăn có chứa 0%, 0,10%, 0,25%, 0,50%, 1,00% glutamate trong 35 ngày. Sau đó, tôm được cảm nhiễm với V. parahaemolyticus và cá thể sống sót được ghi lại sau mỗi 6 giờ. Phân tích thống kê được thực hiện bằng kiểm định log-rank, **p < 0,01.

Phân tích gen biểu hiện khác biệt (DEG) của tế bào máu tôm với khẩu phần ăn bổ sung glutamate khác nhau

Nhằm làm rõ hơn các kiểu hình phức tạp của tôm liên quan đến việc bổ sung glutamate, các tế bào máu đã được thu thập từ tôm tiếp xúc với các nồng độ glutamate khác nhau và phân tích thông qua hồ sơ phiên mã. So với nhóm đối chứng (0% glutamate), kết quả cho thấy sự thay đổi rõ rệt trong biểu hiện gen: ở nhóm 0,10% glutamate, có 615 gen được điều chỉnh tăng và 410 gen điều chỉnh giảm; nhóm 0,25% ghi nhận 953 gen tăng và 524 gen giảm; nhóm 0,50% có 763 gen tăng và 369 gen giảm; trong khi nhóm 1,00% ghi nhận 830 gen tăng và 435 gen giảm (Hình 4A). Phân tích sâu hơn dựa trên cơ sở dữ liệu KEGG (Bách khoa toàn thư về gen và bộ gen Kyoto) cho thấy: ở nhóm 0,25%, các gen liên quan đến con đường truyền tín hiệu Hippo được làm giàu đáng kể, với RichFactor vượt 0,2. Nhóm 0,50% cho thấy sự làm giàu rõ rệt các gen tham gia vào quá trình chuyển hóa d-glutamine và d-glutamate, với RichFactor vượt ngưỡng 0,4. Đối với nhóm 1,00%, các gen liên quan đến sửa chữa không khớp và chuyển hóa d-arginine và d-ornithine cũng được làm giàu đáng kể, với RichFactor trên 0,25 (Hình 4B). Để hiểu rõ hơn các kiểu hình quan sát được, chúng tôi đã xác định và xác nhận các gen có mức biểu hiện cao nhất trong nhóm 0,25%, bao gồm: lectin loại C 2 (ncbi_113816183), cyclin-E đặc hiệu G1/S (ncbi_113822658), yếu tố tăng cường phiên mã giống TEF-1 (ncbi_113823667) và protein giống miền liên kết ras 4 (ncbi_113821473) (Hình 5 và Hình 6).

Hình 4. Phân tích DEG đối với tôm được cho ăn bổ sung glutamate khác nhau. (A) So sánh các gen biểu hiện khác biệt (DEG) giữa các nhóm. (B) Phân tích làm giàu con đường KEGG đối với tôm được cho ăn bổ sung glutamate khác nhau.

Hình 5. Xác nhận các gen biểu hiện khác biệt (DEG) bằng qPCR. Để xác nhận dữ liệu RNA-seq, mức độ biểu hiện gen tương đối của 6 DEG được chọn đã được kiểm tra bằng qPCR. Các giá trị biểu hiện đã được chuẩn hóa theo giá trị của EF-1α bằng phương pháp 2^-ΔΔCT và thanh biểu thị ± SD của giá trị trung bình (n = 3). Phân tích thống kê đã được thực hiện bằng cách sử dụng kiểm định phạm vi đa dạng của Duncan. Các thanh có chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể (p < 0,05).

Hình 6. Cơ chế có thể có về cách glutamate ảnh hưởng đến khả năng miễn dịch tế bào của tôm.

Thảo luận

Glutamate, một axit amin đa chức năng, đã được sử dụng phổ biến trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi. Nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng tôm có phản ứng nhạy hơn với glutamate so với các loài vật nuôi khác. Khi được bổ sung glutamate với tỷ lệ phù hợp vào khẩu phần ăn, tôm thể hiện khả năng đề kháng cao hơn với các loài vi khuẩn Vibrio và chất lượng hương vị cũng được cải thiện. Tuy nhiên, việc sử dụng glutamate ở nồng độ quá cao có thể gây ra những ảnh hưởng tiêu cực, làm giảm hiệu quả tích cực ban đầu.

Phát hiện của chúng tôi cho thấy việc bổ sung glutamate trong nuôi tôm mang lại những hiệu quả tương tự như khi áp dụng trong nuôi cá. Cụ thể, glutamate đã được chứng minh là có thể cải thiện rõ rệt hệ số tình trạng và chỉ số nội tạng của cá trắm cỏ non (Ctenopharyngodon idella). Ngoài ra, các nghiên cứu cho thấy việc bổ sung từ 1–4% glutamate vào khẩu phần ăn giúp nâng cao hiệu suất tăng trưởng, chất lượng phi lê, khả năng chống oxy hóa, chức năng tiêu hóa và hấp thụ, cũng như tăng cường phản ứng miễn dịch ở nhiều loài cá. Trong nghiên cứu với tôm, chúng tôi ghi nhận những cải thiện tương tự về sức đề kháng và chất lượng phi lê ngay cả khi sử dụng liều lượng thấp hơn (0,25%). Điều này gợi ý rằng mặc dù hiệu quả mang lại tương đương, tôm có ngưỡng chịu đựng glutamate thấp hơn đáng kể so với cá.

Việc bổ sung glutamate vào khẩu phần ăn với mức từ 0,50% trở lên có vẻ vượt quá khả năng chuyển hóa của tôm, gây ra tổn thương DNA. Điều này được thể hiện qua sự kích hoạt của các gen liên quan đến dị hóa glutamate và sửa chữa DNA khi tôm được cho ăn khẩu phần chứa 0,50% và 1,00% glutamate (Hình 4). Hàm lượng glutamate cao không chỉ gây độc tính thần kinh và liên quan đến các quá trình thoái hóa thần kinh ở người, mà còn làm tăng stress oxy hóa ở các loài chân khớp như Nauphoeta cinerea. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng việc bổ sung glutamate quá mức có thể làm giảm tỷ lệ sống sót ở các loài giáp xác, có khả năng thông qua các cơ chế tương tự như ở động vật có xương sống và côn trùng.

Con đường truyền tín hiệu Hippo là một chuỗi tín hiệu được bảo tồn qua tiến hóa, có vai trò điều hòa nhiều quá trình sinh học khác nhau. TEF-1, một thành viên thuộc họ yếu tố phiên mã TEAD, giữ vai trò là yếu tố phiên mã trung tâm trong con đường này. Khi con đường Hippo không hoạt động, TEF-1 liên kết với YAP/TAZ ở trạng thái không phosphoryl hóa để kích hoạt biểu hiện các gen liên quan đến sự sống sót và tăng sinh tế bào. Do đó, mức biểu hiện của TEF-1 cao nhất ở nhóm tôm được bổ sung 0,25% glutamate, điều này có thể lý giải cho việc nhóm này có số lượng tế bào máu toàn phần (THC) cao nhất. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy con đường Hippo có tác động tiêu cực đến khả năng kháng Vibrio của tôm, cho thấy việc bổ sung glutamate ở mức vừa phải có thể giúp tối ưu hoạt động của con đường này, từ đó tăng cường đáp ứng miễn dịch và thúc đẩy quá trình tăng sinh tế bào. Ở nhóm bổ sung 0,5% glutamate, có sự làm giàu rõ rệt các gen liên quan đến chuyển hóa d-glutamine và d-glutamate, vốn có liên hệ mật thiết với chức năng miễn dịch. Trong bối cảnh nhiễm trùng và stress làm tăng quá trình dị hóa, các tế bào miễn dịch sử dụng glutamine với tốc độ cao để tạo ra các chất trung gian chuyển hóa thiết yếu như glutamate, aspartate và alanine. Những chất này đáp ứng nhu cầu năng lượng và vật liệu của tế bào miễn dịch, cho thấy rằng mức bổ sung 0,5% glutamate có thể vượt quá khả năng sử dụng sinh lý thông thường ở tôm, dẫn đến hiện tượng dị hóa không hoàn toàn và làm tăng biểu hiện các gen liên quan.

Trong nhóm sử dụng 1% glutamate, một số dấu hiệu độc tính tế bào đã được ghi nhận, có liên quan đến sự tăng cường biểu hiện các gen liên quan đến sửa chữa sai khớp cũng như quá trình chuyển hóa d-arginine và d-ornithine. Sự gia tăng điều hòa này có thể phản ánh sự kích hoạt của các phản ứng miễn dịch và viêm, do các quá trình chuyển hóa này đóng vai trò cung cấp năng lượng và chất nền cần thiết cho hoạt động của tế bào miễn dịch. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi củng cố nhận định này, khi cho thấy tôm được bổ sung 0,25% glutamate có mức hoạt động của con đường Hippo thấp nhất, đồng thời thể hiện phản ứng miễn dịch mạnh mẽ nhất trước sự xâm nhiễm của Vibrio.

Nghiên cứu hiện tại cho thấy glutamate được kiểm soát chặt chẽ ở tôm và đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của chúng. Việc kiểm soát này là một phần trong mạng lưới cơ chế phức tạp, trong đó chúng tôi mới chỉ làm rõ được một phần rất nhỏ. Ngoài ra, lượng protein cao trong khẩu phần ăn của tôm có thể được chuyển hóa thành glutamate trong ruột, làm dấy lên câu hỏi về sự khác biệt trong tác động giữa glutamate có nguồn gốc từ protein và glutamate ở dạng tinh thể. Các nghiên cứu trong tương lai cần tập trung làm rõ những khác biệt này và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến sự tăng trưởng và sức khỏe của tôm.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện một đánh giá toàn diện về ảnh hưởng của glutamate dạng tinh thể đối với thức ăn dành cho tôm. Kết quả thu được đã cung cấp cơ sở khoa học đáng tin cậy cho việc sử dụng glutamate dạng tinh thể như một chất bổ sung trong khẩu phần ăn, góp phần nâng cao hiệu quả trong ngành sản xuất thức ăn cho giáp xác.

Kết luận

Tóm lại, nghiên cứu này cung cấp một cái nhìn toàn diện về tác động của việc bổ sung glutamate dạng tinh thể vào khẩu phần ăn cho tôm. Các phát hiện chỉ ra rằng nồng độ tối ưu 0,25% glutamate có thể cải thiện rõ rệt khả năng chống lại Vibrio và nâng cao hương vị. Tuy nhiên, khi vượt quá mức này, các tác dụng tích cực sẽ bị giảm sút. Quan trọng hơn, nghiên cứu xác định con đường truyền tín hiệu Hippo là yếu tố trung gian chính trong phản ứng miễn dịch đối với glutamate. Những kết quả này tạo ra nền tảng vững chắc cho các nghiên cứu sâu hơn về vai trò của glutamate như một chất phụ gia dinh dưỡng trong ngành thức ăn cho động vật giáp xác, đồng thời nhấn mạnh sự cần thiết phải tiếp tục nghiên cứu để làm rõ các cơ chế phức tạp liên quan.

Theo Lei Ma, Wenyong Jiang, Zhiyao Lu, Yanmei Tong, Qingyun Liu, Zhonghua He, Xiuli Chen, Yongzhen Zhao, Fan Wang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2950311625000102

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Đọc thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức