Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức

Phần 2: Ảnh Hưởng Của Stress Amoniac (NH3) Đối Với Tế Bào Máu Của Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei

3.2. Phân tích chất chuyển hóa của huyết thanh

3.2.1. Phân tích kiểm soát chất lượng

Độ ổn định của hệ thống được phân tích và đánh giá bằng cách kiểm soát chất lượng (QC) so sánh mẫu quang phổ và phân tích thành phần chính. Kết quả của quang phổ chồng chéo cho thấy cường độ phản ứng và thời gian lưu giữ của tất cả các đỉnh quang phổ về cơ bản là chồng chéo lên nhau, cho thấy rằng sự thay đổi gây ra bởi các lỗi thiết bị trong toàn bộ thí nghiệm là tương đối nhỏ (Hình S1). Tổng phân tích thành phần chính của mẫu cho thấy các mẫu QC được nhóm lại với nhau ở chế độ ion dương và âm, cho thấy khả năng lặp lại thử nghiệm là tốt (Hình. S2).

3.2.2. Các chất chuyển hóa phân biệt

Tổng cộng có 25 chất chuyển hóa vi phân đã được xác định ở chế độ ion dương và âm (Bảng 4). Ở chế độ ion dương, 22 chất chuyển hóa vi phân đã được xác định và 7 chất chuyển hóa vi phân được xác định ở chế độ ion âm, trong khi 4 chất chuyển hóa được xác định ở cả hai chế độ (Hình 2). Phân tích làm giàu KEGG cho thấy các chất chuyển hóa khác biệt chủ yếu được làm giàu trong các con đường chuyển hóa purin, sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp, chất vận chuyển ABC và chuyển hóa axit amin (Hình 3). Các chất chuyển hóa vi phân được phân thành bốn loại theo tính chất của chúng. Mười axit amin bao gồm Pro-Gly, LPhenylalanine, L-Glutamine, L-Anserine, D-Pyroglutamic acid, DProline, taurine, axit 3-Hydroxyanthranilic, creatinine và L-Proline cho thấy nội dung khác biệt khi phơi nhiễm với amoniac, trong khi hầu hết cho thấy hàm lượng ít hơn trong nhóm phơi nhiễm với amoniac, ngoại trừ L-Proline. 8 thành phần nucleotide liên quan đến chuyển hóa nucleotide cho thấy sự khác biệt sau khi phơi nhiễm với amoniac, bao gồm uracil, inosine, xanthine và oxypurinol với up-regulation, trong khi bốn thành phần khác bao gồm hypoxanthine, guanosine, guanine và deoxyinosine cho thấy sự điều hòa. 4 chất chuyển hóa lipid bao gồm acetylcarnitine, 1,2- Di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine, glycerophosphocholine và PC (16:0/ 16:0) (1-16: 0-2-16: 0-Phosphatidylcholine) cho thấy biểu hiện khác biệt. Hai chất chuyển hóa đầu tiên được điều chỉnh lên và hai chất chuyển hóa sau được điều chỉnh xuống trong nhóm phơi nhiễm với amoniac. Axit citric tham gia vào chu trình TCA cho thấy sự điều tiết rõ ràng dưới áp lực amoniac.

Bảng 4. Các chất chuyển hóa vi sai nhóm căng thẳng amoniac và nhóm đối chứng với chế độ ion dương hoặc âm

Hình 2. Phân cụm phân cấp của tất cả các chất chuyển hóa vi sai sau khi tiếp xúc với amoniac; Sự phân cụm cho thấy các kiểu biểu hiện tương tự giữa các mẫu của nhóm đối chứng (C) và nhóm tiếp xúc với amoniac (N) (trục x) và trong số các chất chuyển hóa vi phân (trục y). Màu sắc đại diện cho các mức biểu hiện chất chuyển hóa từ xanh lam (thấp) đến đỏ (cao). A, chế độ ion dương; B, chế độ ion âm. (Để giải thích các tham chiếu đến màu sắc trong chú thích hình này, người đọc được tham khảo phiên bản Web của bài viết này.)

Hình 3. Kết quả làm giàu con đường KEGG của các chất chuyển hóa khác biệt giữa nhóm ứng suất amoniac và nhóm đối chứng. A đã cho thấy thông tin về kết quả làm giàu con đường KEGG của các chất chuyển hóa vi phân và giá trị P. B cho thấy số lượng các chất chuyển hóa khác biệt trong mỗi con đường trao đổi chất.

3.3. Ảnh hưởng của việc phơi nhiễm với amoniac đối với tế bào máu của tôm

Tổng số lượng tế bào máu (THC) ở tôm stress amoniac trong bảy ngày thấp hơn đáng kể so với ở tôm thuộc nhóm đối chứng (Hình 4). THC trong nhóm thử nghiệm giảm 56,04% so với nhóm đối chứng. Để hiểu thêm về ảnh hưởng của việc phơi nhiễm với amoniac đối với quá trình chết rụng tế bào máu trong các thời gian khác nhau, tỷ lệ tế bào máu apoptotic được phát hiện ở 0, 1, 3, 5 và 7 ngày khi phơi nhiễm với amoniac và dữ liệu được thể hiện trong Hình 5. Các tế bào máu apoptotic cũng được kiểm tra bằng kính hiển vi (Hình S3). Trong 5 ngày đầu tiên, tỷ lệ tế bào apoptotic tăng dần với việc kéo dài thời gian phơi nhiễm với N amoniac và nó đạt mức tối đa với giá trị 12,44% vào ngày thứ 5. Tuy nhiên, giá trị này đã giảm xuống còn 7,30% vào ngày thứ 7 (Hình 5).

Hình 4. Phát hiện trên tổng số lượng tế bào máu của tôm từ nhóm tiếp xúc với amoniac và nhóm đối chứng. C, nhóm đối chứng; N, nhóm tiếp xúc với amoniac. Các thanh dọc đại diện cho giá trị trung bình ± S.E. (n 1/4 5). Các dấu sao (*) cho thấy sự khác biệt đáng kể đối với mức độ biểu hiện gen giữa nhóm căng thẳng amoniac và nhóm đối chứng ở P < 0,05.

Hình 5. Phát hiện tỷ lệ tế bào apoptotic của hemocytes của tôm vào lúc 0, 1, 3, 5 và 7 ngày sau khi tiếp xúc với amoniac bằng phương pháp tế bào học dòng chảy. Apoptosis được phát hiện bởi bộ dụng cụ apoptosis Annexin V-FITC/ PI và phân tích tế bào học dòng chảy. Từ A đến E cho thấy kết quả xét nghiệm 0-7 ngày; Trục X hiển thị tín hiệu huỳnh quang PI, trục Y hiển thị tín hiệu huỳnh quang FITC; Q1, tế bào apoptotic sớm (Annexin V-FITC+/PI–); Q2, tế bào apoptotic muộn (Annexin V-FITC+/PI+); Q3, tế bào không apoptotic (Annexin V-FITC–/ FIT–); Q4, tế bào hoại tử (Annexin V-FITC– / PI+). F cho thấy kết quả phân tích thống kê. Các thanh dọc đại diện cho giá trị trung bình ± S.E. (n 1/4 10). Các chữ cái, ”a”, ”b ”, ”c ”, và ”d ” đại diện cho sự khác biệt đáng kể của tỷ lệ tế bào apoptotic trong các nhóm khác nhau ở P < 0,05.

3.4. Tác dụng của các chất chuyển hóa khác nhau đối với quá trình apoptosis của tế bào máu tôm

Để nghiên cứu mối quan hệ giữa các chất chuyển hóa phân biệt huyết thanh và quá trình chết rụng của tế bào máu, bốn chất chuyển hóa phân biệt được điều chỉnh tăng bao gồm L-proline, 1, 2-Di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine, triethanolamine, oxypurinol đã được chọn để tiêm tôm và tỷ lệ tế bào apoptotic của tế bào máu đã được phát hiện. Tỷ lệ tế bào apoptotic của hemocytes trong triethanolamine hoặc oxypurinol tiêm tôm cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng, trong khi không có sự khác biệt đáng kể giữa tôm tiêm L-proline hoặc 1, 2-Di-(9Z-octadecenoyl)-snglycero-3-phosphocholine và tôm từ nhóm đối chứng (Hình 6). Kết quả cho thấy một số chất chuyển hóa khác biệt trong huyết thanh có thể là một trong những nguyên nhân gây ra quá trình chết rụng tế bào máu.

Hình 6. Tác dụng của việc tiêm các chất chuyển hóa khác nhau đối với quá trình apoptosis của tế bào máu ở tôm. Apoptosis được phát hiện bởi bộ dụng cụ apoptosis Annexin V-FITC/ PI và phân tích tế bào học dòng chảy. A cho thấy kết quả thử nghiệm của nhóm đối chứng. B cho thấy kết quả thử nghiệm được điều trị bằng triethanolamine. C cho thấy kết quả thử nghiệm được điều trị bằng oxypurinol. D cho thấy kết quả thử nghiệm được điều trị bằng 1, 2-Di- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine. E cho thấy kết quả thử nghiệm được điều trị bằng L-proline. F cho thấy kết quả phân tích thống kê; L, L-proline; D, 1, 2-Di- (9Z-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phosphocholine; T, triethanolamine; O, oxypurinol. Các thanh dọc đại diện cho giá trị trung bình ± S.E. (n 1/4 5). Các chữ cái, ”a”, ”b” và ”c” đại diện cho sự khác biệt đáng kể của tỷ lệ tế bào apoptotic trong các nhóm khác nhau ở P < 0,05.

3.5. Tải trọng vi khuẩn trong quá trình tan máu của tôm và nước biển ao nuôi dưới áp lực amoniac

Để biết liệu việc phơi nhiễm với amoniac có ảnh hưởng đến tải lượng vi khuẩn trong tôm và nước ao hay không, tải lượng vi khuẩn trong tôm và nước ao đã được phát hiện bằng cách nuôi vi khuẩn trên TCBS hoặc TSA. Tổng số TCBS trong nước biển từ ao cho nhóm thí nghiệm là khoảng 1,98 104 CFU/ mL, trong khi đó trong nhóm đối chứng là khoảng 2,33 103 CFU/ mL. Tổng số TSA trong nước biển từ ao của nhóm thí nghiệm là khoảng 3,15 104 CFU/ mL, trong khi đó trong nhóm đối chứng là 1,04 104 CFU/ mL. Tổng số TSA trong hemolymph của tôm thử nghiệm là 1,75 102 CFU/ mL, nhưng không có khuẩn lạc nào được TSA phát hiện trong quá trình tan máu của tôm từ nhóm đối chứng. Không có khuẩn lạc nào được phát hiện cả trong quá trình tan máu của tôm từ nhóm thí nghiệm và nhóm đối chứng TCBS (Hình 7).

Hình 7. Phát hiện vi khuẩn trong nước biển nuôi và hemolymph của tôm. A cho thấy kết quả thử nghiệm bằng muối mật thiosulfate citrate môi trường thạch sucrose (TCBS), các thanh dọc đại diện cho giá trị trung bình ± S.E. (n 1/4 5). B cho thấy kết quả thử nghiệm bằng môi trường thạch đậu nành tryptic (với 2,0% natri clorua, TSA), các thanh dọc đại diện cho giá trị trung bình ± S.E. (n 1/4 3). C, nhóm đối chứng; N, nhóm tiếp xúc với amoniac. Các dấu sao (*) cho thấy sự khác biệt đáng kể đối với mức độ biểu hiện gen giữa nhóm căng thẳng amoniac và nhóm đối chứng ở P < 0,05.

4. Thảo luận

Amoniac là một yếu tố căng thẳng môi trường quan trọng trong nuôi trồng thủy sản. Tế bào máu là tế bào miễn dịch quan trọng nhất trong động vật giáp xác (Vazquez và cộng sự, 2009). Chúng đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch như thực bào, đông máu, bao bọc, hình thành nốt sần, tạo melanine, sản xuất peptide kháng khuẩn (AMP), v.v., để chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh (Söderhäll, 2016; Tassanakajon và cộng sự, 2013). Nó đã được báo cáo rằng tổng số lượng tế bào máu có thể được giảm ở một số loài giáp xác dưới áp lực stress amoniac (Hong và cộng sự, 2007; Giang và cộng sự, 2004; Pinto và cộng sự, 2016; Rodríguez-Ramos và cộng sự, 2008; Verghese và cộng sự, 2007). Tuy nhiên, cơ chế mà amoniac gây ra sự suy giảm của tế bào máu không rõ ràng. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp dữ liệu quan trọng để làm rõ cơ chế ảnh hưởng của amoniac đến sức khỏe của tôm.

Phân tích bảng phiên mã trên tế bào máu của tôm cho thấy việc phơi nhiễm với amoniac dẫn đến giảm sự điều hòa của các gen liên quan đến ức chế quá trình chết rụng tế bào và tăng cường điều hòa các gen liên quan đến hoạt động quá trình chết rụng tế bào, điều này cho thấy rằng phơi nhiễm với amoniac làm tăng quá trình chết rụng tế bào máu. IAP, E3 ubiquitin-protein ligase XIAP và Baculoviral IAP lặp lại protein 2 (Birc2) cho thấy biểu hiện rõ ràng bị điều hòa xuống trong tế bào máu của tôm khi phơi nhiễm với amoniac. IEP, có chứa một khu vực được bảo tồn của miền lặp lại baculovirus IAP (BIR), là chất ức chế nội sinh cho quá trình apoptosis (Nagano và cộng sự, 2012; Salvesen và Duckett, 2002; Vaux và Silke, 2005). XIAP là một loại IAP, có thể liên kết trực tiếp với caspase-3, caspase-7 và caspase-9 để làm suy giảm chúng và do đó ức chế hoạt động của caspases (Morizane và cộng sự, 2005; Suzuki và cộng sự, 2001; Yang và cộng sự, 2000). Birc2 là một thành viên của họ gen chống apoptotic. Biểu hiện của Birc2 có thể được gây ra bởi stress mạng lưới nội chất để đóng một vai trò quan trọng trong việc thích ứng với stress tế bào (Hamanaka và cộng sự, 2009; Warnakulasuriyarachchi và cộng sự, 2004). Việc giảm quy định IAP, XIAP, Birc2 dưới amoniac có thể dẫn đến tăng quá trình apoptosis. Stress amoniac gây ra sự điều hòa MKNK và C/EBP trong tế bào máu của tôm. MKNK đã được báo cáo để giảm kích hoạt eIF4E (Lim và cộng sự, 2013), và các peptide liên kết với eIF4E có thể gây ra quá trình apoptosis nhanh chóng (Herbert và cộng sự, 2000). C/EBP là cần thiết cho quá trình apoptosis do Fas gây ra ở gan (Greenbaum và cộng sự, 2000). Do đó, biểu hiện được điều chỉnh của MKNK và C/ EBP cũng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình apoptosis. Việc phát hiện tỷ lệ tế bào máu apoptotic từ tôm khi phơi nhiễm với amoniac hỗ trợ thêm cho đề xuất rằng stress amoniac gây ra quá trình chết rụng tế bào máu và dẫn đến giảm tổng số lượng tế bào máu (THC). Hệ thống miễn dịch của tôm sẽ bị suy yếu nghiêm trọng.

Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng 7 DEG liên quan đến quá trình thực bào cho thấy các biểu hiện được điều chỉnh ở tôm từ nhóm phơi nhiễm với amoniac, điều này có thể tăng cường thực bào của tế bào máu. Thực bào là một phương pháp trung tâm và quan trọng để loại bỏ vi sinh vật hoặc các chất lạ (Bachere và cộng sự, 1995). Kiểm tra thêm số lượng vi khuẩn trong nước biển từ ao của nhóm phơi nhiễm với amoniac và trong quá trình tan máu của tôm phơi nhiễm với amoniac, chúng tôi nhận thấy rằng số lượng vi khuẩn trong cả nước biển và hemolymph của tôm cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng. Dữ liệu này có thể giải thích tại sao các DEG liên quan đến thực bào trong bộ phiên mã cho thấy các biểu hiện được điều chỉnh ở tôm khi phơi nhiễm với amoniac. Ngoài ra, 7 gen liên quan đến tổng hợp axit béo, tổng hợp phospholipid và các quá trình khác liên quan đến chu kỳ tế bào và gen chuyển hóa lipid cho thấy sự điều hòa ở tôm từ nhóm phơi nhiễm với amoniac. Sự điều hòa của các gen này có thể hữu ích cho quá trình nhân đôi mầm bệnh ở tôm. Nghiên cứu trước đây cho thấy yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 1 (LvVEGF1) đóng một vai trò quan trọng trong nhiễm WSSV, và thúc đẩy sự nhân lên của WSSV (Wang và cộng sự, 2015). Protein phản ứng tăng trưởng sớm-1 có thể được gây ra bởi nhiễm vi-rút JC và liên kết và điều chỉnh chất kích thích vi-rút JC (Romagnoli và cộng sự, 2008). Do đó, mầm bệnh gia tăng trong tế bào máu có thể liên quan đến việc tăng tổng hợp thành phần tế bào. Những dữ liệu này có thể giải thích tại sao stress amoniac làm tăng tính nhạy cảm của tôm đối với mầm bệnh (Fang và cộng sự, 2017; Ge và cộng sự, 2014; Liu và Chen, 2004).

Kết quả phân tích các chất chuyển hóa huyết thanh (dựa trên LC-MS) cho thấy hàm lượng khác nhau của các chất chuyển hóa huyết thanh do phơi nhiễm với amoniac bao gồm axit amin, thành phần nucleotide và lipid. Trong số 10 axit amin trong các chất chuyển hóa vi phân huyết thanh, 9 trong số chúng được điều chỉnh xuống dưới áp lực amoniac. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng nồng độ amoniac tan máu có thể đạt tối đa trong L. vannamei phơi nhiễm với 20 mg/ L ammonia-N sau 24 giờ, và sau đó duy trì ở mức cao hơn trên 0,6 mmol/ mL, cao hơn đáng kể so với mức được phát hiện trong nhóm đối chứng với giá trị nhỏ hơn 0,3 mmol/ mL (Si và cộng sự,  2019). Nó đã được báo cáo rằng nồng độ amoniac cao cho thấy độc tính nhất định đối với động vật giáp xác (Lin và Chen, 2001; Romano và Zeng, 2013). Chúng tôi suy đoán rằng nồng độ amoniac tan máu cao có thể dẫn đến gián đoạn quá trình hấp thụ và trao đổi chất axit amin. Điều này sẽ dẫn đến việc không đủ nguyên liệu thô cho sự phát triển cơ thịt, và cuối cùng ảnh hưởng đến sự phát triển của tôm. Ngoài ra, stress amoniac có thể gây ra quá trình chết rụng trong các tế bào gan tụy (Liang và cộng sự, 2016). Quá trình apoptosis của các tế bào gan tụy gây ra rối loạn chuyển hóa nucleotide (Xiao và cộng sự, 2019). Đây có thể là nguyên nhân cho sự bất thường của các thành phần nucleotide trong huyết thanh, sẽ có tác dụng phụ đối với tế bào máu. Uracil, xanthine, taurine, Lanserine và guanosine đóng vai trò khác nhau trong quá trình apoptosis. Nó đã được báo cáo rằng sự tích tụ uracil và xanthine có thể gây ra quá trình apoptosis (Paone và cộng sự, 2014; Sola và cộng sự, 2004). Taurine đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch như một chất chống oxy hóa để bảo vệ các tế bào khỏi stress oxy hóa (Schaffer và cộng sự, 2009). Sự tích tụ của taurine, L-anserine và guanosine có thể ức chế quá trình chết rụng (Jiang và cộng sự, 2007; Takatani và cộng sự, 2004; Tan và Candlish, 1998). Do đó, sự hiện diện của nồng độ uracil và xanthine cao, và mức độ thấp của taurine, L-anserine, guanosine và guanine trong huyết thanh của tôm khi phơi nhiễm với amoniac có thể thúc đẩy quá trình apoptosis. Giả thuyết này đã được xác nhận thêm thông qua việc phát hiện tỷ lệ tế bào apoptosis trong tế bào máu của tôm khi phơi nhiễm với amoniac. Glycerophosphocholine (GPC) có thể trải qua quá trình oxy hóa dẫn đến sự hình thành các GPCs bị oxy hóa (Ox-GPCs). Ox-GPCs có thể hoạt động như chất chủ vận mạnh cho thụ thể PAF (PAF-R) để tạo ra phối tử Ox-GPC PAF-R (Konger và cộng sự, 2008) có thể gây ức chế miễn dịch toàn thân (Sahu và cộng sự, 2012; Walterscheid và cộng sự, 2002). Đồng thời, người ta cũng phát hiện ra rằng việc tiêm hai chất chuyển hóa được điều chỉnh tăng triethanolamine và oxypurinol ở tôm bình thường cũng có thể gây ra quá trình chết rụng ở tôm bình thường. Những bằng chứng này cho thấy rằng những thay đổi của các chất chuyển hóa huyết thanh dưới áp lực amoniac có thể là một yếu tố quan trọng gây ra quá trình chết rụng của tế bào máu. Nó sẽ ảnh hưởng đến tình trạng sức khỏe của tôm, dẫn đến tăng trưởng chậm và khả năng miễn dịch kém (Chen và Lin, 1992; Wickins, 1976). Tình trạng sức khỏe kém của tôm có thể gây ra sự suy giảm lượng thức ăn, dẫn đến nhiều thức ăn dư thừa trong nước, điều này sẽ làm tăng hàm lượng dinh dưỡng trong nước nuôi trồng thủy sản và dẫn đến sự lan truyền cao của vi khuẩn. Đây có thể là cơ chế gây ra sự gia tăng vi khuẩn trong nước biển ao. Đồng thời, sự suy giảm khả năng miễn dịch của tôm và quá trình chết rụng của một số lượng lớn tế bào máu dẫn đến giảm khả năng của tế bào máu để loại bỏ vi khuẩn in vivo, dẫn đến số lượng vi khuẩn cao trong tan máu, cuối cùng dẫn đến tôm dễ bị nhiễm bệnh hơn và tỷ lệ mắc bệnh cao hơn.

5. Kết luận

Tóm lại, stress amoniac dẫn đến rối loạn chuyển hóa axit amin và nucleotide, có thể là do quá trình chết rụng do amoniac và suy giảm chức năng của gan tụy. Nồng độ axit amin giảm trong huyết thanh đã ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của cơ bắp và cuối cùng làm tôm tăng trưởng chậm. Nồng độ amoniac hemolymph cao và mức độ bất thường của các chất chuyển hóa có thể gây ra quá trình chết rụng tế bào máu, làm giảm số lượng tế bào máu và cuối cùng làm giảm khả năng miễn dịch của tôm. Ngoài ra, nồng độ amoniac quá mức trong nước nuôi trồng thủy sản thường đi kèm với sự gia tăng của vi sinh vật. Những yếu tố này cuối cùng đã dẫn đến việc tôm dễ bị nhiễm bệnh.

Theo Fei Liu, Shihao Li, Yang Yu, Mingzhe Sun, Jianhai Xiang, Fuhua Li

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0045653519319964

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *