Phần 2: Aeromonas hydrophila, Tác Nhân Gây Bệnh Trên Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus vannamei Nuôi Nước Ngọt

3. Kết quả

3.1. Xác nhận tác nhân gây bệnh

Không tìm thấy ký sinh trùng nào trong tôm thẻ chân trắng bị bệnh. Tất cả tôm thử nghiệm được cảm nhiễm với dịch lọc nội tạng không có vi khuẩn đều sống sót mà không có thay đổi rõ ràng nào (dữ liệu không được hiển thị). Điều này cho thấy bệnh không phải do ký sinh trùng hoặc vi rút gây ra. 5 chủng chiếm ưu thế (được đánh số từ WS01 đến WS05) đã được thu từ gan tụy của tôm bị bệnh, được xác định là thành viên của chi Bacillus và Aeromonas dựa trên phân tích gen 16S rRNA (GenBank gia nhập số MN367958, MN371228, MN367959, MN367960, MN148709) (Hình S1 và Hình 1), và không có gen nào được phân lập từ cơ. Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn ở tôm chỉ ra rằng chỉ có chủng phân lập (WS05) gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng, cho thấy giá trị LD₅₀ là 4,8 × 10⁴ CFU/ mL (Hình 2). Ngược lại, không có thay đổi rõ ràng hoặc tôm chết ở đối chứng. Tôm nhiễm bệnh nhân tạo có dấu hiệu teo gan tụy tương tự như tôm nhiễm bệnh tự nhiên (Hình 3), và cùng một chủng (WS05) đã được phân lập lại từ tôm bị bệnh thực nghiệm và được xác nhận bằng nhận dạng kiểu hình và phân tử. Hơn nữa, những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy từ tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên và tôm bị nhiễm bệnh nhân tạo cho thấy sự sắp xếp rối loạn của các ống gan tụy và sự xâm nhập của tế bào viêm (Hình 4). Ngoài ra, một phân tích bằng kính hiển vi điện tử còn cho thấy tế bào gan tụy bị tổn thương ở cả tôm bị nhiễm bệnh tự nhiên và tôm bị nhiễm bệnh nhân tạo, bao gồm sự hình thành bất thường của myelin trong ty thể và giãn nở mạng lưới nội chất (Hình 5). Những phát hiện này đã chứng minh rằng phân lập WS05 là tác nhân gây bệnh này.

Hình 1. Cây phát sinh gen 16S rRNA của 40 loại vi khuẩn đã biết và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp cây ghép hàng xóm (neighbor-joining). Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 1430 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Hình 2. Độc lực của WS05 phân lập ở mật độ tế bào cuối cùng là 2,0 × 10³ đến 2,0 × 10⁷ CFU/ mL đối với tôm thẻ chân trắng thử nghiệm. Ctrl, Nhóm đối chứng; T1, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 10⁷ CFU/ mL; T2, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 10⁶ CFU/ mL; T3, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 10⁵ CFU/ mL; T4, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 10⁴ CFU/ mL; T5, Xử lý bằng WS05 phân lập ở 2,0 × 10³ CFU/ mL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

Hình 3. Dấu hiệu chung của tôm bị ảnh hưởng trong vùng bùng phát dịch bệnh. (a) Tôm bệnh. Mũi tên cho thấy gan tụy bị teo; (b) tôm khỏe mạnh. Mũi tên cho thấy gan tụy bình thường.

Hình 4. Những thay đổi mô bệnh học ở gan tụy bị teo của tôm bị ảnh hưởng. (a) Rối loạn sắp xếp các ống gan tụy (mũi tên đỏ) và thâm nhiễm tế bào viêm (mũi tên đen) trong gan tụy bị nhiễm bệnh tự nhiên; (b) rối loạn sắp xếp các ống gan tụy (mũi tên đỏ) và thâm nhiễm tế bào viêm (mũi tên đen) trong gan tụy bị nhiễm trùng nhân tạo; (c) sự sắp xếp bình thường của ống gan tụy (mũi tên đỏ) ở gan tụy khỏe mạnh.

Hình 5. Những thay đổi siêu cấu trúc trong gan tụy bị teo của tôm bị ảnh hưởng. (a) Sự hình thành  myelin của ty thể (mũi tên đỏ) và giãn mạng lưới nội chất (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm bệnh tự nhiên (5000×); (b) thể myelin của ty thể (mũi tên đỏ), đang hình thành và mạng lưới nội chất giãn nở (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm nhân tạo (5000×); (c) ty thể bình thường (mũi tên đỏ) và mạng lưới nội chất (mũi tên trắng) trong tế bào chất của tế bào khỏe mạnh (5000×).

3.2. Xác định chủng gây bệnh

Chủng WS05 được xác định về mặt kiểu hình và phân tử là A. hydrophila. Nó thể hiện các đặc điểm kiểu hình giống với các chủng tham chiếu của A. hydrophila. Chủng WS05 dương tính với việc sử dụng arginine, lysine, citrate và tryptophan và âm tính với sự phát triển của amygdalin, inositol, melibiose, rhamnose và sorbitol (Bảng 1). Hơn nữa, các trình tự gen 16S rRNA, gyrB, rpoB của chủng WS05 phân lập (số gia nhập GenBank MN148709, MN394631, MN394672 ) tương ứng cho thấy sự tương đồng 99% với các chủng A. hydrophila đã biết trong cơ sở dữ liệu của GenBank. Cây phát sinh gen được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining đã chứng minh chủng WS05 là một chủng A. hydrophila (Hình 1, Hình 6 và Hình 7), phù hợp với việc xác định kiểu hình của chủng WS05 (Bảng 1).

Hình 6. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen gyrB của 39 chủng Aeromonas và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining. Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 765 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Hình 7. Cây phát sinh gen dựa trên trình tự gen rpoB của 32 chủng Aeromonas và phân lập WS05 được xây dựng bằng phương pháp neighbor-joining. Độ dài của các chuỗi được căn chỉnh là 423 bp. Các giá trị bootstrap (%) được hiển thị bên cạnh các nhánh, các số gia nhập được chỉ định bên cạnh tên của các chủng và các thanh tỷ lệ biểu thị các giá trị khoảng cách.

Bảng 1. Đặc điểm kiểu hình của phân lập WS05

3.3. Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng gây bệnh

Dữ liệu (Bảng S1) chỉ ra rằng chủng WS05 nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh thú y ngoại trừ novobiocin và rifampicin, bao gồm amoxicillin, cotrimoxazole, cefotaxime, doxycycline, enrofloxacin, florfenicol, gentamicin, kanamycin, axit nalidixic, neomycin, netilmicin, oxacillin, polymyxin B, streptomycin, tetracycline và tobramycin. Đặc biệt, chủng WS05 rõ ràng đã biểu hiện tính nhạy cảm với cotrimoxazole, doxycycline, florfenicol, neomycin và tetracycline, hiện đang được phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản.

3.4. Tác dụng hiệp đồng của chiết xuất thảo mộc Florfenicol

MIC của florfenicol và chiết xuất thảo mộc đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập được trình bày trong Bảng 2. Kết quả chỉ ra rằng chỉ có sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum mới có tác dụng kháng khuẩn tổng hợp đối với chủng WS05. Khi kết hợp với 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum, MIC của florfenicol chống lại chủng WS05 đã giảm từ 0,50 xuống 0,03 mg/ L. FICI cho sự kết hợp của chiết xuất florfenicol và P. granatum được tính là 0,31. Tuy nhiên, florfenicol thể hiện tác dụng phụ đối với chủng WS05 khi được kết hợp với các chất chiết xuất từ ​​A. argyi, A. capillaries, Galla chinensis, P. mume, Radix aucklandiae và Radix sophorae flavescentis. Tác dụng chung của florfenicol với chiết xuất từ ​​các loại thảo mộc khác (C. segetum, F. toosendan, P. aviculare, Polygonum cuspidatum, Radix et rhizoma rhei, Radix scutellariae, Radix sanguisorbae, Radix bupleuri, Rhizoma acori tatarinowii) cho thấy không có tương tác. Điều này cho thấy chiết xuất P. granatum có thể được coi là một chất hiệp đồng tiềm năng của florfenicol chống lại chủng WS05.

Bảng 2. MIC của florfenicol và chiết xuất thảo mộc đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập.

3.5. Thử nghiệm in vitro chiết xuất Florfenicol – granatum

Đường cong  chết phụ thuộc vào thời gian với chiết xuất florfenicol và P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp được trình bày trong Hình 8. Không quan sát thấy mật độ tế bào của chủng WS05 phân lập giảm trong nhóm đối chứng và việc xử lý đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum chỉ cho thấy hoạt tính kháng khuẩn nhẹ so với đối chứng. Ngược lại, sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng kể chống lại chủng WS05, với mật độ tế bào giảm đáng kể ≥ 3,61 log sau 24 giờ điều trị so với điều trị bằng kháng sinh đơn lẻ (p < 0,05). Theo các tiêu chí được đề xuất bởi Pillai và cộng sự (2005) hiệp lực đó được định nghĩa là mức giảm tương ứng ≥ 2 log CFU/ mL về hoạt tính kháng khuẩn được tạo ra bởi sự kết hợp so với hoạt tính của tác nhân hoạt động mạnh hơn sau 24 giờ, hoạt tính kháng khuẩn trong ống nghiệm của sự kết hợp giữa florfenicol và chiết xuất P. granatum có thể được phân loại là tác dụng hiệp đồng, phù hợp với những phát hiện trong nghiên cứu nghiệm tác dụng hiệp đồng ở trên.

Hình 8. Đường cong chết phụ thuộc vào thời gian với 0,03 mg/ L florfenicol và 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại WS05 phân lập.

3.6. Tác dụng bảo vệ của chiết xuất Florfenicol – granatum

Tác dụng bảo vệ của chiết xuất florfenicol và P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp được thể hiện trong Hình 9. Không quan sát thấy tỷ lệ chết ở tôm chân trắng thử nghiệm trong nhóm trống và nhóm đối chứng dương tính (dữ liệu không được hiển thị) và phương pháp xử lý đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum chỉ cho thấy tác dụng bảo vệ nhẹ so với đối chứng âm tính, chỉ với 13,34 % và giảm 16,67% tỷ lệ chết tích lũy của tôm so với đối chứng âm. Tuy nhiên, sự bảo vệ đáng kể đã được tạo ra bởi sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum, với tỷ lệ chết tích lũy là 36,66% (p <0,05) và 33,33% (p <0,05) thấp hơn so với điều trị đơn lẻ bằng florfenicol và chiết xuất P. granatum sau cảm nhiễm với WS05 cách ly trong 7 ngày. Tất cả tôm thử nghiệm chết là do các chủng cảm nhiễm gây ra, được xác định bằng cách phân lập và xác định vi khuẩn (dữ liệu không được hiển thị). Những phát hiện này chỉ ra rằng sự kết hợp giữa chiết xuất florfenicol và P. granatum có thể tăng cường tác dụng bảo vệ chống nhiễm trùng A. hydrophila ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt.

Hình 9. Bảo vệ 0,03 mg/ L florfenicol và 7,81 mg/ mL chiết xuất P. granatum đơn lẻ hoặc kết hợp chống lại thách thức phân lập WS05 ở tôm thẻ chân trắng. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD.

4. Thảo luận

Tác động của A. hydrophila trong nuôi trồng thủy sản đã được ghi nhận rõ ràng, với tỷ lệ chết hàng loạt được báo cáo ở tôm tiên Branchipus schaefferi (Fisher), tôm càng xanh Pacifastacus leniusculus, cá rô đồng Anabas testudineus, cá trắm cỏ Ctenopharynngodon idellus, cá chép bạc Hypophthalmichthys molitrix, cá da trơn phương nam Silurus meridionalis, cá tráp trắng Parabramis pekinensis, và cá tuyết Murray Maccullochella peelii. Tuy nhiên, có rất ít thông tin về nhiễm A. hydrophila ở tôm thẻ chân trắng nuôi nước ngọt. Do đó, cần chú ý nhiều hơn đến mầm bệnh tôm thẻ chân trắng A. hydrophila.

Nhiều yếu tố độc lực đã được chứng minh là đóng vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của A. hydrophila, bao gồm Flagella, elastase, haemolysin, enterotoxin và aerolysin. Các bệnh do A. hydrophila gây ra trong nuôi trồng thủy sản thường liên quan đến việc sản xuất các yếu tố độc hại này. Nói chung, các vi khuẩn phân lập được trong nuôi trồng thủy sản được phân loại là độc lực, độc lực yếu hoặc độc lực dựa trên liều lượng và thời gian sống sót sau cảm nhiễm. Độc lực Vibrio parahaemolyticus chủng VP1 được phân lập từ tôm He bị nhiễm vibrio ở Ấn Độ đã được báo cáo là làm chết 35% tôm sau 7 ngày cảm nhiễm bằng cách ngâm ở nồng độ cuối cùng là 2,1 × 10⁴ đến 1,3 × 10⁵ CFU/ mL. Dữ liệu chỉ ra rằng phân lập WS05 của A. hydrophila có thể gây ra tỷ lệ chết trung bình từ 40% đến 55% ở tôm khỏe mạnh sau 7 ngày cảm nhiễm ở 2,0 × 10⁴ đến 2,0 × 10⁵ CFU/ mL, với giá trị LD₅₀ của 4,8 × 10⁴ CFU/ mL. Điều này cho thấy A. hydrophila chủng WS05 độc hơn V. Parahaemolyticus VP1 và có thể gây ra mối đe dọa nghiêm trọng hơn đối với nghề nuôi tôm He. Ngoài độc lực của A. hydrophila phân lập WS05, có thể có các yếu tố thứ cấp khác gây ra bệnh này, cũng cần được nêu lên như những mối lo ngại, chẳng hạn như amoniac và sulfua, có thể làm tăng tính nhạy cảm của tôm chân trắng đối với nhiễm trùng do vi khuẩn do suy giảm khả năng miễn dịch.

Trong nhiều trường hợp, A. hydrophila có nhiều trong hệ động vật nước và thường kết hợp với giáp xác chân chèo, chúng có thể tiếp tục vận chuyển vi khuẩn này đến các vùng nuôi khác để dẫn đến bệnh aeromonasis. Do đó, A. hydrophila chủng WS05 có thể gây nguy hiểm cho nhiều động vật thủy sinh nhạy cảm với Aeromonas và không nên đánh giá thấp việc kiểm soát phân lập này. Một số nghiên cứu đã báo cáo rằng hơn 300 chủng A. hydrophila từ động vật thủy sinh đã thể hiện khả năng kháng rifampicin và novobiocin tương đối cao. Điều này cũng được quan sát thấy ở A. Hydrophila chủng WS05. Ngoài ra, dữ liệu chỉ ra rằng A. Hydrophila chủng WS05 nhạy cảm với cotrimoxazole, doxycycline, florfenicol, neomycin và tetracycline, có thể được sử dụng để điều trị bệnh này. Tuy nhiên, một trong những vấn đề quan trọng nhất liên quan đến việc điều trị bằng kháng sinh chống lại A. hydrophila trong nuôi trồng thủy sản là khả năng kháng kháng sinh dễ dàng phát triển. Do đó, cần có các kỹ thuật mới để ngăn chặn sự phát triển kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh để làm cho ngành nuôi trồng thủy sản bền vững hơn.

Hiện nay, một phương pháp hiệu quả để vượt qua sự kháng thuốc của mầm bệnh vi khuẩn là sự kết hợp của chiết xuất thảo mộc với thuốc kháng sinh. Lee và cộng sự (1998) đã phát hiện ra rằng sự kết hợp của chloramphenicol và chiết xuất từ ​​một số loại thảo mộc, chẳng hạn như Acanthopanax koreanum, Artemisia iwayomogi, Clerodendron trichotomum, Juniperus Rigida, Magnolia sieboldii, Pinus densiflora, Pinus koraiensis và Zanthoxylum piperitum có tác dụng ức chế kháng thuốc đối với Staphylococcus aureus; Liu và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng baicalin được phân lập từ Scutellaria amoena có khả năng khôi phục hiệu quả của kháng sinh beta-lactam chống lại Staphylococcus aureus kháng ß-lactam và có thể tăng khả năng tiêu diệt các tế bào S. aureus kháng ß-lactam; và Haroun và Al-Kayali (2006) xác nhận rằng chiết xuất Thymbra spicata có thể làm tăng đáng kể tác dụng kháng khuẩn của cefotaxime đối với các chủng đa kháng thuốc S. aureus và Klebsiella pneumoniae. Trong nghiên cứu này, chiết xuất P. granatum đã tăng cường tác dụng kháng khuẩn của florfenicol, cho thấy khả năng sử dụng chiết xuất thảo mộc này kết hợp với florfenicol để chống lại A. hydrophila gây bệnh vì phần lớn các chủng A. hydrophila nhạy cảm với kháng sinh phenicol, như florfenicol. Những phát hiện tương tự cũng được thực hiện bởi Endo và cộng sự (2010), trong đó sự kết hợp giữa chiết xuất P. granatum và fluconazole có tác dụng hiệp đồng chống lại mầm bệnh nấm. Bên cạnh hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính hiệp đồng của chiết xuất P. granatum có thể là do khả năng của thành phần hoạt tính của nó, như punicalagin, axit gallic và axit chlorogenic, làm xáo trộn thành tế bào và khử cực màng tế bào chất, sau đó tạo điều kiện cho dòng florfenicol bên trong tế bào vi khuẩn xâm nhập mạnh mẽ để ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn.

Tóm lại, nghiên cứu này lần đầu tiên xác định A. hydrophila là tác nhân gây bệnh cho tôm thẻ chân trắng và chỉ ra rằng chiết xuất P. granatum làm tăng tác dụng kháng khuẩn của florfenicol, gợi ý khả năng sử dụng loại thảo mộc này kết hợp với florfenicol để chống lại tôm gây bệnh A. hydrophila.

Theo Huihua Zhou, Chunlei Gai, Guifang Ye, Jian An, Kai Liu, La Xu, Haipeng Cao

Nguồn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6843590/

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

• Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột Của Tôm Thẻ Chân Trắng, Litopenaeus vannamei, Được Cho Ăn Khẩu Phần Ăn Có Chứa Bột Đậu Nành Lên Men Chứa Bacillus subtilis E20 (FSBM) Hoặc Một Peptide Kháng Khuẩn Có Nguồn Gốc Từ B. subtilis E20 FSBM
• Cải Thiện Sức Khỏe Và Khả Năng Kháng Nấm Fusarium Của Tôm Thẻ Chân Trắng Thông Qua Việc Thức Ăn Bổ Sung
• Ảnh Hưởng Của Probiotics Đến Sự Phân Hủy Amoniac Trong Nghiên Cứu In Vitro Và Trong Ao Nuôi Tôm Thẻ Chân Trắng