Hiệu Quả Và Sự Thay Đổi Mật Độ Vi Khuẩn Trong Ruột Tôm Thẻ Litopenaeus vannamei Được Nuôi Trong Hệ Thống Biofloc Và Hệ Thống Nước Sạch Có Bổ Sung Hỗn Hợp Probiotics Thương Mại

TÓM TẮT

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá khả năng xâm chiếm của hỗn hợp probiotics thương mại trong ruột của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được nuôi trong hệ thống Biofloc và hệ thống nước sạch, đồng thời xác minh tác động của việc bổ sung probiotics đối với sự phong phú của vi khuẩn Vibrio sp. và Bacillus sp. trong đường ruột của tôm thẻ chân trắng được nuôi trong hệ thống Biofloc hoặc hệ thống nước sạch. Thử nghiệm kéo dài 45 ngày, gồm 4 nghiệm thức: Hệ thống Biofloc không bổ sung Probiotics (BFT); Hệ thống Biofloc có bổ sung Probiotics (BFT+P); Hệ thống nước sạch không bổ sung Probiotics (CW); và Hệ thống nước sạch có bổ sung Probiotics (CW+P). Hỗn hợp probiotics thương mại (Sanolife PRO-W®-INVE Aquaculture) bao gồm các chủng Bacillus subtilis phức hợp và Bacillus licheniformes và được thêm vào nước sau mỗi 48 giờ. Sự phong phú của vi khuẩn trong ruột tôm được đánh giá bằng phương pháp Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), trong đó các đầu dò oligonucleotide nhắm mục tiêu rRNA được sử dụng để xác định Bacillus sp. và Vibrio sp. Tổng lượng vi khuẩn phong phú cao hơn trong các nghiệm thức có bổ sung probiotics (BFT+P và CW+P). Tuy nhiên, sự phong phú của vi khuẩn Bacillus sp. trong hệ thống nước sạch cao hơn so với hệ thống BFT khi hỗn hợp probiotics được thêm vào. Tỷ lệ Vibrio sp. cao hơn ở các nghiệm thức không bổ sung probiotics. Việc sử dụng Sanolife PRO-W® giúp giảm lượng vi khuẩn Vibrio sp. trong cả hệ thống BFT và nước sạch, đồng thời làm tăng tỷ lệ vi khuẩn Bacillus. Các kết quả thu được trong nghiên cứu này có thể góp phần vào sự hiểu biết của chúng ta về hệ sinh thái vi sinh vật của Biofloc, hiện được coi là vấn đề quan trọng trong hệ thống nuôi này.

1. GIỚI THIỆU

Việc sử dụng probiotics đã được khám phá rộng rãi trong thực hành nuôi trồng thủy sản. Do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để điều tra tác động của probiotics nhằm tìm ra các chất thay thế không chứa kháng sinh và thân thiện với môi trường, với mục đích thúc đẩy sự phát triển lành mạnh mẽ của ngành nuôi trồng thủy sản (Sha và cộng sự, 2016).

Probiotics được định nghĩa là các vi sinh vật sống mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ khi được sử dụng ở mức độ thích hợp (Moriarty, 1998). Những vi sinh vật này có thể xâm chiếm đường ruột và nhân lên, thúc đẩy sự điều chỉnh hiệu quả của các hệ thống sinh học khác nhau của vật chủ sống trong môi trường nước (Gatesoupe, 1999; Mohapatra và cộng sự, 2013). Chúng có thể được bổ sung thông qua nước hoặc dưới dạng phụ gia thức ăn (Kumar và cộng sự, 2016; Moriarty 1998; Skjermo và Vadstein, 1999) với một loại probiotics hoặc kết hợp nhiều loại probiotics trong hỗn hợp (Villaseñor và cộng sự, 2013).

Có nhiều loài vi khuẩn khác nhau được sử dụng làm probiotics trong nuôi tôm He, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Bacillus (Ninawe và Selvin, 2009; Sapcharoen và Rengpipat, 2013). Khả năng hình thành bào tử, cung cấp khả năng bảo vệ chống lại axit, muối mật và các điều kiện môi trường khác, làm cho probiotics Bacillus trở nên hiệu quả. Ngoài ra, các loài thuộc chi này có khả năng sản xuất cao các hợp chất có tầm quan trọng về mặt công nghệ sinh học như kháng sinh, enzyme, axit amin và vitamin. Chúng còn có khả năng phân hủy cholesterol, ảnh hưởng đến tình trạng miễn dịch của vật chủ và có hoạt tính kháng virus (Sorokulova, 2013).

Các loài Bacillus đã được sử dụng như một chất bổ sung trong chế độ ăn ở người và động vật trong nhiều năm. Probiotics Bacillus giúp tỷ lệ tăng trưởng và tỷ lệ sống cao hơn (Balcazar và cộng sự, 2007; Chu và cộng sự, 2009; Nimrat và cộng sự, 2012; Krummenauer và cộng sự, 2014a; Zokaeifar và cộng sự, 2014), cải thiện hoạt động của các enzyme tiêu hóa (Wang, 2007; Zhou và cộng sự, 2009), tăng cường phản ứng miễn dịch và tăng khả năng kháng bệnh đối với các loài Vibrio gây bệnh (Gullian và cộng sự, 2004; Navin Chandran và cộng sự, 2014; Sha và cộng sự, 2016) trong nuôi tôm.

Vibrio spp. xuất hiện tự nhiên ở môi trường biển và cửa sông. Chúng cũng có thể là một phần của quần thể vi khuẩn đường ruột của tôm thẻ chân trắng L. vannamei và một số loài thậm chí còn là vi khuẩn có lợi (Verschuere và cộng sự, 2000; Lakshmi và cộng sự, 2013; Liu và cộng sự, 2015; Huang và cộng sự, 2016). Tuy nhiên, hầu hết các loài đều được coi là vi khuẩn cơ hội và là mầm bệnh tiềm ẩn gây bùng phát bệnh vibriosis và gây thiệt hại lớn về sản lượng (Saulnier và cộng sự, 2000).

Đường ruột được xem là cơ quan chính để lây truyền mầm bệnh (De Schryver và Vadstein, 2014). Trong bối cảnh này, lợi khuẩn cạnh tranh với vi khuẩn gây bệnh tiềm tàng về vị trí bám dính, chất dinh dưỡng và hợp chất hóa học trong nước và trong ruột của vật chủ (Gatesoupe, 1999; Mohapatra và cộng sự, 2013; Hamza và cộng sự, 2015). Do đó, lợi khuẩn có thể bám vào biểu mô niêm mạc của đường tiêu hóa và giúp chống lại mầm bệnh bằng cách giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh trong vật chủ (Villaseñor và cộng sự, 2011; Akhter và cộng sự, 2015; Lazado và cộng sự, 2015). Điều quan trọng là phải theo dõi hệ vi sinh vật trong quá trình bổ sung lợi khuẩn để xác định hiệu quả của việc xâm chiếm đường ruột và những thay đổi xảy ra trong quần thể vi khuẩn do sử dụng lợi khuẩn (Merrifield và cộng sự, 2010; Verscheure và cộng sự, 2000).

Tác dụng tích cực của Bacillus đối với tôm thẻ L. vannamei đã được nhận thấy thông qua việc quan sát các hoạt động đối kháng, điều chỉnh hệ vi sinh vật, giảm số lượng vi khuẩn có hại và tăng sức đề kháng chống lại Vibrio trong hệ thống nước sạch thông thường (Li và cộng sự, 2009; Nimrat và cộng sự, 2011; Zokaeifar và cộng sự, 2014; Sha và cộng sự, 2016) và trong các hệ thống Biofloc (Aguilera-Rivera và cộng sự, 2014; Ferreira và cộng sự, 2015).

Công nghệ Biofloc (BFT) dựa trên việc thiết lập một quần thể vi sinh vật chịu trách nhiệm duy trì chất lượng nước, cải thiện tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của vật chủ (McIntosh và cộng sự, 2001; Wasielesky và cộng sự, 2006; Avnimelech, 2007). Ngoài ra, quần thể vi sinh vật này có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh loại trừ thức ăn và không gian trong nước hoặc trong ruột (Crab và cộng sự, 2010). Hu và cộng sự (2016) đã xác định rằng việc sử dụng kết hợp Bacillus và mật đường làm nguồn carbon đã làm tăng tính đa dạng của quần thể vi sinh vật. Ngoài ra, phương pháp xử lý này còn ức chế vi khuẩn gây bệnh một cách hiệu quả và thúc đẩy sự hình thành và phát triển cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợi trong nước giàu biofloc.

Sự tương tác giữa quần thể vi sinh vật có trong nước giàu biofloc cũng như những tác động liên quan của việc bổ sung vi khuẩn probiotics từ bên ngoài như một sản phẩm thương mại vẫn chưa rõ ràng, đồng thời cũng chưa rõ sự điều chỉnh của quần thể vi sinh vật về sự hiện diện, số lượng vi khuẩn và thành phần dưới những điều kiện này. Kiến thức về những tương tác như vậy rất quan trọng để thiết lập các chiến lược kiểm soát dịch bệnh, chất lượng nước và quản lý quần thể vi sinh vật trong hệ thống nuôi biofloc.

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là so sánh hiệu quả xâm chiếm của hỗn hợp vi sinh có lợi thương mại trong ruột của tôm thẻ L. vannamei được nuôi trong hệ thống Biofloc và hệ thống nước sạch, đồng thời xác minh tác động của hỗn hợp vi khuẩn Bacillus đối với sự phong phú của vi khuẩn Vibrio gây bệnh giả định trong Hệ thống Biofloc.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Nguồn giống

Hậu ấu trùng tôm thẻ chân trắng L. vannamei được thu thập từ trại giống thương mại Aquatec Ltda (Canguaretama, Rio Grande do Norte, Brazil) và được chuyển đến khu vực sản xuất giống của Trạm Nuôi trồng Thủy sản Biển, Viện Hải dương học, Đại học Liên bang Rio Grande. Trong phòng thí nghiệm, tôm được nuôi cho đến khi đạt trọng lượng trung bình là 0,6±0,02g trước khi thả tôm vào các đơn vị thí nghiệm.

2.2 Hỗn hợp vi sinh có lợi

Hỗn hợp probiotics thương mại (Sanolife – PRO-W® – INVE Aquaculture) được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm các chủng Bacillus subtilis phức hợp và Bacillus licheniformis, ở nồng độ vi khuẩn là 5×10¹⁰ CFU/g. Sản phẩm được thêm vào nước nuôi 48 giờ một lần, với nồng độ 0,5 ppm hoặc 0,5 mg/L và được kích hoạt theo khuyến nghị của nhà sản xuất.

2.3. Thiết kế thử nghiệm

Thử nghiệm được thực hiện trong 12 bể polyetylen hình chữ nhật có diện tích đáy 0,20 m² và thể tích hiệu dụng là 50L. Tôm (0,64±0,02g) được vận chuyển và thả nuôi với mật độ 150 con/m² (30 con/bể). Thử nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần: Hệ thống Biofloc không bổ sung Probiotics (BFT); Hệ thống Biofloc có bổ sung Probiotics (BFT+P); Hệ thống nước sạch không bổ sung Probiotics (CW); và Hệ thống nước sạch có bổ sung Probiotics (CW+P).

Các thiết bị thử nghiệm biofloc được đổ đầy 5L nước giàu biofloc (10% nước tái sử dụng) thu được từ một nghiên cứu nuôi tôm thẻ L. vannamei trong 9 bể 35m³, cộng với 45L nước biển tự nhiên đã lọc (lọc cát) được xử lý bằng dung dịch clo (10 ppm được đo ngay sau khi khử trùng bằng clo) và khử clo bằng bột axit ascorbic (1 ppm). Đối với hệ thống nước sạch, các bể chứa đầy 50L nước đã lọc (lọc cát) và nước biển đã qua xử lý. Nước ngọt đã khử clo được sử dụng để bù vào lượng thất thoát do bay hơi và duy trì độ mặn trong suốt thí nghiệm.

Mật rỉ đường (C:H:N=30,05:2,78:0,79) được bổ sung làm nguồn carbon hữu cơ khi tổng lượng amoniac đạt 1,0 mg/L để thúc đẩy sự phát triển của các tập hợp vi sinh vật trong các nghiệm thức biofloc. Việc bổ sung carbon hữu cơ được thực hiện bằng cách thêm 6g carbon cho mỗi 1 g tổng nitơ amoni (TAN) trong nước. Quy trình này tuân theo các phương pháp được mô tả bởi Avnimelech (2009), Ebeling và cộng sự (2006) và Samocha và cộng sự (2007).

Việc thay nước 80% được thực hiện cứ sau 48 giờ trong các nghiệm thức nước sạch. Do đó, nước biển tự nhiên, được lọc và xử lý trước ở cùng nhiệt độ như trong các thiết bị thí nghiệm được sử dụng cho quy trình thay nước.

Tôm được cho ăn chế độ ăn thương mại chứa 40% protein thô (CP) (Potimar 40 J, Guabi®, Brazil) 2 lần/ngày (lúc 08:00 và 17:00) trong 45 ngày. Tỷ lệ cho ăn được điều chỉnh từ bảng trình bày của Jory và cộng sự (2001) và ban đầu là 10% tổng sinh khối.

2.4. Chất lượng nước và lấy mẫu

Oxy hòa tan (DO), nhiệt độ và pH được đo 2 lần/ngày (lúc 08:00 và 17:00) bằng máy đo YSI 556 MPS (YSI Inc., Yellow Springs, Hoa Kỳ). Tổng nitơ amoni (UNESCO, 1983) và nitrit-nitrogen (NO₂-N) (Aminot và Chaussepied, 1983) được đo 2 lần/tuần. Độ mặn (sử dụng khúc xạ kế cầm tay quang học), nitrat-nitơ (NO₃-N) (Aminot và Chaussepied, 1983), tổng chất rắn lơ lửng (TSS) (Strickland và Parson, 1972) và độ kiềm (APHA, 1989) được đo hàng tuần.

Vào cuối giai đoạn thử nghiệm (45 ngày), 5 con tôm từ mỗi bể (15 con mỗi nghiệm thức) được sốc nhiệt trong nước đá để làm chết và được mổ vô trùng để loại bỏ đường ruột. Các mẫu đường ruột được cố định ở nồng độ cuối cùng là 2% paraformaldehyde và được cân riêng lẻ để thực hiện các phân tích tiếp theo.

2.5. Phân tích sự hiện diện và hiệu quả của hỗn hợp probiotics thương mại và vi khuẩn gây bệnh giả định bằng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

Các mẫu ruột được xử lý theo quy trình được điều chỉnh từ Epstein và Rossel (1995). Dung dịch Tween (0,0001%) được thêm vào mỗi mẫu, sau đó được siêu âm (Vibra Cell VCX 130PB, Sonics & Materials®) ba lần (phạm vi 110,7 μm trong 60 giây). Sau khi siêu âm, các mẫu được ly tâm ba lần ở tốc độ 500G trong năm phút. Phần nổi phía trên được loại bỏ và phần còn lại được rửa hai lần bằng nước siêu tinh khiết. Ba phần nổi phía trên được đặt trong cùng một bình và lắc mạnh. Vật liệu sau đó được ly tâm như mô tả trước đó. Các phần của mỗi mẫu được lọc trên bộ lọc polycarbonate (Nuclepore® – 0,2 μm) và được làm lạnh cho đến khi thực hiện quá trình lai tạo.

Các thành phần chi Bacillus của hỗn hợp probiotics được thêm vào nước giàu biofloc và vi khuẩn gây bệnh giả định (Vibrio sp.) đã được xác định bằng các đầu dò oligonucleotide nhắm mục tiêu rRNA (Bảng 1). Xử lý mẫu và lai huỳnh quang tại chỗ đã được thực hiện theo mô tả của Del’Duca và cộng sự, 2013. Đối chứng âm được thực hiện bằng đầu dò không đặc hiệu đối với vi khuẩn đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả lai. Tất cả các đầu dò đều được dán nhãn Cy3 fluorochrome. Ngoài từng đầu dò cụ thể, DAPI còn được sử dụng để xác định tổng lượng vi khuẩn. Việc đếm tế bào vi khuẩn được thực hiện trong mười trường ngẫu nhiên với kính hiển vi phát quang Olympus BX60 được trang bị bộ lọc 41007 cho điểm đánh dấu Cy3 và bộ lọc 31000 cho DAPI ở độ phóng đại 1000x. Kết quả là các mẫu lai sử dụng đầu dò không đặc hiệu không được tính vào mật độ của các đầu dò cụ thể khi đếm. Tổng mật độ vi sinh vật được tính bằng cách đếm các tế bào được nhuộm DAPI.

Bảng 1: Các đầu dò oligonucleotide nhắm mục tiêu rRNA của các loài vi khuẩn khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu này. Tất cả các đầu dò được dán nhãn fluorochrome Cy3.

2.6. Phân tích thống kê

Phân tích phương sai một chiều (ANOVA) được sử dụng để xác định sự khác biệt đáng kể về số lượng vi khuẩn và các thông số chất lượng nước giữa các nghiệm thức. Sau khi tìm thấy sự khác biệt đáng kể, phân tích sâu ANOVA của Tukey được thực hiện. Ý nghĩa thống kê có giá trị khi P < 0, 05.

3. KẾT QUẢ

3.1. Chất lượng nước

Các thông số chất lượng nước được thể hiện trong Bảng 2 và 3, được chia theo nhóm biofloc (BFT) và nhóm nước sạch (CW). Nhiệt độ, oxy hòa tan, pH, độ mặn và độ kiềm không có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (Bảng 2).

Bảng 2: Giá trị trung bình (± độ lệch chuẩn) của các thông số chất lượng nước trong suốt thí nghiệm đối với tôm thẻ L. vannamei trong hệ thống biofloc (BFT) và hệ thống nước sạch (CW) có và không có sử dụng probiotics. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05).

Hàm lượng các hợp chất nitơ, tổng nitơ amoniac (TAN) và nitrit (NO₂-N) cao hơn đáng kể ở nghiệm thức CW và CW+P. Mặt khác, nồng độ nitrat (NO₃-N) cao hơn đáng kể ở nghiệm thức BFT và BFT+P. Phép đo tổng chất rắn lơ lửng chỉ được thực hiện đối với các nghiệm thức BFT và BFT+P (Bảng 3) vì hệ thống nước sạch không xảy ra sự tích tụ một lượng đáng kể các chất hữu cơ dạng hạt hoặc chất rắn lơ lửng.

Bảng 3: Giá trị trung bình (± độ lệch chuẩn) của các hợp chất nitơ (tổng nitơ amoniac – TAN, nitrit – NO₂-N và nitrat – NO₃-N) và tổng chất rắn lơ lửng (TSS) của việc nuôi tôm thẻ L. vannamei trong hệ thống biofloc (BFT) và hệ thống nước sạch (CW) có và không có bổ sung probiotics. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05).

3.2 Mật độ vi khuẩn

Tổng lượng vi khuẩn phong phú trong ruột của tôm thẻ L. vannamei nuôi trong nghiệm thức BFT+P (3,67±0,18 x 10⁸ tế bào/g) cao hơn đáng kể, tiếp theo là nghiệm thức CW+P (2,12±0,3 x 10⁸ tế bào/g). Các nghiệm thức không bổ sung ProW® (BFT – 1,65±0,9 x 10⁸ tế bào/g; CW – 1,53 ±0,04 x 10⁸ tế bào/g) không có sự khác biệt và có mật độ vi khuẩn thấp nhất.

Về mật độ của vi khuẩn Bacillus là thành phần của hỗn hợp probiotics, số lượng tế bào được phát hiện cao hơn ở các nghiệm thức có bổ sung probiotic (BFT+P – 0,63±0,06 x 10⁸ tế bào/g; CW+P – 0,69±0,09 x 10⁸ tế bào/g; BFT- 0,18±0,18 x 10⁸ tế bào/g; CW- 0,07±0,07 x 10⁸ tế bào/g). Mặt khác, sự phong phú của Vibrio cao hơn ở cả hai nghiệm thức không bổ sung probiotics (BFT- 0,23±0,04 x 10⁸ tế bào/g; CW- 0,27±0,04 x 10⁸ tế bào/g; BFT+P – 0,06±0,01 x 10⁸ tế bào/g; CW+P – 0,07±0,02 x 10⁸ tế bào/g).

Về tỷ lệ phần trăm của Bacillus và Vibrio trong tổng lượng vi khuẩn, số lượng Bacillus cao nhất được nhận thấy ở nghiệm thức CW+P, tiếp theo là nghiệm thức BFT+P. Các nghiệm thức BFT và CW cho thấy số lượng Bacillus sp. thấp nhất đối với tổng số lượng vi khuẩn. Mặt khác, tỷ lệ phần trăm của Vibrio sp. cao hơn đáng kể ở các nghiệm thức không sử dụng probiotics (BFT và CW) và thấp hơn trong các nghiệm thức sử dụng hỗn hợp probiotics (Bảng 4).

Bảng 4: Tỷ lệ phần trăm (Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn) của Bacillus spp. và Vibrio spp. về tổng lượng vi khuẩn phong phú được quan sát thấy trong hệ thống Biofloc và hệ thống nước sạch có và không có sử dụng probiotics. Các chữ cái khác nhau biểu thị sự khác biệt về mặt thống kê (P<0,05).

4. THẢO LUẬN

Ngoài việc phát huy lợi ích trực tiếp cho vật chủ, probiotic còn giúp kiểm soát chất lượng nước và thay đổi cấu trúc quần thể thủy sinh bằng cách tương tác với các vi sinh vật khác (Verschuere và cộng sự, 2000; Newaj-Fyzul và cộng sự, 2014; Dawood và Koshio, 2016). Việc sử dụng hỗn hợp probiotics không làm thay đổi các thông số chất lượng nước được phân tích trong nghiên cứu này. Nhiệt độ nước, oxy hòa tan, pH, độ mặn và độ kiềm tương tự nhau giữa các nghiệm thức có và không có bổ sung probiotics trong hệ thống nước sạch và hệ thống Biofloc. Những giá trị này vẫn nằm trong phạm vi thích hợp để nuôi tôm thẻ L. vannamei (Van Wyk và Scarpa, 1999; Furtado và cộng sự, 2011). Tuy nhiên, giá trị trung bình của tổng chất rắn lơ lửng (TSS) trong các nghiệm thức biofloc thấp hơn phạm vi khuyến nghị của Samocha và cộng sự (2007) đối với tôm thẻ L. vannamei.

Không có sự khác biệt nào được quan sát thấy về nồng độ các hợp chất nitơ (TAN, NO2-N và NO3-N) giữa các nghiệm thức có và không có probiotic. Tuy nhiên, trong các nghiệm thức BFT, nồng độ nitơ amoniac thấp hơn và nồng độ nitrat cao hơn đã được quan sát, cho thấy quá trình nitrat hóa đã xảy ra, nhưng điều này không xảy ra trong các nghiệm thức nước sạch. Tuy nhiên, nồng độ nitơ quan sát được trong các nghiệm thức nước sạch được duy trì ở phạm vi tối ưu cho tôm thẻ L. vannamei (Lin và Chen, 2001; Lin và Chen, 2003; Kuhn và cộng sự, 2010) bằng cách thay nước sau mỗi 48 giờ.

Quá trình nitrat hóa quan sát được trong các nghiệm thức BFT có thể được thực hiện bởi quần thể vi sinh vật có trong các hạt flocs, vì sự đa dạng của các vi sinh vật quang tự dưỡng, hóa tự dưỡng và dị dưỡng được tìm thấy trong hệ thống nuôi này (Ebeling và cộng sự, 2006). Sự xuất hiện của quá trình này được chứng minh trong nghiên cứu hiện tại bằng sự tích lũy NO₃-N, kết quả này tương tự như kết quả được báo cáo bởi Krummenauer và cộng sự (2014b) về nuôi tôm thẻ L. vannamei trong hệ thống Biofloc. Ngoài ra, một số vi sinh vật dị dưỡng đã được báo cáo là có khả năng nitrat hóa và/hoặc biến đổi nhiều loại hợp chất nitơ (Yang và cộng sự, 2011). Các cơ chế này xảy ra bằng cách chuyển đổi nitơ trong sinh khối vi sinh vật với sự có mặt của oxy và nguồn carbon hữu cơ, đây là nguyên tắc chính của sự hình thành bioflocs (Avnimelech, 1999; Ebeling và cộng sự, 2006).

Sự xâm chiếm của Bacillus vào niêm mạc ruột thường không lâu. Mật độ của những vi khuẩn này có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi liều lượng probiotics (Abriouel và cộng sự, 2011; Al Gburi và cộng sự, 2016; Sorokulova, 2013). Khi được thêm vào nước, probiotics có thể được hấp thụ thông qua quá trình điều hòa vật chủ và thông qua thức ăn (Kesarcodi-Watson và cộng sự, 2008). Sự hình thành probiotics trong đường tiêu hóa của vật chủ liên quan trực tiếp đến liều lượng và thời gian tiêu hóa. Nồng độ probiotics trong nước càng cao thì thời gian ăn của tôm càng ngắn (Riquelme và cộng sự, 2001). Trong nghiên cứu hiện tại, hỗn hợp probiotics được thêm vào nước ở nồng độ 12,5 x 10⁵ CFU/L cứ sau 48 giờ. Hỗn hợp probiotics Bacillus được bổ sung vào cả hệ thống BFT và CW đã xâm chiếm ruột tôm vào cuối thí nghiệm kéo dài 45 ngày.

Do đó, việc bổ sung hỗn hợp probiotics vào nước có thể tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn Bacillus xâm nhập vào ruột bằng cách tăng số lượng của nó (Nimrat và cộng sự, 2012) và có thể làm giảm sự hiện diện của Vibrio (Silva và cộng sự, 2013). De Schryver và Vadstein (2014) cho rằng có mối liên hệ chặt chẽ giữa hệ vi sinh vật đường ruột của vật chủ và hệ vi sinh vật môi trường đối với các sinh vật dưới nước. Tương tự như vậy, Del`Duca và cộng sự (2015) đã xác minh rằng có sự tương đồng mạnh mẽ về quần thể vi khuẩn hiện diện trong ruột, nước và trầm tích ở ao nuôi cá rô phi. Do đó, probiotics có thể được sử dụng như một chiến lược để điều khiển sự đa dạng của vi sinh vật và kiểm soát các bệnh nhiễm trùng gây bệnh trong ruột của vật chủ khi áp dụng một cách hợp lý.

Việc sử dụng probiotics thương mại hoặc thử nghiệm, chủ yếu là Bacillus spp., đã thúc đẩy khả năng kháng lại nhiễm trùng Vibrio trong các nghiên cứu trước đây. Những kết quả này đã được xác nhận bằng các thử nghiệm cảm nhiễm (Balcazar và cộng sự, 2007; Villaseñor và cộng sự, 2015), hoạt tính đối kháng trong điều kiện in vitro (Liu và cộng sự, 2015) hoặc số lượng Vibrio giả định (Silva và cộng sự, 2013). Những xác nhận này phù hợp với nghiên cứu hiện tại, trong đó thu được kết quả tương tự về sự phong phú của vi khuẩn Vibrio và Bacillus trong ruột của tôm thẻ L. vannamei được nuôi trong môi trường BFT+P và CW+P.

Như đã đề cập trước đây, việc định lượng vi khuẩn cụ thể thuộc chi Bacillus và Vibrio trong ruột của tôm thẻ L. vannamei cho thấy xu hướng đối kháng. Số lượng Bacillus (BFT+P và CW+P) cao hơn cho thấy sự phong phú của Vibrio thấp hơn và ngược lại. Một trong những phương thức hoạt động chính của probiotics là cạnh tranh vị trí bám dính và xâm chiếm trong ruột, cũng như cạnh tranh về hóa chất hoặc năng lượng sẵn có, tránh hình thành các mầm bệnh có hại (Gatesoupe, 1999; Mohapatra và cộng sự, 2013), và cũng có hoạt tính chống dính chống lại Vibrio harveyi (Hamza và cộng sự, 2016). Ngoài ra, một đặc tính quan trọng khác của probiotics là sản xuất các chất có đặc tính đối kháng, như axit hữu cơ và bacteriocin (Ringø và cộng sự, 2010; Ringø và cộng sự, 2012). Những chất này có thể làm thay đổi quá trình trao đổi chất của hệ vi sinh vật (Sakata và cộng sự, 1999) và hỗ trợ sức khỏe của vật chủ, bảo vệ chống lại nhiễm trùng bằng cách kích thích hệ thống miễn dịch (Lara-Flores và Aguirre-Guzman, 2009).

Sự hiện diện và số lượng vi sinh vật probiotics trong nghiên cứu này tạo ra tổng lượng vi khuẩn phong phú trong đường ruột của tôm thẻ L. vannamei trong hệ thống BFT cao hơn so với hệ thống nước sạch (CW), điều này có thể ảnh hưởng đến sự đa dạng của vi khuẩn và thành phần của hệ vi sinh vật, thông qua việc tiếp xúc với môi trường xung quanh và lượng thức ăn tiêu thụ (Tzuc và cộng sự, 2014). Việc bổ sung hỗn hợp probiotic thương mại có chứa Bacillus có thể điều chỉnh quần thể vi khuẩn đường ruột của tôm thẻ L. vannamei, tăng cường sự đa dạng của vi khuẩn và giảm số lượng Vibrio trong nước sạch (Villaseñor và cộng sự, 2014; Li và cộng sự, 2009). Trong nghiên cứu này, probiotics dường như có khả năng xâm chiếm đường ruột cao hơn và nó chiếm hơn 30% tổng số vi khuẩn trong ruột tôm. Thực tế này có thể mang lại những tác động tích cực cho vật chủ như đã đề cập trước đó, giúp nâng cao khả năng kháng bệnh, từ đó đó mang lại kết quả tốt hơn về sản lượng.

Việc sử dụng BFT làm hệ thống nuôi đã góp phần làm tăng số lượng vi khuẩn trong ruột của tôm L. vannamei, kể cả có hoặc không có bổ sung hỗn hợp probiotics. Tương tự, Hu và cộng sự (2016) đã đánh giá hiệu quả của việc sử dụng kết hợp probiotics và mật đường làm nguồn carbon đối với cấu trúc quần thể vi sinh vật và xác minh rằng sự kết hợp này đã thúc đẩy sự hình thành và phát triển cấu trúc quần thể vi sinh vật có lợi trong nuôi trồng thủy sản thâm canh mật độ cao đối với tôm thẻ L. vannamei. Những kết quả này tương tự như kết quả của nghiên cứu hiện tại, trong đó sự kết hợp giữa mật đường và probiotic đã tăng cường tổng lượng vi khuẩn phong phú trong các nghiệm thức BFT+P.

Các loài Bacillus như B. subtilis và B. amyloliquefaciens có thể tự động kết tụ và đồng kết tụ (Algburi và cộng sự, 2016). Khả năng tự động kết tụ các chủng vi khuẩn có lợi có thể cần thiết cho sự bám dính của chúng vào các tế bào biểu mô trong ruột. Giống như trong bioflocs, sự kết tụ có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự tích hợp của vi khuẩn ngoại sinh, cho phép hình thành một màng sinh học đa đặc hiệu. Ngoài ra, khả năng này cũng có thể cho phép các sinh vật probiotics tạo ra một rào cản, có thể ngăn chặn sự xâm nhập của mầm bệnh một cách hiệu quả (Kos và cộng sự, 2003; Algburi và cộng sự, 2016)

Việc sử dụng hỗn hợp probiotic thương mại có thể góp phần cân bằng nội môi và ngăn ngừa sự bùng phát của vi khuẩn cơ hội gây bệnh trong hệ thống BFT và nước sạch. Có thể có tác dụng hiệp đồng giữa quần thể vi khuẩn probiotics và vi khuẩn dị dưỡng trong bioflocs đối với tôm thẻ L. vannamei, điều này có thể ngăn ngừa sự phát triển các tổn thương ở gan tụy do vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong nước (Aguillera-Rivera và cộng sự, 2014).

Ferreira và cộng sự (2015) đã nghiên cứu các đặc tính sinh học của Bacillus sp. được phân lập từ nước giàu biofloc và bổ sung cho tôm thẻ L. vannamei. Họ đã xác định số lượng Vibrio trong nước thấp hơn ở các đơn vị thí nghiệm có bổ sung Bacillus, cho thấy sự đối kháng với Vibrio harveyi. Phân lập Bacillus sp. từ nước giàu biofloc của môi trường nuôi tôm thẻ L. vannamei đã được đánh giá về hoạt tính đối kháng trong điều kiện in vitro và tổng số Vibrio và Bacillus trong nước bằng kỹ thuật cấy đĩa. Dưới điều kiện in vitro, các tác giả đã quan sát thấy đặc tính ức chế của Bacillus chống lại mầm bệnh giả định Vibrio alginolyticus và làm giảm tỷ lệ nhiễm Vibrio sp. trong nước nuôi được bổ sung probiotic.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của vi khuẩn probiotic. Ví dụ, enzyme Bacillus hoạt động trong tế bào sống và tế bào chết (Tan và Qian, 1996). Trong bối cảnh này, hầu hết các phân tích về khả năng sống và xét nghiệm đối kháng đều được thực hiện với vi khuẩn phát triển trong môi trường nuôi. Tuy nhiên, kỹ thuật này có thể gặp một số khó khăn do việc đánh giá sự phát triển của Bacillus và Vibrio bị ảnh hưởng bởi môi trường nuôi và có thể gây ra kết quả âm tính giả, theo đánh giá của Letchumanan và cộng sự (2014).

Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc vào môi trường nuôi dựa trên việc khuếch đại axit nucleic với kết quả định tính hoặc bán định lượng. Trong những trường hợp này, không thể quan sát từng cá thể và đánh giá sự phân bố không gian của các vi sinh vật kết tụ hoặc không kết tụ. Tuy nhiên, kỹ thuật FISH cho phép định lượng từng tế bào vi sinh vật. Nó là một công cụ hiệu quả để quan sát và định lượng vi khuẩn được dán nhãn cụ thể trong nghiên cứu này. Kỹ thuật này đã được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản để mô tả hệ vi sinh vật và sự đa dạng của vi khuẩn trong nước và nước thải (Garcia và Olmos, 2007; Paungfoo và cộng sự, 2007; Payne và cộng sự, 2007; Pereira và cộng sự, 2011) và đường ruột của cá (Asfie và cộng sự, 2003; Balcázar và cộng sự, 2010; Huber và cộng sự, 2004) và hàu (Hernandez-Zarate và Olmos, 2006). Ngoài ra, Del’Duca và cộng sự (2013) đã sử dụng kỹ thuật FISH để đánh giá hiệu quả của Bacillus như một probiotic và khả năng kiểm soát vi khuẩn gây bệnh giả định trong ruột cá rô phi. Các tác giả cho rằng kỹ thuật FISH có thể định lượng và theo dõi những thay đổi về số lượng vi sinh vật probiotic và vi khuẩn gây bệnh. Do đó, cấu trúc quần thể vi sinh vật (tức là đơn vị phân loại và số lượng từng đơn vị phân loại vi khuẩn) cho phép đánh giá hiệu quả của probiotic (Del’Duca và cộng sự, 2013).

Tổng lượng vi khuẩn được định lượng trong nghiên cứu này cao hơn trong hệ thống BFT với sự có mặt của hỗn hợp probiotic (BFT+P). Tuy nhiên, kết quả cũng chỉ ra rằng Bacillus có thể xâm chiếm ruột hiệu quả hơn khi tôm thẻ L. vannamei được nuôi trong hệ thống nước sạch so với hệ thống BFT, điều này có thể là do thành phần của hệ thống biofloc có sự tham gia của rất nhiều loại vi sinh vật (De Schryver và cộng sự, 2008). Mặt khác, tỷ lệ Vibrio liên quan đến tổng số vi sinh vật thấp hơn trong nghiệm thức có chứa hỗn hợp probiotics, điều này có thể liên quan đến vai trò của biofloc trong việc kiểm soát hoặc khuyến khích các vi khuẩn gây bệnh tiềm ẩn, đặc biệt là Vibrio (Hargreaves, 2013).

Do đó, những quan sát này chỉ ra rằng việc bổ sung vi khuẩn ngoại sinh vào quần thể vi khuẩn hiện có có thể ảnh hưởng đến động lực và sự tương tác giữa các nhóm sinh vật khác nhau tạo nên hệ thống biofloc. Những dấu hiệu này có thể được phản ánh rõ hơn trong các phương pháp khác nhau để quản lý bioflocs hoặc ứng dụng probiotics. Vì vậy, có thể củng cố tầm quan trọng của việc bổ sung probiotics, đặc biệt là trong các hệ thống nuôi nước sạch thông thường.

5. KẾT LUẬN

Hỗn hợp probiotics thương mại bao gồm Bacillus subtilis và B. licheniformes đã xâm chiếm đường ruột của tôm thẻ chân trắng L. vannamei và kiểm soát quần thể vi khuẩn Vibrio gây bệnh giả định.

Sự khác biệt về hiệu quả của ProW® giữa hai hệ thống nuôi là tỷ lệ Bacillus trên tổng số vi sinh vật trong ruột tôm. Sự xâm chiếm probiotics cao hơn xảy ra ở nghiệm thức CW+P. Đường ruột của tôm nuôi trong nghiệm thức BFT+P có số lượng vi sinh vật lớn hơn khi có sự hiện diện của probiotics.

Việc bổ sung probiotics không làm thay đổi chất lượng nước trong cả hai hệ thống. Tương tự như vậy, nó thúc đẩy việc giảm mật độ Vibrio và tăng mật độ Bacillus trong ruột tôm ở cả hai hệ thống.

Số lượng và tỷ lệ các tế bào riêng lẻ gây bệnh, cũng như probiotics là những yếu tố rất quan trọng trong nuôi tôm. Kỹ thuật FISH là một công cụ cho phép định lượng và theo dõi probiotics cùng với việc phát hiện mầm bệnh giả định hoặc bất kỳ loại vi khuẩn nào khác có trong đường tiêu hóa của tôm và trong nước nuôi.

Ngoài ra, kết quả thu được trong nghiên cứu này có thể góp phần nâng cao hiểu biết của chúng ta về hệ sinh thái vi sinh vật của bioflocs. Hiện nay nó được coi là vấn đề chính của hệ thống nuôi này.

Theo Bárbara Hostins, Gabriele Lara, Olivier Decamp, Dionéia E. Cesar, Wilson Wasielesky Jr

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0044848617303137

Biên dịch: Huyền Thoại – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

• Vật Chủ Liên Quan Đến Hỗn Hợp Vi Khuẩn Probiotic Gây Ra Các Enzyme Tiêu Hóa Trong Ruột Tôm Sú Penaeus monodon
• Tác Dụng Của Probiotic Dạng Vi Nang Đến Hệ Vi Sinh Vật Đường Ruột Của Tôm Thẻ Chân Trắng
• Tái Tạo Nguồn Lợi Thủy Sản Là Việc Rất Quan Trọng Để Tránh Sự Thiếu Hụt Thủy Sản Vào Năm 2050