Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei không phải là nguyên nhân gây ra hội chứng phân trắng ở tôm thẻ chân trắng Penaeus (Litopenaeus) vannamei

Tóm tắt

Giới thiệu: Vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei được phát hiện lần đầu ở Thái Lan vào năm 2009 ở tôm sú bản địa Penaeus (Penaeus) monodon nuôi. Vật chủ tự nhiên của ký sinh trùng này vẫn chưa được biết. Gần đây hơn, một vi bào tử trùng rất giống với vi bào tử trùng này về mặt hình thái và sở thích mô đã được tìm thấy ở tôm thẻ chân trắng Penaeus (Litopenaeus) vannamei nuôi ở Thái Lan biểu hiện hội chứng phân trắng (WFS). Mục tiêu của chúng tôi là so sánh tác nhân gây bệnh mới phát hiện với E. hepatopenaei và xác định mối quan hệ nhân quả của nó với WFS.

Kết quả: Các đoạn mồi chung được sử dụng để khuếch đại một đoạn gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ (ssu rRNA) để nhân bản và giải trình tự cho thấy ký sinh trùng mới từ các ao nuôi ở WFS có 99% trình tự giống với E. hepatopenaei, cho thấy nó là cùng loài. Phân tích mô học bình thường sử dụng các lát cắt mô nhuộm hematoxylin và eosin (H&E) cho thấy tương đối ít tế bào biểu mô ống biểu hiện bào tử, cho thấy tình trạng nhiễm trùng nhẹ. Tuy nhiên, kết quả H&E lại gây hiểu lầm vì PCR lồng nhau và phân tích lai in situ dựa trên đoạn gen ssu rRNA đã nhân bản cho thấy tình trạng nhiễm trùng rất nặng ở các tế bào biểu mô ống ở vùng trung tâm của gan tụy khi không có bào tử. Bất chấp những kết quả này, tỷ lệ nhiễm E. hepatopenaei cao ở tôm từ các ao không biểu hiện WFS và ao đã phục hồi sau WFS cho thấy không có mối liên hệ trực tiếp nào giữa các bệnh nhiễm trùng này và WFS. Điều này được hỗ trợ bởi các thử nghiệm cảm nhiễm qua đường miệng trong phòng thí nghiệm cho thấy sự lây truyền ngang trực tiếp sang tôm không bị nhiễm bệnh nhưng không có dấu hiệu của WFS.

Kết luận: Vi bào tử trùng mới được tìm thấy ở P. vannamei là cùng loài với E. hepatopenaei đã mô tả trước đó và không liên quan với WFS. Tuy nhiên, mức độ lây nheiexm nghiêm trọng của các bệnh nhiễm trùng (lớn hơn nhiều so với báo cáo trước đây ở P. monodon) chắc chắn sẽ có tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng và hiệu quả sản xuất của tôm thẻ chân trắng và có thể trở nên trầm trọng hơn do khả năng lây truyền ngang được phát hiện qua các thử nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm. Do đó, khuyến nghị nên sử dụng các phương pháp PCR và phân tích lai in situ được phát triển ở đây để xác định các loài chứa tự nhiên để có thể loại bỏ chúng khỏi hệ thống nuôi tôm.

Giới thiệu

Một số vi bào tử trùng đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh cho tôm He. Trong nghiên cứu này, có hai loài được báo cáo là lây nhiễm cho tôm nuôi ở Thái Lan. Một trong số đó là loài Agmasoma trước đây gọi là Thelohania lây nhiễm cho mô cơ và mô liên kết ở tôm sú Penaeus (Penaeus) monodon và tôm càng xanh Penaeus (Feneropenaeus) merguiensis. Về mặt hình thái, nó giống với vi bào tử trùng Agmasoma penaei được báo cáo là lây nhiễm cho tôm Penaeus (Litopenaeus) setiferus và Penaeus (Farfantepenaeus) duorarum ở châu Mỹ. Gần đây, ở Thái Lan, cũng đã có báo về việc lây nhiễm cho cùng một mô ở tôm thẻ chân trắng Penaeus (Litopenaeus). Bào tử từ một loại vi bào tử trùng chưa xác định cũng đã được báo cáo trong cơ của P. monodon từ Madagascar.

Một loài vi bào tử trùng khác được báo cáo từ Thái Lan là một loài mới được mô tả Enterocytozoon hepatopenaei giới hạn ở các tế bào biểu mô ống của gan tụy của P. monodon. Năm 2010, E. hepatopenaei cũng được báo cáo từ P. monodon biểu hiện hội chứng phân trắng (WFS) tại Việt Nam. Ở đây, chúng tôi báo cáo về các trường hợp nhiễm trùng lan rộng của một loài vi bào tử trùng E. hepatopenaei được tìm thấy ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei nuôi ở Thái Lan biểu hiện WFS. Ngoài ra, phân tích PCR lồng nhau được sử dụng trong việc kiểm tra tôm thẻ chân trắng từ ao nuôi và từ các thử nghiệm cảm nhiễm qua đường miệng bằng các mô gan tụy từ tôm bị nhiễm vi bào tử trùng.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn mẫu tôm nuôi WFS và tôm nuôi bình thường

Vì Nguyên tắc và Hướng dẫn Đạo đức về Sử dụng Động vật của Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia Thái Lan (1999) chỉ áp dụng cho động vật có xương sống và không có tiêu chuẩn chính thức nào cho động vật không xương sống, nên chúng tôi đã điều chỉnh các nguyên tắc của nó cho tôm. Chúng tôi cũng tuân thủ các hướng dẫn của chính quyền tiểu bang New South Wales, Úc về việc thu hoạch cá và giáp xác một cách nhân đạo (http://www.dpi.nsw.gov.au/agriculture/livestock/animal-welfare/general/fish/shellfish ; ngày 30 tháng 3 năm 2013) liên quan đến các chi tiết về vận chuyển tôm và bảo quản trong phòng thí nghiệm. Đối với việc xử lý tôm để phân tích mô học hoặc để tiêu hủy vào cuối thí nghiệm, phương pháp sử dụng nước muối/bùn đá được khuyến nghị trong các hướng dẫn của Úc.

Một bộ mẫu tôm được thu thập từ tỉnh Surathani ở miền nam Thái Lan vào ngày 28 tháng 10 năm 2010 và bao gồm tôm từ 2 ao biểu hiện WFS, 1 ao phục hồi từ WFS và 2 ao bình thường. Sau khi gây mê, tôm được lau bằng cồn 70% và loại bỏ vỏ để khoảng 100 mg mô gan tụy bên ngoài (không bao gồm ô nhiễm từ phần bên trong của dạ dày và ruột giữa) có thể được chuyển vô trùng vào đệm chiết xuất DNA (xem bên dưới). Phần còn lại của toàn bộ gan tụy (bao gồm manh tràng ruột giữa trước, khoang sau của dạ dày và một phần ruột giữa) được tiêm chất cố định Davidson và xử lý để phân tích mô học như đã mô tả trước đây. Một bộ mẫu tôm thẻ chân trắng P. vannamei non thứ hai biểu hiện hội chứng phân trắng được thu thập từ một trang trại nuôi tôm thâm canh ở tỉnh Chanthaburi, Thái Lan trong tháng 8 – tháng 9 năm 2011 cùng với tôm bình thường từ một ao gần đó. Một số trong những con tôm này đã được xử lý để chiết xuất DNA từ mô gan tụy như mô tả ở trên trong khi số còn lại được sử dụng trong các thử nghiệm về sự lây truyền của vi bào tử trùng bằng cách cho ăn mô gan tụy bị nhiễm bệnh vào tôm bình thường.

Chuẩn bị khuôn mẫu DNA

Mô gan tụy được đồng nhất trong đệm ly giải (50 mM Tris–HCl, pH 8,0, 50 mM EDTA, 1% SDS, 10 mM NaCl) chứa 5 μg/ml proteinase K. DNA bộ gen được phân lập và tinh chế bằng phương pháp phenol-chloroform và nồng độ được xác định bằng cách đo độ hấp thụ UV ở 260 nm. Tất cả các khuôn mẫu DNA đã được điều chỉnh đến nồng độ 50 ng/μl bằng nước cất để thử nghiệm PCR.

Nhân bản một đoạn gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ của vi bào tử trùng

Một đoạn gen ssu rRNA của vi bào tử trùng đã được khuếch đại từ WFS P. vannamei bằng PCR như đã mô tả trước đây. Tóm lại, các đoạn mồi MF1 và MR1 (Bảng 1) được thiết kế từ một đoạn ssu rRNA của Enterocytozoon hepatopenaei được phân lập từ P. monodon và tương ứng với các vị trí 242–260 và 1165–1183 của hồ sơ Genbank FJ496356. Quá trình PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 μl chứa đệm PCR, 0,2 mM dNTP, 1,5 mM MgCl2, 0,1 μM đoạn mồi, 0,625 đơn vị Taq DNA polymerase (Invitrogen) và 1 μl khuôn mẫu. Phân tích PCR bao gồm 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 64°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 45 giây, sau đó kéo dài cuối cùng trong 5 phút ở 72°C. Một đoạn gen srRNA dài 900 – 1.000 bp đã được khuếch đại và nhân bản bằng Bộ dụng cụ nhân bản pGEMT-easy (Promega). Plasmid được chiết xuất từ ba bản sao, tinh chế bằng bộ dụng cụ chiết xuất plasmid (Geneaid) và giải trình tự theo cả hai hướng bằng hai mồi vectơ phổ quát, SP6 và T7, của Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự đồng thuận thu được (trừ các mồi) đã được tiến hành tìm kiếm BLASTN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) trên cơ sở dữ liệu GenBank và sau đó được căn chỉnh với vùng tương ứng của trình tự ssu rRNA của E. hepatopenaei (Genbank: FJ496356) bằng Clustal-W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ). Trong số ba trình tự bản sao, hai trình tự giống hệt nhau 100%, trong khi một trình tự khác nhau ở 2/951 bazơ được phân tích. Bản sao có tên MF12 được sử dụng làm khuôn mẫu kiểm soát dương tính cho phản ứng PCR.

Bảng 1 Trình tự mồi được sử dụng

Để xác minh hồ sơ GenBank FJ496356 cho trình tự ssu rRNA của vi bào tử trùng E. hepatopenaei từ P. monodon, chúng tôi đã sử dụng cùng một phân tích PCR được mô tả ở trên để khuếch đại lại và sao chép lại đoạn gen ssu rRNA từ DNA lưu trữ được sử dụng làm khuôn mẫu tạo ra hồ sơ FJ496356. Bản sao được sao chép và 3 bản sao được giải trình tự để có được trình tự đồng thuận.

Phát hiện PCR nhiễm vi bào tử trùng ở P. vannamei

Hai cặp mồi đặc hiệu, ENF779/ ENR779 và ENF176/ ENR176 được thiết kế từ bản sao được mô tả ở trên cho phân tích PCR lồng nhau để tăng cường độ đặc hiệu và độ nhạy để phát hiện vi bào tử trùng mới (Bảng 1). Phản ứng khuếch đại PCR được thực hiện trong hỗn hợp phản ứng 25 μl chứa 200 mM dNTP, 1,5 mM MgCl₂, 0,1 mM mồi và 0,625 đơn vị Taq polymerase (Invitrogen). Đối với phản ứng PCR bước đầu tiên, phân tích bao gồm biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 58°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 45 giây với lần kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 5 phút. Phản ứng PCR lồng nhau thứ hai được thực hiện bằng cách sử dụng 1 μl sản phẩm PCR đầu tiên làm khuôn mẫu. Các điều kiện phản ứng PCR bao gồm biến tính ban đầu ở 94°C trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ biến tính ở 94°C trong 20 giây, ủ ở 64°C trong 20 giây và kéo dài ở 72°C trong 20 giây với một lần kéo dài bổ sung ở 72°C trong 5 phút. Các sản phẩm PCR được hình dung bằng điện di gel agarose 1,5%, nhuộm ethidium bromide và đặt gel trên máy chiếu tia cực tím. Để xác định độ nhạy phát hiện, pha loãng nối tiếp 10 lần (10⁶ – 1 bản sao plasmid) đã được chuẩn bị và tiến hành theo phân tích PCR lồng nhau.

Phân tích lai In situ

Bộ dụng cụ đánh dấu Dig-PCR (Roche, Đức) đã được sử dụng để chuẩn bị một đầu dò cho lai tại chỗ bằng cách sử dụng các đoạn mồi được hiển thị trong Bảng 1. Một đầu dò GFP-Dig được đánh dấu tương tự đã được sử dụng làm đối chứng âm tính. Các dòng plasmid MF12 và pEGFP–N1 (Clontech) chứa các đoạn chèn có liên quan được sử dụng làm khuôn mẫu cho Enterocytozoon sp. và đối chứng âm tính tương ứng. Các đầu dò được gắn nhãn Dig được tinh chế bằng bộ dụng cụ tinh chế PCR (Geneaid) và hiệu quả gắn nhãn được xác định bằng phương pháp lai chấm. Tôm được cố định trong dung dịch cố định Davidson qua đêm trước khi xử lý để nhúng parafin thông thường. Các phần mô được tiêu hóa bằng 10 μg/ml Proteinase K (Invitrogen, Hoa Kỳ) trong đệm TNE trong 10 phút ở 37°C. Mỗi phần được phủ 200 μl dung dịch lai hóa trước [4 × SSC và 50% (v/v) formamid khử ion] và ủ ở 37°C trong 30 phút trước khi dung dịch được thay thế bằng 200 μl hỗn hợp lai hóa có chứa đầu dò gắn nhãn DIG (khoảng 20 ng/ phiến kính) và phủ bằng một tấm kính. Phản ứng lai hóa được thực hiện ở 42°C trong 20 giờ trong buồng ẩm để tránh bay hơi. Sau khi rửa các phần bằng độ nghiêm ngặt cao, chúng được ủ với dung dịch chặn 0,5% (Roche, Đức) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Các phần được ủ với kháng thể anti-digoxigenin liên hợp với phosphatase kiềm (pha loãng 1:500). Kháng thể không liên kết được rửa sạch hai lần và cân bằng trong dung dịch đệm phát hiện (100 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl và 50 mM MgCl₂, pH 9,5). Tín hiệu được phát triển bằng cách thêm chất nền NBT-BCIP (Roche, Đức) và nhuộm màu tương phản được thực hiện bằng Bismarck brown Y (Sigma, Hoa Kỳ). Các tiêu bản được quan sát và chụp ảnh bằng kính hiển vi Olympus có máy ảnh kỹ thuật số.

Thử nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm

Tôm thẻ trắng nặng 6–8 gam được lấy từ một trang trại ở tỉnh Chanthaburi, Thái Lan và được nuôi tại Phòng thí nghiệm Trung tâm nghiên cứu kinh doanh nuôi trồng thủy sản, Khoa Thủy sản, Đại học Kasetsart trong 1 tuần. Trong thời gian nuôi thích nghi, tôm được cho ăn thức ăn viên thương mại. Sau đó, 60 con tôm được thả ngẫu nhiên vào 6 bể nuôi (mỗi bể 80 lít) với 10 con tôm mỗi bể. Tôm được chia thành 2 nhóm, mỗi nhóm 30 con (tức là 3 bể nuôi). Tôm từ nghiệm thức được cho ăn mô gan tụy của tôm bị nhiễm E. hepatopenaei mỗi ngày trong 7 ngày (một lần một ngày và một bữa ăn khác được cho ăn thức ăn viên thương mại) trong khi tôm từ nhóm đối chứng được cho ăn thức ăn viên thương mại hai lần một ngày. Oxy hòa tan (DO), Độ mặn, pH và nhiệt độ trong thời gian thích nghi và thí nghiệm được duy trì ở mức 4 ppm, 25 ppt, 7,8–8,0 và 28°C. Thử nghiệm đã kết thúc sau 7 ngày. Tôm được lấy mẫu (một con từ mỗi bể nuôi) vào ngày 2, 4 và 7 sau khi cho ăn để thử nghiệm PCR bằng cách sử dụng mồi E. hepatopenaei. Chúng cũng được theo dõi tỷ lệ chết và các dấu hiệu của WFS.

Kết quả

Phân tích tiểu đơn vị nhỏ đoạn gen RNA ribosome

Khi các đoạn mồi MF được thiết kế từ trình tự ssu rRNA của loài Enterocytozoon được sử dụng với các chiết xuất DNA gan tụy khuôn mẫu từ P. vannamei bị nhiễm vi bào tử trùng, một amplicon 951 bp đã thu được (Tệp bổ sung 1). Điều này nằm trong phạm vi kích thước dự kiến khoảng 900–1000 bp, dựa trên các vùng được bảo tồn của trình tự ssu rRNA của Enterocytozoon được liệt kê tại GenBank (FJ496356) và amplicon trước đó dài 886 bp thu được từ P. monodon bị nhiễm Enterocytozoon hepatopenaei. Việc nhân bản và giải trình tự 3 bản sao cho thấy trình tự giống hệt nhau 100% đối với 2 bản sao và chỉ có 2 nucleotide biến đổi đối với bản sao thứ ba. Một trình tự đồng thuận đã được kết luận từ hai bản sao giống hệt nhau và một phần 913 bp của trình tự amplicon (không bao gồm trình tự mồi, số hiệu Genbank KF362130) đã được đưa vào tìm kiếm BLASTN chung chỉ mang lại các kết quả tìm kiếm cho các bản ghi trình tự vi bào tử trùng. Các kết quả tìm kiếm hàng đầu từ tìm kiếm BLASTN bao gồm Enterocytozoon được phân lập từ P. monodon (GenBank FJ496356) với độ đồng nhất 96%, Nucleospora salmonis (GenBank U10883) với độ đồng nhất 89% và E. bieneusi (GenBank: AY257180) với độ đồng nhất 89%. Các mồi MF1 và MR1 cũng được sử dụng để khuếch đại mục tiêu gen rRNA ssu từ vật liệu lưu trữ của P. monodon bị nhiễm bệnh được sử dụng trong công trình đã công bố trước đây đã tạo ra bản ghi GenBank FJ496356. Một trình tự đồng thuận đã được thiết lập từ 3 bản sao cũng có 913 bp mỗi bản và được đặt tên là Pm-Entero (mã số Genbank KF362129). Sự sắp xếp clustal của trình tự 913 bp của chúng tôi từ P. vannamei với trình tự 913 bp của chúng tôi từ P. monodon cho thấy 99% tính đồng nhất, cho thấy các bệnh nhiễm trùng phát sinh từ cùng một loài vi bào tử trùng (Hình 1).

Hình 1 Sự sắp xếp Clustal-W của các trình tự rRNA tiểu đơn vị nhỏ của vi bào tử trùng. Trình tự rRNA ssu của Enterocytozoon hepatopenaei từ P. monodon (Pm-Entero) (mã số Genbank KF362129) và vi bào tử trùng từ P. vannamei (Pv-Entero) (mã số Genbank KF362130) được so sánh với vùng khớp của gen rRNA ssu của E. bieneusi (GenBank AY257180). Các vùng có 100% giống nhau giữa Pv-Entero và Pm-Entero được phác thảo bằng nền xám trong khi 100% giống nhau giữa cả ba loài được biểu thị bằng dấu hoa thị.

Phát hiện vi bào tử trùng bằng PCR và lai in Stu ở P. vannamei

Với mẫu thực địa sơ bộ gồm 11 con tôm lấy từ một ao WFS và 10 con từ một ao bình thường gần đó, các xét nghiệm PCR sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu cho E. hepatopenaei (Bảng 1) cho thấy 10/11 con tôm từ ao WFS có kết quả dương tính trong khi tất cả 10 con từ ao bình thường đều có kết quả âm tính (Bảng 2). Tuy nhiên, một bộ mẫu sau đó (Bảng 3) cho kết quả ít rõ ràng hơn, trong đó một số ao không có dấu hiệu nhiễm WFS cao (9/10 tôm) dương tính với E. hepatopenaei bằng PCR (chủ yếu là PCR lồng nhau), trong khi các ao khác có dấu hiệu WFS cho tôm ít nhiễm dương tính bằng PCR (4/10). Ngoài ra, một ao phục hồi không có dấu hiệu WFS (Bảng 4) có tôm (8/9) bị nhiễm trùng lan rộng được xác định bằng lai in situ. Điều này tạo nên mối tương quan kém giữa các dấu hiệu WFS và mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng E. hepatopenaei.

Bảng 2 Kết quả PCR từ mẫu tôm sơ bộ từ ao WFS và ao bình thường gần đó

Sử dụng đầu dò được gắn nhãn digoxygenin (DIG) để xác nhận tính hợp lệ của xét nghiệm PCR, hầu hết (4/6) mẫu dương tính in situ rộng rãi đều có PCR dương tính bước 1 (2 ngoại lệ Bảng 3, Pond7 YOT4 & Pond6 YOT). Các mẫu cho phản ứng lai in situ dương tính nhẹ (n = 7) chỉ dương tính với bước 2 (PCR lồng nhau) (n = 4) hoặc cho phản ứng PCR âm tính (n = 2), trong khi một mẫu cho kết quả dương tính với bước 1 (Pond 13 BAP-1). Trong số 11 mẫu cho kết quả xét nghiệm lai in situ âm tính, 6 mẫu cho kết quả xét nghiệm PCR âm tính và 5 mẫu cho kết quả PCR dương tính với bước 2.

Bảng 3 Kết quả PCR và lai in situ đối với vi bào tử trùng trong một nhóm ao nuôi tôm thứ hai

* Mô học của tôm trong các ao này không cho thấy dấu hiệu nhiễm vi bào tử trùng nhưng 4 mẫu cho thấy dấu hiệu nhiễm vi khuẩn nghiêm trọng ở HP có thể đã che khuất bất kỳ vi bào tử trùng nào hiện diện. 6 mẫu còn lại trông bình thường, không có dấu hiệu nhiễm vi bào tử trùng.

Phát hiện vi bào tử trùng bằng PCR và lai in situ trong 2 ao bình thường và 2 ao WFS. Hyb ++ chỉ ra phản ứng lai in situ dương tính rộng rãi trong mô HP trong khi Hyb + chỉ ra phản ứng dương tính cục bộ nhẹ và Hyb – chỉ ra không có phản ứng. ND Chưa thực hiện.

Bệnh học mô học và lai in situ của các bệnh nhiễm trùng ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei

Như đã báo cáo trước đây về nhiễm trùng E. hepatopenaei ở P. monodon, số lượng tế bào gan tụy biểu hiện sự hình thành bào tử ở P. vannamei (Hình 2) là nhỏ, tạo ra ấn tượng hời hợt rằng mức độ nhiễm trùng rất hạn chế. Kích thước của bào tử (dài khoảng 1 μm và rộng dưới 1 μm) và vị trí tế bào chất cũng tương tự như những mô tả trước đây đối với E. hepatopenaei ở P. monodon. Tuy nhiên, sự khác biệt ở P. vannamei bao gồm sự hình thành bào tử chỉ ở tế bào B (Hình 2) và nhiễm trùng rộng rãi ở các tế bào biểu mô ống giữa và gần của gan tụy khi không có bào tử, như được phát hiện bằng lai in situ (Hình 3). Đây không phải là tình huống của các báo cáo trước đây về E. hepatopenaei ở P. monodon, trong đó tương đối ít tế bào tạo ra bào tử hoặc cho thấy ký sinh trùng sốt rét có thể nhận biết được và chỉ những tế bào đó mới dương tính với lai in situ. Các tế bào cho phản ứng lai in situ dương tính ở P. vannamei bị giới hạn ở vùng trung tâm của HP và không mở rộng đến vùng xa bao gồm các tế bào E. Ở vùng chuyển tiếp giữa các tế bào trung gian và xa, phản ứng lai in situ dương tính chỉ điểm cho thấy giai đoạn nhiễm trùng sớm xảy ra khi các tế bào HP biệt hóa từ tế bào E thành tế bào B, F và R. Các tiêu bản đối chứng âm tính sử dụng đầu dò gắn nhãn GFP-DIG không cho phản ứng lai in situ dương tính (không hiển thị). Ở độ phóng đại thấp và trung bình bằng nhuộm H&E (Hình 3a, c, e), không có đặc điểm tế bào chất đặc biệt nào cho thấy các thành phần vi bào tử tạo ra phản ứng lai in situ dương tính ở các lát cắt mô liền kề. Ở độ phóng đại cao nhất bằng phương pháp nhuộm H&E (thấu kính nhúng dầu), các thể vùi tế bào chất ưa kiềm có hình dạng, kích thước và số lượng rất khác nhau (Hình 3g) có mặt trong các tế bào nhuộm H&E và một số trong số này có thể có nguồn gốc từ vi bào tử trùng nhưng không thể phân biệt rõ ràng với các cấu trúc tế bào chất ưa kiềm bình thường khác của vật chủ. Do hiện tượng này, đánh giá mô bệnh học về mức độ nghiêm trọng của các bệnh nhiễm trùng này bằng phương pháp nhuộm H&E có thể gây hiểu lầm, nếu tiêu chí được sử dụng là số lượng tế bào có bào tử trùng hoặc các cấu trúc vi bào tử trùng dễ nhận biết khác.

Hình 2 Gel agarose cho thấy các amplicon PCR đặc hiệu với vi bào tử trùng lồng nhau sử dụng 100 ng khuôn mẫu DNA tổng số từ mô gan tụy lấy từ P. vannamei không bị cảm nhiễm vi bào tử trùng (A) hoặc bị cảm nhiễm vi bào tử trùng qua đường miệng (B) với. Làn 1-3: Ba mẫu vật 2 ngày sau khi cảm nhiễm; Làn 4-6: Ba mẫu vật 4 ngày sau khi cảm nhiễm, Làn 7-9: Ba mẫu vật 7 ngày sau khi cảm nhiễm; Làn 10: plasmid đối chứng dương tính. Kích thước amplicon cho PCR bước 1 và bước 2 lần lượt là 779 và 176 bp.

Hình 3 Ảnh chụp vi mô bào tử vi bào tử trong tế bào gan tụy. Bào tử vi bào tử (mũi tên) bên trong tế bào B của biểu mô ống gan tụy (trái) và tự do trong lòng ống (phải). Các tế bào có mặt trong phần này với số lượng ít, tạo ra dấu hiệu sai lệch về mức độ nhiễm vi bào tử nghiêm trọng được chứng minh bằng lai in situ như thấy trong Hình 2. Thanh phóng đại áp dụng cho cả hai hình ảnh.

Các thử nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm

Do mối liên quan giữa nhiễm trùng Enterocytozoon với WFS ở P. vannamei (nghiên cứu này) và P. monodon, một xét nghiệm cảm nhiễm trong phòng thí nghiệm sơ bộ đã được tiến hành để xác định khả năng lây truyền trực tiếp bằng cách sử dụng P. vannamei bình thường được cho ăn mô gan tụy của tôm có nguồn gốc từ ao nuôi tôm đang xảy ra dịch WFS. Tôm đối chứng được cho ăn mô gan tụy của tôm bình thường. Khi lấy mẫu tôm đối chứng vào ngày 2, 4 và 7 sau cảm nhiễm, 1 trong 3 con tôm được lấy mẫu vào mỗi ngày cho ra đoạn khuếch đại vi bào tử trùng yếu khi phân tích PCR bước 2 (Hình 4), cho thấy rằng khoảng 1/3 tôm đã bị nhiễm vi bào tử trùng nhẹ trước khi thí nghiệm bắt đầu. Tương tự như vậy, trong nhóm thử nghiệm, 1 trong 3 con tôm được lấy mẫu cho ra đoạn khuếch đại vi bào tử trùng yếu khi phân tích PCR bước 2 sau 2 ngày cảm nhiễm, trong khi phản ứng mạnh hơn thu được vào ngày 4 và 7, với hai trong số những phản ứng này cho kết quả dương tính ở bước 1 (Hình 4). Không có con tôm nào trong nhóm thử nghiệm hoặc nhóm đối chứng cho thấy dấu hiệu rõ ràng của WFS hoặc không có tôm chết trong thời gian thử nghiệm 7 ngày. Những kết quả này chỉ ra rằng E. hepatopenaei có thể được truyền theo chiều ngang ở P. vannamei thông qua hành vi ăn thịt đồng loại, và điều này trái ngược với Agmasoma penaei lây truyền sang tôm qua con đường gián tiếp từ vật chủ thay thế.

Hình 4 Ảnh chụp vi mô mô gan tụy bị nhiễm của P. vannamei. Các phần mô tôm liền kề được nhuộm bằng H&E (cột 1) và bằng đầu dò lai tại chỗ (cột 2) cho thấy các tế bào gan tụy của P. vannamei bị nhiễm vi bào tử trùng không thể dễ dàng phát hiện bằng cách nhuộm H&E mặc dù tình trạng nhiễm trùng lan rộng được phát hiện bằng phương pháp lai in stu (nhuộm màu nâu sẫm đến đen). (a/b) Độ phóng đại thấp cho thấy các phản ứng dương tính bị giới hạn ở các tế bào biểu mô ống giữa và ống gần của gan tụy tôm (HP) trong khi các tế bào E xa là âm tính. Lưu ý rằng tế bào B chiếm ưu thế trong vùng bị nhiễm. (c/d) Độ phóng đại trung bình cao cho thấy phản ứng lai tại chỗ dương tính ở điểm chính xác trong vùng HP liền kề với vùng tế bào E xa. (e/f) Độ phóng đại cao cho thấy rõ ràng khó khăn trong việc xác định các tế bào bị nhiễm bằng phương pháp nhuộm H&E nhưng có thể phát hiện rõ ràng bằng phương pháp lai in stu. (g/h) Độ phóng đại rất cao, làm nổi bật các đặc điểm được mô tả trong (e/f).

Thảo luận

Do đặc tính mô giống hệt nhau, kích thước bào tử giống hệt nhau và tính đồng nhất trình tự đạt 99% khi so sánh các đoạn gen ssu rRNA dài 913 bp, chúng tôi kết luận rằng vi bào tử trùng mới tìm thấy ở P. vannamei giống hệt với E. hepatopenaei đã được báo cáo trước đó từ P. monodon. Tuy nhiên, chúng tôi chỉ giải trình tự 3 bản sao (98-99% giống hệt nhau) từ mỗi loài tôm để có được trình tự đồng thuận mà chúng tôi sử dụng để so sánh phát sinh loài. Do đó, theo bảng lấy mẫu thú y, có thể đã bỏ sót trình tự của các bản sao khác của gen ssu rRNA có thể có mặt dưới mức phổ biến 64% trong DNA khuôn mẫu và có thể khác với trình tự đồng thuận của chúng tôi hơn 1 hoặc 2%. Do đó, cần có phân tích di truyền chi tiết hơn về toàn bộ, gen RNA tiểu đơn vị nhỏ và lớn, vùng ITS và có lẽ là các gen khác để xác nhận hoàn toàn kết luận của chúng tôi rằng E. hepatopenaei lây nhiễm cho cả hai loài tôm này.

Chúng tôi không có lời giải thích nào về sự khác biệt giữa kết quả xét nghiệm PCR dương tính mạnh ở bước 1 mặc dù có phản ứng lai in situ nhẹ ở một trong các mẫu vật từ Ao 13 BAP. Đặc biệt quan trọng là bộ mẫu thứ ba từ ao WFS đã phục hồi, trong đó hầu hết tôm (8/9) cho thấy nhiễm E. hepatopenaei nặng từ phân tích lai in situ (Bảng 4) mặc dù không có dấu hiệu phân trắng. Thật không may, không có mẫu HP nào của những con tôm sau này được chuẩn bị phân tích PCR. Nhìn chung, những kết quả này và kết quả của thử nghiệm cảm nhiễm qua đường miệng không chỉ ra mối liên hệ chắc chắn giữa WSF và nhiễm E. hepatopenaei. Mặt khác, có khả năng mức độ nghiêm trọng của nhiễm E. hepatopenaei có thể tăng lên do các nguyên nhân cơ bản chưa biết của WFS, do đó tạo ra ít dấu hiệu về nguyên nhân.

Bảng 4 Kết quả lai in stu của các mẫu tôm trong ao thu hồi từ WFS

Bản chất lan rộng của nhiễm E. hepatopenaei ở nhiều mẫu vật được kiểm tra cho thấy sẽ có nhu cầu năng lượng cao đối với ký sinh trùng đang phát triển và điều này sẽ có tác động tiêu cực đến sự phát triển của vật chủ. Do khó khăn trong việc đánh giá mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng bằng phương pháp nhuộm H&E thông thường, do đó cần thận trọng khi theo dõi ao nuôi để tìm E. hepatopenaei bằng phân tích PCR, đặc biệt là nếu tốc độ tăng trưởng thấp hơn dự đoán khi không có nguyên nhân rõ ràng khác. Có thông tin lan truyền rằng một hoạt động nuôi trồng ở Thái Lan hiện đã áp dụng chính sách chấm dứt và thả lại ao nuôi có tỷ lệ nhiễm E. hepatopenaei cao và mức độ nghiêm trọng được chỉ ra bằng phản ứng PCR dương tính bước 1 trong tháng đầu tiên nuôi, vì hồ sơ của họ cho thấy những ao này có tốc độ tăng trưởng tôm không có lãi.

Các thử nghiệm của chúng tôi (không hiển thị) đã phát hiện ra rằng E. hepatopenaei không có trong ấu trùng có nguồn gốc từ đàn tôm thẻ chân trắng P. vannamei và được sử dụng để thả vào ao nuôi ở Thái Lan. Điều này chỉ ra rằng các bệnh nhiễm trùng được tìm thấy trong ao nuôi xảy ra sau khi ao được thả và cho thấy rằng chúng là kết quả của sự lây truyền từ một nguồn ao tự nhiên như một loài vật chủ địa phương chưa xác định. Thực tế cho thấy E. hepatopenaei đã được phát hiện ở Thái Lan trong P. monodon bản địa từ lâu trước khi nó được tìm thấy trong P. vannamei. Do đó, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng chiến lược tốt nhất để kiểm soát nhiễm trùng trong ao nuôi là tập trung vào việc xác định các loài chứa và loại bỏ chúng khỏi hệ thống nuôi tôm. Cách tiếp cận này đã thành công trong việc kiểm soát Agmasoma penaei ở tôm nuôi ở Thái Lan. Vì khả năng lây truyền ngang của E. hepatopanaei, cần xác định xem các bào tử còn sót lại trong ao bùng phát dịch bệnh có bị loại bỏ hay không bằng các quy trình hiện tại để chuẩn bị ao giữa các chu kỳ nuôi.

Kết luận

Mặc dù chúng tôi đã chỉ ra rằng vi bào tử trùng E. hepatopenaei thường được tìm thấy ở tôm thẻ chân trắng P. vannamei nuôi biểu hiện WFS, nhưng không có khả năng ký sinh trùng này có mối liên hệ với WFS, mặc dù mức độ nghiêm trọng của nhiễm trùng E. hepatopenaei cao hơn do các nguyên nhân cơ bản của WFS. Vì vi bào tử trùng này không có trong đàn tôm SPF của Thái Lan, nên nhiễm trùng ao có thể bắt đầu do sự lây truyền từ một hoặc nhiều loài vật chủ tại địa phương. Do đó, chiến lược kiểm soát hiệu quả nhất là xác định các loài vật chủ và loại trừ chúng khỏi hệ thống sản xuất tôm. Phương pháp PCR và phương pháp lai in situ được phát triển ở đây sẽ hữu ích trong việc xác định các loài vật chủ.

Theo Amornrat Tangprasittipap, Jiraporn Srisala, Saisunee Chouwdee, Montagan Somboon, Niti Chuchird, Chalor Limsuwan, Thinnarat Srisuvan, Timothy W Flegel và Kallaya Sritunyalucksana

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức