Phương pháp chiết xuất DNA nhanh dựa trên Chelex-100 và ứng dụng của nó trong việc phát hiện mầm bệnh ở tôm

Tóm tắt

Bối cảnh: Tôm thẻ chân trắng là một trong những loài thủy sản có ý nghĩa kinh tế quan trọng nhất thế giới, là một trong ba loài được nuôi nhiều nhất trên toàn cầu. Tuy nhiên, tỷ lệ mắc các bệnh như bệnh hoại tử gan tụy cấp tính và vi bào tử trùng gan tụy ngày càng tăng đã dẫn đến sản lượng tôm giảm nghiêm trọng và thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Với nhu cầu phát hiện mầm bệnh ngày càng tăng ở các trang trại nuôi tôm, công nghệ chiết xuất DNA nhanh đã trở nên tinh vi hơn. Trong nghiên cứu này, một phương pháp nhanh chóng và thô sơ để chiết xuất DNA bộ gen từ cơ và gan tụy tôm bằng Chelex-100 đã được thiết lập.

Kết quả: DNA đã được chiết xuất thành công từ cơ và mô gan tụy bằng cả phương pháp Chelex-100 và bộ dụng cụ thương mại. Các gen tham chiếu nội bộ của tôm đã được khuếch đại thành công thông qua PCR và PCR real-time bằng cách sử dụng các mẫu DNA thu được. Hơn nữa, một thử nghiệm thực địa đã được tiến hành thành công bằng cách sử dụng PCR real-time và khuếch đại enzyme recombinase real-time (ERA real-time), cho thấy chất lượng DNA được chiết xuất bằng Chelex-100 đủ để sử dụng kết hợp với khuếch đại axit nucleic để phát hiện mầm bệnh ở tôm.

Kết luận: Chelex-100 là một phương pháp hiệu quả để chiết xuất DNA từ mô cơ tôm hoặc gan tụy, với thời gian chiết xuất ngắn, hiệu quả chiết xuất cao và thao tác đơn giản, khiến nó phù hợp để sử dụng trong việc phát hiện mầm bệnh ở tôm.

Giới thiệu

Nuôi tôm thẻ chân trắng hiện đang thống trị ngành nuôi tôm trên thế giới; tuy nhiên, loài này đang bị đe dọa bởi các bệnh nghiêm trọng, gây ra thách thức đáng kể cho ngành nuôi tôm trên toàn cầu. Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) là một căn bệnh chủ yếu do nhiễm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Kể từ năm 2009, AHPND đã gây ra sự suy giảm đáng kể sản lượng tôm, dẫn đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Ở những khu vực bị ảnh hưởng bởi AHPND, sản lượng tôm đã giảm khoảng 60% và ngành nuôi tôm toàn cầu đã chịu thiệt hại 43 tỷ đô la. Tôm bị ảnh hưởng bởi AHPND có biểu hiện lờ đờ, chán ăn và chậm phát triển. Trong 30 ngày đầu tiên sau khi thả ấu trùng tôm, có thể quan sát thấy nhiều tế bào biểu mô trong gan tụy hoặc đường tiêu hóa. Bệnh vi bào tử trùng gan tụy (HPM) là một bệnh tôm khác do vi khuẩn Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra. EHP chủ yếu ký sinh trên mô gan tụy của tôm, đặc biệt là các tế bào biểu mô của ống gan. Nó thường được tìm thấy ở tôm thẻ chân trắng, tôm càng xanh và các loài tôm quan trọng về mặt kinh tế khác và rất dễ lây lan. Kể từ khi phát hiện vào năm 2003, các ca nhiễm EHP đã được báo cáo ở một số quốc gia, bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Úc, Malaysia, Venezuela, Ấn Độ và Indonesia.

Các công nghệ phát hiện mầm bệnh nhanh chóng và hiệu quả đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát và giảm thiểu các đợt bùng phát dịch bệnh ở tôm. Các phương pháp phát hiện phân tử axit nucleic đã được phát triển thành công trong những năm gần đây và hiện được sử dụng rộng rãi trong việc phát hiện các mầm bệnh ở tôm, đặc biệt là thử nghiệm phản ứng chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (PCR real-time) và các kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt như khuếch đại recombinase bằng enzym thời gian thực (ERA real-time). Hầu như tất cả các phương pháp phát hiện đều yêu cầu chuẩn bị nhanh các mẫu DNA chất lượng cao làm bước đầu tiên. Do đó, trong lĩnh vực phát hiện mầm bệnh ở tôm, việc phát triển một phương pháp hiệu quả, nhanh chóng và đơn giản để chiết xuất DNA từ mô tôm là vô cùng quan trọng.

Có nhiều kỹ thuật khác nhau để chiết xuất DNA ở tôm và các phương pháp phổ biến nhất bao gồm phương pháp phenol-chloroform, phương pháp hấp phụ cột ly tâm và phương pháp hạt từ. Tuy nhiên, các kỹ thuật này tốn thời gian, tốn kém và khó khăn, đồng thời có những nhược điểm khác khi áp dụng để phát hiện mầm bệnh ở tôm. Phương pháp phenol-chloroform là một phương pháp truyền thống. DNA thu được thông qua phương pháp phenol-chloroform có độ tinh khiết cao và đáp ứng nhiều yêu cầu thử nghiệm. Tuy nhiên, các dung môi được sử dụng có thể khác nhau về hiệu quả và phenol còn lại trong phương pháp chiết xuất có khả năng cản trở quá trình khuếch đại PCR. Ngoài ra, quy trình chiết xuất theo phương pháp phenol-chloroform rất khó khăn, tốn thời gian và dễ bị nhiễm chéo. Cuối cùng, các hóa chất được sử dụng trong quy trình này có khả năng gây nguy hiểm, gây ra rủi ro cho sức khỏe của người vận hành và dẫn đến ô nhiễm môi trường. DNA được chiết xuất bằng phương pháp cột hấp phụ ly tâm có độ tinh khiết cao hơn, do đó đảm bảo an toàn cho DNA được chiết xuất. Hơn nữa, kỹ thuật cột ly tâm có thể được áp dụng bằng cách sử dụng các thể tích nhỏ, với lưu ý là nó đòi hỏi phải ly tâm nhiều lần DNA được chiết xuất. Do đó, nó không có lợi cho các hoạt động tự động, thông lượng cao và vừa tốn kém vừa tốn thời gian. Mặt khác, hạt từ tính loại bỏ nhu cầu về dung môi hữu cơ và ly tâm nhiều lần và có thể được sử dụng kết hợp với các kỹ thuật thông lượng cao. Tuy nhiên, quy trình này phức tạp hơn, tốn thời gian và đòi hỏi chuyên môn đặc biệt để vận hành. Hiện nay, khi thử nghiệm các tác nhân gây bệnh ở tôm, các phòng thí nghiệm thường sử dụng bộ dụng cụ thương mại để chiết xuất DNA từ mô tôm. Tuy nhiên, việc chiết xuất DNA bằng bộ dụng cụ mất khoảng 1–2 giờ để có kết quả. Ngoài ra, các bộ dụng cụ thương mại đắt tiền, cồng kềnh khi sử dụng và đòi hỏi trình độ kỹ năng cao từ kỹ thuật viên phòng thí nghiệm, khiến chúng không phù hợp để phát hiện các tác nhân gây bệnh ở tôm tại hiện trường.

Trong những năm gần đây, một số học giả đã tiến hành nghiên cứu chuyên sâu để tăng tốc độ của các phương pháp chiết xuất DNA hiện có. Ví dụ, việc tích hợp hấp phụ hạt từ của DNA bộ gen trong phương pháp cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) truyền thống đã làm giảm số bước vận hành và rút ngắn thời gian xử lý, do đó cải thiện phương pháp. Hơn nữa, việc sử dụng natri dodecyl sulfat (SDS) kết hợp với các cột silica gel hấp phụ không chỉ đạt được hiệu quả phân hủy tế bào mà còn cung cấp một phương tiện phân lập và tinh chế an toàn và không gây ô nhiễm. Ngoài ra, hoạt động này nhanh hơn và tiết kiệm chi phí hơn, tránh hiệu quả việc sử dụng các dung môi hữu cơ có hại như cloroform. Mặc dù các phương pháp trên đã cải thiện hiệu quả chiết xuất DNA so với các phương pháp truyền thống, nhưng quy trình của chúng vẫn tốn thời gian và quy trình vận hành của chúng có phần bất tiện, có thể cản trở quá trình phát hiện mầm bệnh tôm sau đó.

Gần đây, phương pháp dựa trên Chelex-100 đã được chứng minh là phương pháp chiết xuất DNA hiệu quả và nhanh chóng với chi phí thấp và dễ sử dụng, khiến nó trở thành phương pháp lý tưởng để sử dụng trong phát hiện mầm bệnh tôm. Chelex-100 là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại đa hóa trị. Nó bao gồm một đồng trùng hợp của styrene và divinylbenzen kết hợp với các ion axit iminodiacetic, hoạt động như các nhóm tạo phức. Chelex-100 làm vỡ màng tế bào của một số lượng tế bào nhất định, giải phóng DNA của chúng thông qua quá trình đun sôi. Nó cũng ngăn chặn sự phân hủy DNA thông qua các ion kim loại tạo phức trong quá trình đun sôi. Hiện nay, Chelex-100 chủ yếu được sử dụng để chiết xuất DNA từ nhiều loại ma trận khác nhau, bao gồm vi khuẩn, nấm, côn trùng và các nguồn sinh học khác. Ngoài ra, nó tạo điều kiện khuếch đại DNA hiệu quả để giải trình tự, phân tích kiểu gen và các xét nghiệm cụ thể, trong số các ứng dụng khác.

Phương pháp Chelex-100 cho phép chiết xuất DNA nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm chi phí mà không cần sử dụng dung môi hữu cơ hoặc cần chuẩn bị mẫu hoặc chuyển mẫu rộng rãi. Ngoài ra, phương pháp này có thể liên kết hiệu quả các chất ngoại sinh khác có thể gây trở ngại cho quá trình khuếch đại axit nucleic trong quá trình chiết xuất. Tuy nhiên, phương pháp này không được sử dụng phổ biến để chiết xuất DNA từ mô sinh vật biển và các báo cáo về chiết xuất DNA từ mô tôm còn rất ít. Tuy nhiên, dựa trên những ưu điểm của phương pháp này, phương pháp Chelex-100 có thể được sử dụng cùng với các kỹ thuật khuếch đại axit nucleic để phát hiện mầm bệnh tại các trang trại nuôi tôm. Mục tiêu chính của nghiên cứu này là tối ưu hóa kỹ thuật chiết xuất DNA để giảm thời gian chiết xuất DNA và tăng hiệu quả phát hiện mầm bệnh ở tôm bằng cách kết hợp kỹ thuật chiết xuất DNA Chelex-100 với PCR real-time và ERA real-time.

Chuẩn bị nghiên cứu

Giải phẫu tôm

Tôm thẻ chân trắng (trọng lượng cơ thể trung bình 30 g, chiều dài trung bình 10 cm) được lấy từ một trang trại nuôi trồng thủy sản ở Văn Xương, Hải Nam, Trung Quốc. Tôm được mổ bằng kéo và kẹp đã khử trùng. Sau đó, các mô cơ và gan tụy được cho vào ống bảo quản lạnh, dán nhãn và bảo quản trong tủ đông 80℃.

Chiết xuất DNA Để chiết xuất DNA, 5 g Chelex-100 và 1 mL TritonX-100 được thêm vào 100 mL dung dịch đệm Tris-EDTA 1. Tiếp theo, 100 mL dung dịch trên được hút bằng pipet và 2 lL proteinase K tươi 20 mg/mL được thêm vào để cắt enzym các histon liên kết với axit nucleic để DNA được giải phóng khỏi dung dịch. Sau đó, 15–30 mg mô cơ hoặc gan tụy của tôm được thêm vào, sau đó là quá trình cắt đỉnh và ly tâm trong 10 giây để trộn đều. Các mẫu được đun nóng ở 56℃ trong 20 phút trong bồn kim loại, biến tính ở 100℃ trong 8 phút trong bồn kim loại khác, sau đó làm lạnh ngay trên tủ đá trong 3 phút và khuấy trên máy dao động trong 15 giây. Sau đó, chúng được ly tâm trong 1–2 phút với tốc độ 8.000–10.000 g và phần dịch nổi được bảo quản trong tủ lạnh ở 20℃ để sử dụng sau này (Hình 1). Các thí nghiệm kiểm soát cũng được thực hiện bằng Bộ chiết xuất DNA mô sinh học biển (DP324-02, Tiangen, Trung Quốc). Cuối cùng, DNA được chiết xuất từ mô cơ tôm bằng cả hai phương pháp được trộn đều với đệm tải 10 và ddH₂O theo tỷ lệ 1:1:8 và được phát hiện thông qua điện di gel agarose 1,5%.

Hình 1. Sơ đồ quy trình chiết xuất DNA bằng phương pháp Chelex-100. 1) Chuẩn bị dung dịch: Thêm 5 g Chelex-100 và 1 mL TritonX-100 vào 100 mL đệm 1 TE; 2) Trộn mẫu: Đổ đầy 100 lL dung dịch trên và 2 lL proteinase K tươi 20 mg/mL và 15–30 mg mẫu; 3) Làm nóng mẫu: 56°C trong 20 phút và 100°C trong 8 phút; 4) Ly tâm: 10.000 g trong 2 phút.

Xác nhận các gen nội sinh trong các đoạn mồi đặc hiệu của tôm Decapod 143F (50 -TGCCTTATCAGCTNTCGATTG TAG-30) và 145R (50 -TTCAGNTTTGCAACCATACTTCCC-30) được sử dụng để khuếch đại một đoạn amplicon 848 bp của gen rRNA 18S. Hỗn hợp phản ứng PCR 25 lL được sử dụng cho mục đích này bao gồm 12,5 lL 2 Taq Master Mix Buffer (E005 Novoprotein China), 1 lL mỗi loại 10 lM primer, 1 lL DNA khuôn mẫu và 9,5 lL ddH2O. Phản ứng PCR được lập trình như sau: bước biến tính ban đầu ở 94 độ C trong 3 phút, tiếp theo là 37 chu kỳ biến tính ở 94 độ C trong 1 phút, ủ ở 55 độ C trong 1 phút và kéo dài ở 72 độ C trong 45 giây, với lần kéo dài cuối cùng ở 72 độ C trong 7 phút. Sự khuếch đại PCR sử dụng DNA được đề cập ở trên được chiết xuất từ cơ tôm và mô gan tụy làm khuôn mẫu bằng phương pháp Chelex-100 và bộ dụng cụ thương mại. Sản phẩm PCR được xác định thông qua điện di trên gel agarose 1,5%. Phản ứng PCR này được thực hiện trong hệ thống PCR Mini Amp (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ). Sự khuếch đại PCR real-time sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu decapod là 178F (50 -GGTCGGTATGGGTCAGAAGGA-30) và 228R (50 -TTGCTTTGGGCCTCATCAC-30) cho gen b-actin. Hỗn hợp phản ứng PCR real-time 20 lL bao gồm 10 lL Premix Ex Taq Buffer (RR390A Takara Nhật Bản), 0,4 lL mỗi loại 10 lM mồi, 0,2 lL đầu dò, 0,8 lL DNA khuôn mẫu và 8,2 lL ddH₂O. Phản ứng PCR real-time được lập trình như sau: bước biến tính ban đầu ở 95℃ trong 30 giây, tiếp theo là 40 chu kỳ phản ứng tuần hoàn ở 95℃ trong 10 giây và 60℃ trong 1 phút. DNA nói trên được phân lập từ mô cơ và gan tụy của tôm bằng phương pháp Chelex-100 và các bộ dụng cụ thương mại được dùng làm khuôn mẫu. Phản ứng PCR real-time được thực hiện trong hệ thống PCR real-time CFX96 Touch (Bio-Rad, Hoa Kỳ).

Tối ưu hóa thời gian ủ

Để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng, thời gian ủ được đặt ở mức 12, 14, 16, 18 và 20 phút ở 56°C để chiết xuất DNA từ mô cơ bằng phương pháp Chelex-100. DNA chiết xuất từ các thời gian ủ khác nhau này được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại gen nội sinh 18S rRNA bằng cách sử dụng các đoạn mồi 143F và 145R và hệ thống khuếch đại cùng các quy trình được mô tả ở trên. Các sản phẩm PCR thu được được phân tích bằng phương pháp điện di gel agarose 1,5%.

Kiểm tra mẫu thực tế

24 mẫu tôm được thu thập từ một trang trại ở Phúc Kiến, Trung Quốc. Các mẫu có khả năng nhiễm EHP được lấy từ ao nuôi tôm này và các mẫu có khả năng nhiễm AHPND được chuẩn bị bằng cách sử dụng xét nghiệm kích thích V. parahaemolyticus. Các mẫu V. parahaemolyticus gây bệnh được cung cấp bởi Giáo sư Lei Wang từ Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc. Các mô gan tụy được mổ bằng kéo và kẹp vô trùng. Các mô gan tụy từ 24 mẫu tôm được sử dụng để chiết xuất DNA bằng phương pháp Chelex-100 hoặc Bộ dụng cụ chiết xuất DNA mô sinh học biển (DP324-02, Tiangen, Trung Quốc). Phát hiện tác nhân gây bệnh đã được tiến hành trên các mẫu DNA của 24 con tôm này bằng cách sử dụng cả PCR real-time và ERA real-time. DNA được chiết xuất bằng cả hai phương pháp được sử dụng làm khuôn mẫu để khuếch đại PCR real-time. Các đoạn mồi của phản ứng PCR real-time để phát hiện AHPND và EHP được liệt kê trong Bảng 1. Phản ứng PCR real-time của AHPND được thực hiện trong tổng thể tích 20 lL chứa 10 lL đệm Premix Ex Taq (RR390A, Takara, Nhật Bản), 0,6 lL mỗi loại mồi 10 lM, 0,2 lL đầu dò, 0,8 lL DNA khuôn mẫu và 7,8 lL ddH₂O. Phản ứng PCR real-time của EHP được thực hiện trong tổng thể tích 25 lL chứa 12,5 lL đệm Premix Ex Taq (RR390A, Takara, Nhật Bản), 1 lL mỗi loại mồi 10 lM, 0,5 lL đầu dò, 1 lL DNA khuôn mẫu và 9 lL ddH₂O. Phản ứng PCR real-time của AHPND hoặc EHP được lập trình như sau: bước biến tính ban đầu ở 95°C trong 20 giây, tiếp theo là 40 chu kỳ phản ứng tuần hoàn ở 95°C trong 3 giây và 60°C trong 30 giây. DNA được chiết xuất bằng cả hai phương pháp được sử dụng làm khuôn mẫu cho quá trình khuếch đại ERA real-time. Các đoạn mồi được sử dụng trong ERA real-time để phát hiện AHPND hoặc EHP được liệt kê trong Bảng 1. ERA real-time của AHPND và EHP được thực hiện trong tổng thể tích 50 lL chứa 20 lL tác nhân ly giải, 2 lL mồi trước 10 lM, 2 lL mồi 10 lM, 0,6 lL đầu dò, 2 lL DNA khuôn mẫu, 2 lL chất hoạt hóa và 21,4 lL ddH₂O. Phản ứng ERA real-time của AHPND và EHP được lập trình ở 42°C trong 20 phút. Cuối cùng, để kiểm tra độ chính xác của các mẫu lâm sàng, các mẫu tôm bệnh mắc AHPND hoặc EHP đã được chọn để lặp lại thí nghiệm.

Bảng 1 Thông tin về mồi và đầu dò cho AHPND và EHP.

Kết quả

Điện di gel agarose DNA

Nồng độ DNA mô cơ được chiết xuất bằng Chelex100 là 3174,9 ng/lL và nồng độ DNA gan tụy bằng Chelex-100 là 10225,9 ng/lL. Nồng độ DNA cơ được chiết xuất bằng bộ dụng cụ thương mại là 47,4 ng/lL và nồng độ DNA gan tụy là 813,5 ng/lL. DNA chiết xuất từ mô cơ tôm đã được tiến hành điện di gel agarose bằng bộ dụng cụ thương mại và phương pháp nhựa Chelex-100. DNA được chiết xuất bằng bộ dụng cụ thương mại cho thấy một dải duy nhất, được xác định rõ trong điện di đồ, trong khi DNA được chiết xuất bằng nhựa Chelex-100 không cho thấy các dải rõ ràng và có thể nhìn thấy (Hình 2).

Hình 2. Điện di gel agarose DNA. Làn M: Dấu hiệu DL2000 (3427A, Takara, Nhật Bản); làn 1–2: khuôn mẫu là DNA của mô cơ tôm được chiết xuất bằng bộ dụng cụ thương mại; làn 3–4: khuôn mẫu là DNA của mô cơ tôm được chiết xuất bằng nhựa Chelex-100.

Xác thực gen nội sinh ở tôm

Sử dụng DNA chiết xuất từ mô cơ và gan tụy tôm với bộ dụng cụ thương mại và Chelex-100 làm khuôn mẫu, quá trình khuếch đại gen 18S rRNA qua PCR chỉ cho thấy một dải chính có vị trí chính xác (Hình 3), được xác nhận thông qua giải trình tự. Gen b-actin được khuếch đại qua PCR real-time bằng cách sử dụng DNA từ mô gan tụy tôm và cơ được chiết xuất với Chelex-100 và bộ dụng cụ thương mại làm khuôn mẫu. Giao điểm của đường cơ sở (đường ngang trong hình) và các đường cong khuếch đại cho kit–cơ, kit–gan tụy, Chelex-100–cơ và Chelex-100–gan tụy biểu thị các Ct tương ứng của chúng (chu kỳ ngưỡng). Các đường cong khuếch đại hiển thị một đỉnh nóng chảy duy nhất (Hình 4).

Tối ưu hóa thời gian ủ

Trong thời gian ủ 20 phút, dải thể hiện độ sáng tối đa, cho biết lượng sản phẩm được chiết xuất cao nhất. Do đó, 20 phút được chứng minh là thời gian ủ tối ưu (Hình 5).

Hình 3. Khuếch đại PCR gen 18S rRNA ở tôm. Làn M: Marker DL2000 (3427A, Takara, Nhật Bản); làn 1–2: khuôn mẫu là DNA của mô cơ tôm được chiết xuất bằng bộ dụng cụ; làn 3–4: khuôn mẫu là DNA của mô gan tụy tôm được chiết xuất bằng bộ dụng cụ; làn 5–6: khuôn mẫu là DNA của mô cơ tôm được chiết xuất bằng nhựa Chelex-100; làn 7–8: khuôn mẫu là DNA của mô gan tụy tôm được chiết xuất bằng nhựa Chelex-100.

Hình 4. Đường cong khuếch đại PCR real-time (A) và đường cong nóng chảy (B) của gen b-actin tôm. Các thí nghiệm được tiến hành trong ba lần lặp lại chạy độc lập

Hình 5. Tối ưu hóa thời gian ủ của nhựa Chelex-100. Làn M: Đánh dấu DL2000; làn 1–5: lần lượt là 12 phút, 14 phút, 16 phút, 18 phút và 20 phút.

Kiểm tra mẫu thực tế

Trong xét nghiệm PCR real-time, năm mẫu xét nghiệm dương tính với EHP và ba mẫu xét nghiệm dương tính với AHPND đã được phát hiện bằng cách sử dụng DNA được chiết xuất thông qua bộ dụng cụ thương mại và phương pháp chiết xuất Chelex-100. Trong xét nghiệm ERA real-time, bộ dụng cụ thương mại và phương pháp chiết xuất Chelex-100 đều phát hiện ra năm mẫu dương tính với EHP và ba mẫu dương tính với AHPND. Kết quả cho thấy tỷ lệ trùng hợp dương tính của PCR real-time và ERA real-time sử dụng DNA được chiết xuất bằng cả phương pháp Chelex-100 và bộ dụng cụ thương mại là 100%. Tất cả các mẫu tôm được xác định là dương tính với EHP hoặc AHPND đều được gửi để giải trình tự và xét nghiệm dương tính (Bảng 2 và Bảng 3). Phương pháp chiết xuất Chelex-100 chỉ mất 30 phút để chiết xuất DNA từ mô tôm, trái ngược với 3–5 giờ cần thiết khi sử dụng bộ dụng cụ thương mại. Sau đó, để xác nhận độ chính xác của xét nghiệm mẫu lâm sàng, các mẫu DNA được chiết xuất thông qua Chelex-100 từ tôm bị nhiễm AHPND và EHP đã được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR real-time và phản ứng ERA real-time, và ba lần sao chép độc lập của mỗi thí nghiệm đã được tiến hành. Kết quả cho thấy thí nghiệm có thể tái tạo được (Hình 6).

Bảng 2 So sánh giữa Kit và Chelex-100 trong việc đánh giá mẫu thực địa EHP

Bảng 3 So sánh giữa Kit và Chelex-100 trong việc đánh giá mẫu thực địa AHPND.

Hình 6. Đường cong khuếch đại PCR real-time của tôm bệnh (A), đường cong khuếch đại ERA real-time của tôm bệnh (B). Các thí nghiệm được tiến hành trong ba lần lặp lại chạy độc lập.

Thảo luận

Tôm thẻ chân trắng là loài quan trọng đối với ngành nuôi trồng thủy sản của Trung Quốc. Tuy nhiên, loài này phải đối mặt với các mối đe dọa gây bệnh nghiêm trọng. Do đó, việc thiết lập một hệ thống phát hiện mầm bệnh tôm chính xác và thuận tiện là điều bắt buộc. Công nghệ phát hiện mầm bệnh tôm đang trở nên hoàn thiện hơn, với các phương pháp phát hiện phân tử axit nucleic là phương tiện chính để phát hiện mầm bệnh. Trong những năm gần đây, công nghệ PCR real-time và khuếch đại đẳng nhiệt đã có những tiến bộ nhanh chóng. Chiết xuất DNA đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát hiện mầm bệnh và do đó, phương pháp chiết xuất DNA nhanh chóng, hiệu quả và thuận tiện là rất quan trọng để tăng cường hệ thống phát hiện mầm bệnh tôm nói chung. Phương pháp chiết xuất DNA phổ biến nhất để phân tích mầm bệnh tôm là sử dụng bộ dụng cụ thương mại. Tuy nhiên, hầu hết các bộ dụng cụ DNA thương mại hiện có đều yêu cầu nhiều bước để tách axit nucleic, dẫn đến việc chuyển mẫu thường xuyên và khả năng nhiễm bẩn DNA. Các quy trình phức tạp này có thể làm giảm độ chính xác của việc phát hiện tác nhân gây bệnh. Ngược lại, phương pháp Chelex-100 chỉ yêu cầu năm bước để chiết xuất DNA từ mô và quá trình này mất khoảng 30 phút và chỉ sử dụng ba thuốc thử để xử lý mô.

Nghiên cứu này đã sử dụng Chelex-100 và các bộ dụng cụ thương mại để chiết xuất DNA từ mô cơ và gan tụy của tôm. Kết quả cho thấy nồng độ DNA được chiết xuất bằng phương pháp Chelex-100 khác biệt đáng kể so với nồng độ được chiết xuất bằng phương pháp bộ dụng cụ. Mặc dù phát hiện được nồng độ DNA cao hơn khi sử dụng phương pháp Chelex-100, nhưng phương pháp Chelex-100 là phương pháp chiết xuất DNA thô sơ hơn, dẫn đến việc đưa nhiều chất gây ô nhiễm vào sản phẩm chiết xuất. Phương pháp bộ dụng cụ thương mại chiết xuất DNA ở nồng độ thấp hơn, nhưng nhiều bước chiết xuất dẫn đến độ tinh khiết của DNA cao hơn. Tuy nhiên, chi phí để có được DNA có độ tinh khiết cao hơn là mất nhiều thời gian. Kết quả cho thấy điện di gel agarose không hiển thị các dải rõ ràng và có thể nhìn thấy. Điều này có thể là do Chelex-100 là phương pháp thô sơ để chiết xuất DNA. Tuy nhiên, DNA được chiết xuất bằng phương pháp này vẫn có thể được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Khi các sản phẩm trên được sử dụng để xác nhận các gen tham chiếu bên trong tôm, kết quả là chính xác. Đường cong khuếch đại PCR real-time của Chelex-100– cơ và Chelex-100–gan tụy tạo ra kết quả kém thuận lợi hơn khi khuếch đại gen b-actin, có thể là do tác dụng ức chế của nhựa Chelex-100. Khi các mẫu lâm sàng được thử nghiệm sau đó, DNA gan tụy được chiết xuất bằng bất kỳ phương pháp nào đều phát hiện chính xác tỷ lệ mắc bệnh ở tôm. Do đó, mặc dù chất lượng DNA được chiết xuất bằng phương pháp Chelex-100 không tốt bằng bộ dụng cụ thương mại, nhưng nó không ảnh hưởng đến độ chính xác của việc phát hiện tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, nó làm cho quá trình phát hiện tác nhân gây bệnh nhanh hơn và thuận tiện hơn, rút ngắn đáng kể thời gian chiết xuất DNA. Người ta đã chứng minh rằng chất lượng của DNA có thể được cải thiện sau khi chiết xuất bằng nhựa Chelex-100 thông qua quá trình kết tủa trước bằng amoni axetat và huyền phù lại bằng đệm Tris-EDTA. Phương pháp này được kỳ vọng sẽ hiệu quả hơn.

Trong quá trình chiết xuất DNA, nhiều điều kiện khác nhau có thể ảnh hưởng đến chất lượng chiết xuất. Do đó, cần tối ưu hóa thêm các thông số của phương pháp Chelex-100 để nâng cao chất lượng DNA được chiết xuất. Người ta cho rằng độ pH, nhiệt độ và thời gian ủ rất quan trọng đối với hiệu quả của quá trình chiết xuất DNA. Do đó, trong khi vẫn duy trì hiệu quả về thời gian, chúng tôi đã tối ưu hóa thời gian ủ của phương pháp Chelex-100 bằng cách thử nghiệm thời lượng 12, 14, 16, 18 và 20 phút. Có thể việc tăng thời gian ủ có thể mang lại kết quả chiết xuất tốt hơn, nhưng nó cũng có thể làm giảm hiệu quả phát hiện tác nhân gây bệnh. Do đó, chúng tôi đã chọn không kéo dài thời gian ủ thêm nữa. Chúng tôi đã sử dụng các thời gian ủ được tối ưu hóa này làm khuôn mẫu để khuếch đại gen tham chiếu bên trong rRNA 18S và sau đó phát hiện các sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di gel agarose 1,5%. Phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng thời gian ủ trong 20 phút tạo ra các dải sáng nhất, cho thấy chiết xuất được nhiều sản phẩm nhất. Do đó, 20 phút được khuyến nghị là thời gian ủ tối ưu.

Trong quá trình thử nghiệm các mẫu lâm sàng, việc chiết xuất thành công các mẫu DNA gan tụy từ tôm bị nhiễm VpAHPND và EHP đã được xác nhận bằng các kỹ thuật PCR real-time và ERA real-time để phát hiện chính xác các tác nhân gây bệnh. Kết quả xét nghiệm cuối cùng phù hợp với kết quả tìm thấy khi sử dụng phương pháp chiết xuất Chelex-100 và bộ dụng cụ. Kết quả cho thấy Mẫu 7 tạo ra kết quả dương tính giả trong xét nghiệm ERA real-time khi sử dụng DNA được chiết xuất thông qua phương pháp Chelex-100 làm khuôn mẫu. Điều này có thể là do nhiễm bẩn do xử lý không đúng cách. Tuy nhiên, phương pháp chiết xuất Chelex-100 có hiệu quả trong việc phát hiện tác nhân gây bệnh tại các trang trại nuôi tôm.

Kết luận

Nghiên cứu này trình bày một phương pháp nhanh chóng để chiết xuất DNA từ cơ tôm hoặc mô gan tụy bằng nhựa Chelex-100; toàn bộ quá trình chỉ mất 30 phút. Người ta xác định rằng thời gian ủ lý tưởng khi chiết xuất DNA bằng phương pháp này là 20 phút. Chúng tôi đã tiến hành các xét nghiệm phát hiện tác nhân gây bệnh bằng cách sử dụng DNA được chiết xuất bằng cả nhựa Chelex-100 và bộ dụng cụ thương mại. Kết quả thu được từ cả hai phương pháp đều phù hợp. Tóm lại, phương pháp chiết xuất Chelex-100 là phương pháp hiệu quả với hiệu suất chiết xuất cao và vận hành đơn giản, phù hợp để phát hiện mầm bệnh trên tôm tại thực địa.

Theo Haoran Yang, Qingqian Zhou, Jingjie Hu, Zhenmin Bao, Mengqiang Wang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0717345824000125

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức