Kết quả của nghiên cứu cho thấy phân tôm có thể là một con đường gây truyền nhiễm.

Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của các mức độ mặn khác nhau đối với sự lây nhiễm của vi bảo tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trên tôm thẻ chân trắng trong điều kiện thí nghiệm. Kết quả cho thấy rằng các chuỗi phân tôm (ảnh chụp phân trắng trong ruột tôm) có thể là một con đường gây bệnh truyền nhiễm và nhiễm trùng EHP có thể xảy ra ở độ mặn 2 ppt, nhưng mức độ lây lan và nghiêm trọng lại cao hơn ở độ mặn 30 ppt.

Bệnh nhiễm khuẩn gan tụy – Hepatopancreatic Microsporidiosis (HPM), do vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) gây ra, đã được báo cáo ở một số họ tôm He, bao gồm cả tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (P. vannamei). EHP đã được báo cáo ở nhiều khu vực khác nhau, bao gồm các nước Châu Á như Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, Việt Nam, Thái Lan và Ấn Độ. Gần đây, EHP cũng đã được báo cáo ở Venezuela, quốc gia nằm ở bán cầu tây.

EHP gây tổn thương ở tế bào biểu mô ống gan tụy (HP), và các dấu hiệu lâm sàng chính của nó là chậm phát triển, dẫn đến sự thay đổi kích thước ngày càng xảy ra nhiều. Các chuỗi phân trắng nổi trên bề mặt nước ao cùng với sự biến đổi sang màu trắng ở đường tiêu hóa (GI) cũng có liên quan đến EHP. Trong giai đoạn bệnh nặng, tôm bị nhiễm EHP thường có biểu hiện mềm vỏ, lờ đờ, giảm ăn, bỏ ăn và thậm chí là chết.

Ở các quốc gia đã có sự xuất hiện của EHP như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam và Venezuela, việc nuôi tôm được thực hiện ở các điều kiện môi trường khác nhau như vùng ven biển, vùng cửa sông và vùng nội địa. Ví dụ, ở một số bang phía đông của Ấn Độ, như Andhra Pradesh, họ sử dụng các ao chứa đầy nước giếng khoan pha với nước cửa sông, khiến độ mặn của các ao nuôi thương phẩm dao động trong khoảng từ 0-30 ppt, độ mặn trung bình khoảng 10 ppt. Ngược lại, ở các bang nằm ở phía tây như Gujarat, độ mặn có thể thay đổi từ 30-44 ppt. Ở tây bắc Venezuela, một số trang trại nuôi tôm nằm xung quanh hồ Maracaibo có độ mặn dao động từ 2-5 ppt, trong khi ở đông bắc Venezuela, các trang trại nuôi tôm nằm trong môi trường biển có độ mặn dao động từ 20-40 ppt, và EHP đã được báo cáo trong cả môi trường có độ mặn cao và thấp. Ở cả hai quốc gia này, tỷ lệ mắc EHP dường như cao hơn trong môi trường có độ mặn cao, nhưng cho đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá mối quan hệ có thể có giữa độ mặn và sự hiện diện của EHP.

Bài báo này – được chỉnh sửa và tóm tắt từ bài báo gốc (Aranguren Caro, L.F. và cộng sự, 2021. Ảnh hưởng của độ mặn đối với nhiễm khuẩn Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei trong điều kiện thí nghiệm. BMC Vet Res 17, 65 (2021)] – báo cáo về kết quả của một nghiên cứu so sánh khả năng lây nhiễm của EHP bằng cách sử dụng các chuỗi phân làm chất cấy ở 3 độ mặn khác nhau trong các điều kiện thí nghiệm.

Thiết lập nghiên cứu

Các xét nghiệm sinh học được thực hiện trong Phòng thí nghiệm Bệnh học Nuôi trồng Thủy sản (UA-APL) của Đại học Arizona. Tôm thẻ P. vannamei không có mầm bệnh cụ thể (SPF) được lấy từ một nhà cung cấp thương mại ở Florida, Hoa Kỳ. Quần thể SPF đã được sàng lọc trong 2 năm qua tại UA-APL mà không có bất kỳ bệnh nào được liệt kê, kể cả trong những mầm bệnh được liệt kê bởi Tổ chức Thú y Thế giới (OIE), bao gồm cả EHP.

Dòng EHP được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ quần thể tôm thẻ P. vannamei có nguồn gốc ở Thái Lan. Hai thử nghiệm độc lập cảm nhiễm với EHP đã được thực hiện. Trong cả hai thử nghiệm, tôm được duy trì ở 3 độ mặn khác nhau là 2, 15 và 30 ppt. Đối với mỗi thử nghiệm, 6 bể với dung tích 90 lít được đổ đầy nước biển nhân tạo tương ứng với 3 mức độ mặn, mỗi mức độ mặn được lặp lại 2 lần. Nhiệt độ đo và được điều chỉnh ở 25 độ C (± 0,6) vào mỗi buổi sáng; pH được đo mỗi tuần một lần với phạm vi 7,5-8,0.

Độ mặn được điều chỉnh bằng cách thay đổi 3 phần độ mặn mỗi giờ từ 25 ppt (độ mặn ban đầu của quần thể tôm thẻ chân trắng SPF) xuống 5 ppt. Để đạt được độ mặn 2 ppt từ 5 ppt, phần độ mặn sẽ được thay đổi sau mỗi hai giờ. Sau khi thiết lập, độ mặn được đo bằng khúc xạ kế mỗi tuần một lần trong suốt thời gian thử nghiệm. 10 con tôm thẻ P. vannamei SPF (trọng lượng 2,0-2,1 gram) được thả vào mỗi bể để cảm nhiễm với mầm bệnh. Ba bể đối chứng 90 lít được thiết lập cho mỗi độ mặn như nghiệm thức đối chứng âm.

Để biết thông tin chi tiết về thiết kế thí nghiệm và cách nuôi dưỡng; chuẩn bị chất cấy; xét nghiệm mô bệnh học và phản ứng chuỗi polymerase để phát hiện và định lượng EHP; và các phân tích thống kê, vui lòng tham khảo bài báo gốc.

Kết quả và thảo luận

Chúng tôi đã điều tra mức độ lây lan và nghiêm trọng của EHP ở 3 độ mặn: cao (30 ppt), trung bình (15 ppt) và thấp (2 ppt) trong các điều kiện thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. Các chuỗi phân trong thử nghiệm được sử dụng như một nguồn chất cấy EHP đủ để gây bệnh cho tôm được duy trì ở các độ mặn khác nhau, chúng được xác nhận thông qua xét nghiệm mô bệnh học và PCR. Kết quả từ nghiên cứu này cung cấp một phương pháp lây nhiễm EHP mới thông qua các chuỗi phân.

Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót cuối cùng cao sau khi kết thúc thử thách cảm nhiễm với vi khuẩn EHP, dao động từ 90-100% ở 3 độ mặn trong mỗi thử nghiệm (Bảng 1). Tỷ lệ sống sót trong các nghiệm thức đối chứng là 100% ở tất cả các độ mặn. Ngoài ra, chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ dấu hiệu lâm sàng nào của tôm tiếp xúc với EHP ở 3 độ mặn khác nhau.

Bảng 1

Tỷ lệ sống sót cuối cùng ở tôm thẻ P. vannamei sau khi cảm nhiễm với chuỗi phân dưới dạng chất cấy EHP trong 2 thử nghiệm độc lập ở 3 độ mặn khác nhau. Dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn.

Thử nghiệm	Thời gian	2 ppt (EHP)	2 ppt (đối chứng)	15 ppt (EHP)	15 ppt (đối chứng)	30 ppt (EHP)	30 ppt (đối chứng)
1	20 ngày	95 ± 7	100 ± 0	100 ± 0	100 ± 0	100 ± 0	100 ± 0
2	26 ngày	90 ± 0	100 ± 0	100 ± 0	100 ± 0	90 ± 7	100 ± 0

Các chuỗi phân được thu thập hàng ngày từ các bể nhiễm EHP. Các mẫu phân đều cho kết quả dương tính với EHP trong cả 2 thử nghiệm. Trọng lượng trung bình của các chuỗi phân được đưa vào mỗi bể lần lượt là 1,17 ± 0,52 gram và 0,32 ± 0,24 gram. Số bản sao EHP trong các chuỗi phân được sử dụng làm chất cấy ở thử nghiệm 2 (p <0,05) cao hơn đáng kể so với thử nghiệm 1, lần lượt là 1,6 × 10³ ± 2,1 × 10³ bản sao / ng DNA và 1,1 × 10⁶ ± 2,0 × 10⁶ bản sao / ng DNA.

Mức độ lây lan và nghiêm trọng của EHP ở tôm trong nghiên cứu được đánh giá bằng phương pháp mô học H&E. Trong cả 2 thử nghiệm, các chuỗi phân được sử dụng làm chất cấy có thể gây ra bệnh ở tôm SPF. Mức độ lây lan của EHP trong thử nghiệm 1 là 28,5% và thử nghiệm 2 là 50,0%. Dữ liệu trong nghiên cứu cho thấy rằng các chuỗi phân chắc chắn là nguồn vi khuẩn lây nhiễm EHP trong thử nghiệm.

Mức độ lây lan của EHP ở độ mặn 2, 15 và 30 ppt trong thử nghiệm 1 lần lượt là 25, 33,3 và 25%. Trong thử nghiệm 2, mức độ lây lan của EHP ở 2, 15 và 30 ppt lần lượt là 33,3, 30,0 và 87,5%. Mức độ nghiêm trọng cao hơn được nhận thấy ở độ mặn 30 ppt trong thử nghiệm 2, trong đó có khoảng 50% tôm nhiễm EHP có biểu hiện tổn thương ở mức độ G3 (từ trung bình đến nặng) và G4 (nặng) do nhiễm EHP. Chúng tôi nhận thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa độ mặn và tỷ lệ nhiễm EHP. Trong đó, tôm tiếp xúc với độ mặn cao (30 ppt) có tỷ lệ nhiễm EHP cao hơn so với độ mặn thấp (2 ppt và 15 ppt). Các mức độ nghiêm trọng khác nhau trong nghiên cứu này được thể hiện trong Hình 1.

Hình 1: Phương pháp nhuộm H&E (Mayer-Bennet hematoxylin và eosin-phloxine) trên mô gan tụy của tôm thẻ P. vannamei cho thấy các giai đoạn nhiễm EHP khác nhau (a-c: cấp 0; d-f: cấp 1; g-i: cấp 2; j-l: cấp 3; m-o: cấp 4. Bào tử trưởng thành được biểu thị bằng các ngôi sao màu xanh. Hình vuông màu đen cho thấy giai đoạn plasmodium thường xuyên-không đều điển hình. Vòng tròn màu đen hiển thị các khu vực có EHP. Hình vuông màu đỏ phóng đại các vùng có độ phóng đại thấp. Các thanh tỷ lệ nằm ở phần dưới bên phải của mỗi hình. Phỏng theo bản gốc.

Hình 1 bảng A, B và C hiển thị các phần mô của gan tụy ở độ phóng đại thấp, trung bình và cao ở tôm khỏe mạnh từ bể đối chứng mà không cho thấy bất kỳ tổn thương mô học nào của EHP hoặc bất kỳ mầm bệnh nào khác đã biết. Ngược lại, các bảng D, E và F hiển thị các phần mô của gan tụy nhiễm EHP mức độ G1. Một vùng tiêu điểm trong gan tụy đã được quan sát (Hình 1d). Phần ống bị ảnh hưởng bởi EHP cho thấy tế bào chất trong tế bào biểu mô ống gan tụy tương ứng với giai đoạn meront không nhân (Hình 1e-f). Hình 1 bảng G, H và I cho thấy mức độ G2 của EHP (từ thấp đến trung bình). Kết quả cũng quan sát thấy sự hiện diện tập trung của vi khuẩn EHP ở một số tế bào biểu mô ống gan tụy bị nhiễm. Cả hai giai đoạn meront và bào tử được giải phóng vào lòng ống đều được quan sát (Hình 1i). Hình 1 bảng J, K và L cho thấy mức độ G3 của EHP.

Sự tổn thương nghiêm trọng trong tế bào biểu mô ống gan tụy đã được quan sát (Hình 1j). Trong các ống bị ảnh hưởng, sự hiện diện của cả plasmodium đa nhân không đều và các bào tử trong tế bào chất của các tế bào biểu mô ở lớp vỏ ngoài đã được quan sát thấy (Hình 1). Hình 1 các bảng M, N và O cho thấy mức độ G4 của EHP với các ống có chứa các tế bào gan tụy bị nhiễm bệnh (Hình 1m). Cả plasmodium đa nhân và các bào tử trong tế bào chất của các tế bào bị ảnh hưởng cũng như các bào tử trong lớp sáng của các ống đều được quan sát (Hình 1o).

Gan tụy của tôm SPF được cảm nhiễm với chuỗi phân của tôm nhiễm EHP cho kết quả dương tính với EHP bằng cách sử dụng xét nghiệm Nested PCR trong tất cả các bể ở 3 độ mặn khác nhau. Điều này khẳng định sự hiện diện của EHP trong các bể thử nghiệm ở cả thử nghiệm 1 và 2. EHP được phát hiện ở cả 3 độ mặn 2, 15 và 30 ppt. Mô gan tụy của tôm ở nhóm đối chứng âm được nuôi ở độ mặn 2, 15 và 30 ppt cho kết quả âm tính với EHP thông qua xét nghiệm Nested PCR.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra một số con đường lây nhiễm bao gồm ăn chung, sống chung, và tiêm trực tiếp vào gan tụy với chất cấy chứa EHP. Trong nghiên cứu này, lần đầu tiên chúng tôi báo cáo rằng phân có thể là một con đường lây nhiễm mới. Do thói quen ăn mùn bã và sự hiện diện của thức ăn chưa tiêu hóa hết lẫn trong phân (chiếm khoảng 25–30%), tôm trong trại đã ăn phải nguồn thức ăn này cùng với các bào tử nhiễm EHP dẫn đến sự lây truyền theo chiều ngang.

Các tổn thương do EHP gây ra, bao gồm sự hiện diện của plasmodium trong tế bào chất của các tế bào bị nhiễm bệnh, và chúng tôi tìm thấy các bào tử trưởng thành trong tế bào chất hoặc các bào tử được giải phóng trong lòng bằng mô bệnh học ở tôm bị nhiễm EHP được nuôi ở các độ mặn khác nhau. Điều này cho thấy rằng EHP có thể xảy ra ở nhiều độ mặn, dao động từ 2-30 ppt. Khi chất cấy ban đầu được sử dụng cho thử nghiệm thấp (tức là 1 × 10³ bản sao EHP / ng của tổng số DNA trong phân), tỷ lệ nhiễm HPM là 25% bất kể độ mặn.

Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm EHP tăng ở độ mặn 30 ppt (mức độ lây lan 87,5%), so với 15 ppt (mức độ lây lan 30,0%) và độ mặn 2 ppt (mức độ lây lan 33,3%), khi mức chất cấy được tăng từ 1 × 10³ lên 1 × 10⁶ bản sao EHP / ng của tổng số DNA trong phân trong thử nghiệm 2. Các thử nghiệm cảm nhiễm phụ thuộc vào liều lượng đã được ghi nhận rõ ràng đối với các mầm bệnh tôm khác như AHPND và Hepatobacter penaei. Trong nghiên cứu này, chất cấy có số lượng bản sao thấp (1,6 × 10³ bản sao EHP / ng của tổng số DNA trong phân) được sử dụng trong thử nghiệm 1 đã gây ra nhiễm trùng nhẹ ở tôm. Tuy nhiên, các trường hợp nhiễm trùng nặng (mức độ G3-G4) và tỷ lệ hiện mắc bệnh cao hơn xảy ra ở thử nghiệm 2 khi số lượng bản sao EHP trong chất cấy tăng (1,1 × 10⁶ bản sao EHP / ng của tổng số DNA trong phân).

Các tổn thương mô học ở tôm được duy trì ở độ mặn 30 ppt có mức độ nghiêm trọng hơn. Mức độ nhiễm bệnh từ trung bình đến nặng (G3-G4) được tìm thấy ở 50% số tôm bị nhiễm. Ngược lại, chỉ 16% tôm nuôi ở độ mặn 2 ppt cho thấy mức độ nhiễm bệnh cấp G3 và 0% tôm nuôi ở độ mặn 15 ppt cho thấy mức độ nhiễm bệnh cấp G2-G4. Sự khác biệt về mức độ nghiêm trọng của nhiễm EHP ở ba độ mặn khác nhau có lẽ là do ảnh hưởng khác nhau của độ mặn đối với sự nảy mầm của bào tử. Một trong những giai đoạn quan trọng trong quá trình nảy mầm của bào tử là sự gia tăng áp suất thẩm thấu trong bào tử. Sự khác biệt về độ mặn dẫn đến môi trường nhược trương (nồng độ thấp hơn) ở 2 ppt và 15 ppt so với môi trường ưu trương (nồng độ cao hơn) ở 30 ppt. Có thể môi trường ưu trương tăng cường sự nảy mầm của bào tử bằng cách tăng quá trình hoạt hóa của bào tử.

Độ cứng là một yếu tố khác được sử dụng trong nghiên cứu này và nó có ảnh hưởng đến sự nảy mầm của bào tử. Độ cứng ở độ mặn thấp (2 ppt) là khoảng 240 mg/L so với nước biển nhân tạo được chuẩn bị ở 15 ppt và 30 ppt lần lượt là 787 và 1.575 mg/L. Canxi đã được báo cáo là chất truyền tin thứ hai quan trọng kích hoạt nhiều tế bào và dòng canxi có thể một phần là nguyên nhân kích hoạt bào tử microsporidian ở độ mặn cao hơn.

Trong các ao nuôi thương phẩm của một số khu vực nhiễm EHP ở Châu Á, điều kiện độ mặn được tìm thấy rất khác nhau. Ví dụ, ở Ấn Độ có một số khu vực nuôi tôm ở độ mặn cao và thấp, và tỷ lệ nhiễm EHP dường như thấp hơn ở độ mặn thấp (dưới 5 ppt), điều này được báo cáo trong một cuộc khảo sát về bệnh tôm ở Andhra Pradesh vào năm 2019. Các dữ liệu tương tự cũng đã được ghi nhận tại hai khu vực nuôi tôm chính ở Venezuela, là hồ Maracaibo, nơi có độ mặn khoảng 4–6 ppt và bang Falcon, nơi có độ mặn thay đổi từ 36-40 ppt. Ở Venezuela, việc nuôi tôm chưa được tích hợp hoàn toàn, và việc di chuyển của nauplii và postlarvae giữa Falcon và khu vực hồ Maracaibo là một thực tế phổ biến. Điều này cho thấy rằng tôm post và / hoặc tôm bố mẹ đã được di chuyển giữa hai khu vực này đã bị nhiễm EHP. Tuy nhiên, EHP mới chỉ được phát hiện ở khu vực Falcon, nơi có độ mặn cao. Ở hồ Maracaibo, nơi có độ mặn thấp, EHP chưa được báo cáo. Một khả năng đã hạn chế sự lây lan của EHP có thể là sự khác biệt về độ mặn của nước.

Kết luận

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã chứng minh rằng các chuỗi phân từ tôm nhiễm EHP có thể được sử dụng như một nguồn chất cấy đáng tin cậy để tiến hành các thử nghiệm cảm nhiễm EHP qua đường phân. Sự lây nhiễm EHP có thể xảy ra ở độ mặn thấp (2 ppt) mặc dù tỷ lệ nhiễm và mức độ nghiêm trọng của bệnh cao hơn ở độ mặn 30 ppt. Những phát hiện này có ý nghĩa trong việc quản lý dịch bệnh ở các khu vực có sự xuất hiện của EHP.

Theo Tiến sĩ Luis Fernando Aranguren Caro, F. Alghamdi, K. De Belder, J. Lin, H.N. Mai, J. Millabas, Y. Alrehaili, A. Alazwari, S. Algetham và Tiến sĩ Arun K. Dhar.

Nguồn: https://www.globalseafood.org/advocate/how-salinity-levels-impact-ehp-infection-rates-in-pacific-white-shrimp/

Biên dịch: Huyền Thoại – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

• Ảnh Hưởng Của Vi Tảo Scenedesmus Đến Tôm Thẻ Chân Trắng Và Cá Rô Phi Sông Nile Trong Môi Trường Biofloc
• Bột Mì Và Mật Đường, Đâu Sẽ Là Chất Nền Tốt Hơn Trong Hệ Thống Biofloc?
• Phụ Phẩm Tái Chế Từ Thức Ăn Chăn Nuôi Có Tiềm Năng Dinh Dưỡng Trong Nuôi Trồng Thủy Sản