Vai trò của hormone tập trung sắc tố đỏ trong việc điều hòa hệ thống thần kinh nội tiết cuống mắt ở cua bùn Scylla paramamosain

Tóm tắt

Cuống mắt là cơ quan thần kinh nội tiết chiếm ưu thế ở giáp xác, tổng hợp họ hormone tăng đường huyết giáp xác (CHH) tham gia vào các hoạt động sinh lý như phát triển buồng trứng, cân bằng glucose và lột xác. Hormone tập trung sắc tố đỏ (RPCH) góp phần vào sự đa dạng của các ảnh hưởng sinh lý, bao gồm cả sự phát triển buồng trứng; tuy nhiên, vai trò của nó trong việc điều chỉnh các neuropeptide họ CHH trong cuống mắt vẫn chưa rõ ràng. Nghiên cứu này đã mô tả thụ thể RPCH (RPCHR) ở cua bùn Scylla paramamosain và phát hiện ra rằng nó được biểu hiện trong nhiều loại mô, bao gồm cả cuống mắt. Việc sử dụng peptide RPCH trưởng thành trong cơ thể sống đã hạn chế đáng kể biểu hiện hormone ức chế sinh noãn hoàng (VIH) và tăng cường đáng kể biểu hiện gen RPCHR, hormone tăng đường huyết giáp xác (CHH) và hormone ức chế lột xác (MIH), trong khi ngược lại, tiêm RPCH-dsRNA trong cơ thể sống để hạ gục đã làm tăng đáng kể biểu hiện VIH và làm giảm biểu hiện RPCHR, CHH và MIH trong cuống mắt. Nghiên cứu này báo cáo toàn diện rằng RPCH có thể điều chỉnh quá trình trưởng thành của buồng trứng, cân bằng glucose và lột xác ở S. paramamosain thông qua điều chế neuropeptide họ CHH trong cuống mắt.

1. Giới thiệu

Hormone tập trung sắc tố đỏ (RPCH), paralog của hormone giải phóng gonadotropin (GnRH) (Alexander và cộng sự, 2018), là một trong những hormone quan trọng nhất trong họ tác nhân sắc tố, kiểm soát những thay đổi về màu sắc của lớp biểu bì và chuyển động của các hạt sắc tố ở giáp xác, cũng như tăng độ nhạy cảm của võng mạc, nâng cao lượng đường trong máu, nhịp sinh học và thúc đẩy sự trưởng thành của tuyến sinh dục (Zeng và cộng sự, 2016; Alexander và cộng sự, 2018; Wei và cộng sự, 2021). Cho đến nay, hơn 50 loại peptide RPCH đã được phát hiện ở côn trùng và giáp xác, bao gồm cua bờ xanh Carcinus maenas, cua bùn cam Scylla olivacea, cua xanh Callinectes sapidus, tôm sú Penaeus monodon và tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei, và một số octapeptide được xác định ở nhiều loài giáp xác khác nhau có cùng trình tự (pQLNFSPGWamide), cho thấy cấu trúc được bảo tồn cao ở giáp xác (Martínez-Perez và cộng sự, 2005; Kornthong và cộng sự, 2013; Alexander và cộng sự, 2018). RPCH thuộc họ peptide hormone sinh mỡ (AKH)/RPCH và các protein tiền thân của nó đều mã hóa một peptide tín hiệu, một peptide liên kết với RPCH và một peptide trưởng thành RPCH (Glu-Leu-Asn-Phe-Ser-Pro-Gly-Trp) (Zeng và cộng sự, 2016; Martínez-Perez và cộng sự, 2005). RPCH chủ yếu được tổng hợp bởi phức hợp tuyến X-cơ quan xoang (XO-SG) trong hạch cuống mắt và phân bố rộng rãi ở các vùng chính của hệ thần kinh trung ương (CNS) giáp xác, bao gồm hạch bụng, hạch ngực và não, cũng như tủy ngoài, tủy trong và tủy tận cùng trong hạch cuống mắt (Zeng và cộng sự, 2016; Kornthong và cộng sự, 2013; Martínez-Perez và cộng sự, 2005), cho thấy rằng nó thực hiện nhiều chức năng. Ví dụ, RPCH làm tăng nồng độ glucose trong huyết tương của loài rận gỗ thô thông thường Porcellio scaber bằng cách huy động các kho dự trữ năng lượng (Zrala và cộng sự, 2010; Harlıoglu và cộng sự, 2020). Một hiện tượng tương tự cũng đã được xác định ở C. maenas, tức là RPCH có thể điều chỉnh tình trạng tăng đường huyết bằng cách liên kết với thụ thể RPCH (RPCHR) (Alexander và cộng sự, 2018). Việc sử dụng RPCH trong cơ thể sống có hiệu quả trong việc thúc đẩy quá trình trưởng thành giảm phân của trứng ở cua đồng Trung Quốc Eriocheir japonica (Wei và cộng sự, 2021). Ở tôm càng xanh Procambarus clarkii, RPCH hoạt động gián tiếp như một chất dẫn truyền thần kinh kích thích giải phóng hormone kích thích sinh dục (GSH) ở não và hạch ngực hoặc thúc đẩy sự phát triển của buồng trứng bằng cách đẩy nhanh quá trình tổng hợp methyl farnesoate (MF) ở cơ quan hàm dưới (Sarojini và cộng sự, 1995). Tiêm RPCH góp phần làm tăng đáng kể nồng độ hemolymph vitellogenin (Vg), biểu hiện Vg buồng trứng và đường kính tế bào trứng, dẫn đến tác động tích cực đến sự phát triển buồng trứng của L. vannamei (Chen và cộng sự, 2018). Tuy nhiên, tác động của RPCH trong cuống mắt giáp xác cần được nghiên cứu thêm.

Ở giáp xác, phức hợp XO-SG là hệ thống điều hòa thần kinh nội tiết thiết yếu, tương tự như hệ thống dưới đồi-tuyến yên ở động vật có xương sống, điều hòa sự phát triển buồng trứng, lột xác, lượng đường trong máu và cân bằng thẩm thấu bằng cách tổng hợp, lưu trữ và giải phóng một họ các hormone tăng đường huyết ở giáp xác (CHH), chẳng hạn như hormone ức chế sinh noãn hoàng (VIH), hormone tăng đường huyết ở giáp xác (CHH), peptide vận chuyển ion (ITP), hormone ức chế cơ quan hàm dưới (MOIH) và hormone ức chế lột xác (MIH) (Liu và cộng sự, 2018; Chen và cộng sự, 2020). 5-hydroxytryptamine, dopamine, allatostatin loại A (AST-A) và neuropeptide F ngắn (sNPF) có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý thông qua việc điều chỉnh họ CHH (Lorenzon và cộng sự, 2005; Wang và cộng sự, 2023, 2022). Tuy nhiên, sự đóng góp của RPCH vào họ CHH ở hạch cuống mắt vẫn còn khiêm tốn và cần được nghiên cứu thêm.

Cua bùn Scylla paramamosain chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và ôn đới ấm của miền nam Trung Quốc và khu vực Ấn Độ Dương – Thái Bình Dương, là một trong những loài giáp xác quan trọng được đánh bắt và nuôi trồng kinh tế cho nghề cá xa bờ ở Trung Quốc và Đông Nam Á (Ye và cộng sự, 2011). Sản lượng hàng năm hiện tại đạt 154.661 tấn, đứng đầu Trung Quốc về sản lượng nuôi trồng giáp xác biển (Cục Thủy sản và Quản lý Nghề cá, 2023). Các neuropeptide họ CHH như VIH, MIH và CHH (ba dạng đồng phân: CHH1, CHH2 và CHH3) đã được đặc trưng từ cuống mắt S. paramamosain và tham gia vào quá trình điều hòa quá trình sinh noãn hoàng, lột xác và nồng độ glucose ở loài này (Liu và cộng sự, 2018, 2019; Huang và cộng sự, 2015). Với nhu cầu ngày càng tăng đối với S. paramamosain, việc cắt bỏ cuống mắt thường được thực hiện để làm bất hoạt VIH nhằm kích thích sự phát triển của buồng trứng (Liu và cộng sự, 2018). Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các kỹ thuật thay thế để tránh một số hiện tượng sinh lý không mong muốn liên quan đến việc cắt bỏ cuống mắt, chẳng hạn như giảm khả năng nở và tỷ lệ đẻ trứng, tăng tỷ lệ chết (Liu và cộng sự, 2018). Ở S. paramamosain, sNPF-dsRNA, AST-dsRNA và microRNA (miR-277) đã được báo cáo là thúc đẩy quá trình hình thành noãn hoàng (Wang và cộng sự, 2023, 2022; Jia và cộng sự, 2021). Peptide RPCH trưởng thành trong S. paramamosain bao gồm 8 gốc axit amin, có trọng lượng phân tử thấp và dễ tổng hợp (Zeng và cộng sự, 2016), do đó có tiềm năng ứng dụng trong việc phát triển một kỹ thuật cắt bỏ cuống mắt thay thế. Để minh họa chức năng của RPCH trong họ CHH của cuống mắt S. paramamosain, trình tự thụ thể RPCH đã được nhân bản từ S. paramamosain và mô hình biểu hiện của nó đã được mô tả bằng cách sử dụng PCR phiên mã ngược (RT-PCR). Ngoài ra, chức năng điều hòa của RPCH trên các peptide họ CHH trong cuống mắt đã được nghiên cứu bằng cách làm im lặng RPCH bằng sự can thiệp của RNA sợi đôi (dsRNA). Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng đầu tiên cho thấy RPCH có liên quan đến nhiều hoạt động nội tiết khác nhau ở S. paramamosain bằng cách điều hòa các neuropeptide họ CHH trong cuống mắt và thúc đẩy quá trình sinh noãn hoàng bằng cách ức chế biểu hiện VIH, dự kiến sẽ góp phần khai thác một kỹ thuật cắt bỏ cuống mắt thay thế ở giáp xác.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Thu thập mẫu và thuốc thử hóa học

Cua S. paramamosain cái khỏe mạnh (42,37 ± 0,15 g) ở giai đoạn giữa quá trình lột xác được mua từ chợ thủy sản địa phương tại quận Haicang, thành phố Hạ Môn, tỉnh Phúc Kiến, Trung Quốc. Cua được thích nghi trong các bể riêng biệt chứa nước biển sục khí có độ mặn 29 ± 1 ppt và nhiệt độ 28 ± 0,5℃ trong một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm. Trong quá trình thích nghi, ốc đồng tươi (Cipangopaludina chinensis) nặng khoảng 5% cua được cho ăn một lần một ngày và nước trong bể được thay mới một nửa ngày.

Một cysteine được thêm vào đầu carboxyl của amid hóa peptide trưởng thành RPCH (pGlu-Leu-Asn-Phe-Ser-Pro-Gly-Trp-NH2), được tổng hợp tại GL Biochem Ltd. (Thượng Hải, Trung Quốc), với độ tinh khiết là 99,87%.

2.2 Phân lập RNA và tổng hợp cDNA sợi đầu tiên

Tổng RNA được lấy từ cuống mắt, hạch não, hạch ngực, cơ quan hàm dưới, buồng trứng, cơ, tế bào máu, mang, biểu bì, gan tụy, dạ dày và ruột giữa bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nồng độ RNA được đo bằng máy quang phổ Q6000 (Quawell) và tính toàn vẹn được đánh giá bằng điện di gel agarose 1,5% (w/v). cDNA sợi đầu tiên được đặc trưng bằng PCR phiên mã ngược (RT-PCR) với bộ dụng cụ PrimeScript™ RT (TaKaRa) được trang bị gDNA Eraser.

2.3 Nhân bản phân tử, tin sinh học và phát sinh loài của RPCHR

Trình tự cDNA một phần của RPCHR được tạo ra từ bản sao mã của S. paramamosain và sau đó được xác nhận bằng cách thiết kế các đoạn mồi đặc hiệu. Tất cả các đoạn mồi được sử dụng trong nghiên cứu này đều được liệt kê trong Bảng 1. Trình tự ORF và amino acid (aa) được ước tính bằng phần mềm DNAMan, và trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện lý thuyết (pI) được đánh giá bằng công cụ trực tuyến ExPASy-ProtParam (http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam ). Các miền cấu trúc bảo tồn protein được dự đoán bằng công cụ phân tích trực tuyến NCBI Conserved Domains (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi ). Các miền cấu trúc xuyên màng được dự đoán bằng công cụ TMHMM (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ ) và căn chỉnh nhiều trình tự được thực hiện bằng ClustalX2.0 và GeneDoc. Cây phát sinh loài được thiết lập bằng phương pháp neighbor-joining với 1000 lần lặp bootstrap sử dụng phần mềm MEGA 7.0. Cấu trúc ba chiều (3D) được dự đoán bằng SWISS-MODEL và các miền cấu trúc protein được vẽ sơ đồ bằng phần mềm DOG_2.0.1.

Bảng 1 Tất cả các mồi được sử dụng trong nghiên cứu này.

2.4 Phân bố mô của mRNA RPCHR

Mẫu biểu hiện của RPCHR trong 12 mô (hạch cuống mắt, hạch não, hạch ngực, cơ quan hàm dưới, buồng trứng, cơ, tế bào máu, mang, biểu bì, gan tụy, dạ dày và ruột giữa) đã được nghiên cứu bằng RT-PCR sử dụng RPCHR -F/R làm mồi. Đồng thời, β-actin được mở rộng với mồi β-actin-F/β-actin-R làm tham chiếu nội bộ. Sử dụng ddH₂O làm đối chứng âm tính, tất cả các đoạn mồi được trình bày trong Bảng 1. PCR được thực hiện với DNA polymerase Ex-Taq^® hiệu suất cao (Takara) như sau: biến tính trước 3 phút ở 95℃, 33 chu kỳ 95℃ trong 10 giây, 60℃ trong 35 giây và 72℃ trong 35 giây và khuếch đại thêm ở 72℃ trong 8 phút. Các phân đoạn PCR được tách trên gel agarose 1,0%, quan sát và chụp ảnh bằng máy chụp ảnh gel UV.

2.5 Tiêm peptide trưởng thành RPCH

40 con cua được tách nhanh thành hai nhóm ở giai đoạn tiền vitellogenic. Nhóm được điều trị bằng RPCH được dùng 10 ng/g trọng lượng cơ thể peptide trưởng thành tổng hợp bằng RPCH hòa tan trong dung dịch muối sinh lý giáp xác (CPS) (nồng độ cuối cùng trong huyết tương là ~ 5 × 10^-6 mol/L), và nhóm đối chứng được truyền cùng một thể tích CPS. Nó được sử dụng làm đối chứng đo lường ban đầu cho bốn con cua chưa được điều trị. Tất cả các lần tiêm đều được thực hiện từ màng đáy của chân bơi. Các mẫu Cuống mắt được lấy từ bốn con cua tại các thời điểm cụ thể (0 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ và 24 giờ) và được sử dụng để chuẩn bị RNA. Sau đó, các gen của họ neuropeptide CHH được định lượng bằng PCR định lượng thời gian thực (qRT-PCR) bằng cách sử dụng các đoạn mồi được liệt kê trong Bảng 1.

2.6 Tiêm RPCH dsRNA

Các đoạn mồi đặc hiệu RPCH dsRNA RPCH-dsRNA-F/R (Bảng 1) được hình thành bởi SnapDragon-dsRNA Design (https://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl), trong khi đó, gen protein huỳnh quang xanh (GFP) được dùng làm gen điều khiển ngoại sinh. Mục tiêu dsRNA được phiên mã bằng polymerase T7 và SP6 (Roche, Mannheim, Đức), sau đó tiêm RPCH dsRNA vào cua. S. paramamosain được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm: tiêm RPCH dsRNA (5 μg/g; n = 5), tiêm GFP dsRNA (5 μg/g; đối chứng âm tính; n = 5) và tiêm CPS (kiểm soát dung môi; n = 5). Tất cả các lần tiêm đều được thực hiện từ màng đáy của chân bơi. Hai mũi tiêm được thực hiện cách nhau 24 giờ và Cuống mắt được lấy mẫu 48 giờ sau mũi tiêm đầu tiên. Các gen họ neuropeptide CHH trong Cuống mắt được định lượng bằng qRT-PCR.

2.7 qRT-PCR

Phân tích qRT-PCR được thực hiện trên hệ thống qPCR ABI 7500 sử dụng 2 × SYBR Select Master Mix (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) và theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Điều kiện chu kỳ qPCR: biến tính 94℃ trong 5 phút, sau đó là 40 chu kỳ: 94℃ (15 giây), 60℃ (30 giây), 72℃ (35 giây) (thu huỳnh quang) và cuối cùng là kéo dài ở 72℃ trong 10 phút. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện trong ba bản sao kỹ thuật và các giá trị biểu hiện được chuẩn hóa với gen tham chiếu β-actin.

2.8 Phân tích thống kê

Dữ liệu qRT-PCR được tính toán bằng thuật toán 2^−ΔΔCt và tất cả dữ liệu được biểu thị là giá trị trung bình ± SEM. Kiểm định tính chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng kiểm định Shapiro-Wilk với hiệu chỉnh Lilliefors và kiểm định tính đồng phương sai dựa trên kiểm định Levene. Sau đó, các khác biệt thống kê giữa các nhóm được phân tích bằng ANOVA một chiều (sau đó là kiểm định Duncan) hoặc kiểm định Student t-test (SPSS 16.0). Các khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,05 và rất có ý nghĩa ở mức P < 0,01.

3. Kết quả

3.1 Phân tích trình tự và nhân bản cDNA của RPCHR

Trình tự cDNA RPCHR của S. paramamosain là 2426 bp, bao gồm ORF 1443 bp mã hóa tiền chất 481 axit amin, với trọng lượng phân tử được tính toán là 54,21 kDa và điểm đẳng điện lý thuyết là 8,74 (Hình 1). Phân tích máy chủ dự đoán xuyên màng TMHMM cho thấy nó có 7 cấu trúc xuyên màng (Hình 1, 2A, B, C) và phân tích tương đồng chỉ ra rằng protein này thuộc họ thụ thể liên kết với protein G (Hình 2A, B, C).

Hình 1. Nucleotide và trình tự amino acid suy ra của RPCHR trong Scylla paramamosain. Đường màu đỏ liền chỉ ra cấu trúc xuyên màng. In đậm cho thấy codon khởi đầu và codon dừng. * – codon dừng.

Hình 2. Xác định và mô tả đặc điểm của RPCHR ở Scylla paramamosain.

3.2 Phân tích cây phát sinh loài và căn chỉnh nhiều lần

Căn chỉnh nhiều lần cho thấy RPCHR có tính tương đồng cao với trình tự RPCHR/GnRHR/AKHR của cua bờ xanh C. maenas và các loài chân khớp khác (Hình 3). Phân tích phát sinh loài cho thấy RPCHR ở S. paramamosain được nhóm vào một nhóm với C. maenas (Hình 4). Cấu trúc 3D của RPCHR ở S. paramamosain tương tự như cấu trúc của C. maenas và tỷ lệ tương đồng là 94,28% (Hình 5).

Hình 3. Nhiều sự sắp xếp của trình tự amino acid suy ra của RPCHR giữa các loài giáp xác và côn trùng khác nhau. Số lượng truy cập GenBank của RPCHR như sau: Carcinus maena RPCHR (Car, MF974387.1, 94,28%); Penaeus vannamei GnRHR (Pen, XM_027379835.1, 82,44%); Polistes canadensis GnRHR II (Pol, XM_014759243.1, 54,27%); Apis mellifera AKHR (api, NM_001040264.1, 55,18%); Cephus cinctus GnRHR II (cep, XM_025080358.1, 51,45%); Neodiprion lecontei GnRHR II (Neo, XM_046736172.1, 49,86%) và Aedes aegypti AKHR (Aed, AAEL011325).

Hình 4. Phân tích phát sinh gen của RPCHR liên quan đến các loài giáp xác và côn trùng khác nhau. Các trình tự được sử dụng trong phân tích cây tiến hóa bao gồm Carcinus maenas RPCHR (MF974387.1); Neodiprion lecontei GnRHR II (XM_046736172.1); Apis dorsata GnRHR II (LOC102678569); Apis mellifera AKHR (NM_001040264.1); Apis florea GnRHR II (XM_003690561.3); Bombus vosnesenskii GnRHR II (LOC117238412); Euphriesea mexicana GnRHR II (XM_017908775.1); Dufourea novaeangliae GnRHR như (XM_015581341.1); Polistes canadensis GnRHR II (XM_014759243.1); Orussus abietinus GnRHR II (XM_012416687.1); Athalia rosae GnRHR II (XM_012403220.3); Belonocnema treatae GnRHR II (LOC117173792); Trichogramma pretiosum GnRHR II (XM_023461036.1); Copidosoma floridanum GnRHR II (LOC106637099); Nasonia vitripennis AKHR (XM_031928406.1); Nicrophorus vespilloid GnRHR II như (XM_017915198.1); Agrilus planipennis GnRHR II (XM_018473247.1); Tribolium castaneum AKHR (XM_008197330.2); Aethina tumida GnRHR II (XM_020018903.2); Aedes aegypti AKHR (AAEL011325); Penaeus vannamei GnRHR (XM_027379835.1); và Cephus cinctus GnRHR II (XM_025080358.1).

Hình 5. So sánh cấu trúc 3D RPCHR dự đoán của Scylla paramamosain (A) với Carcinus maenas (B).

3.3 Biểu hiện của RPCHR

Để khảo sát sơ bộ các chức năng tiềm ẩn của RPCHR ở S. paramamosain, chúng tôi đã phát hiện mức độ biểu hiện của RPCHR trong 12 mô. Kết quả của chúng tôi cho thấy RPCHR phân bố rộng rãi trong nhiều mô khác nhau bao gồm hạch buồng trứng và hạch cuống mắt, với cơ quan hàm dưới có biểu hiện cao nhất, cho thấy nó có thể có nhiều chức năng (Hình 6).

Hình 6. Mức độ biểu hiện của bản sao RPCHR ở Scylla paramamosain. EG, hạch cuống mắt; CG, hạch não; TG, hạch ngực; He, tế bào máu; MO, cơ quan hàm dưới; Ov, buồng trứng; St, dạ dày; Hp, gan tụy; Gi, mang; Mg, ruột giữa; Ep, biểu bì; N, đối chứng âm tính. β-actin là gen tham chiếu.

3.4 Tác động của việc tiêm RPCH lên biểu hiện gen CHH

Để làm sáng tỏ chức năng của RPCH, peptide RPCH trưởng thành đã được tiêm vào cua bùn. Biểu hiện RPCHR tăng đáng kể (P < 0,05; P < 0,001; P < 0,0001) sau 6 giờ, 9 giờ và 12 giờ so với nhóm đối chứng (Hình 7A) và biểu hiện VIH giảm đáng kể (P < 0,01; P < 0,05; P < 0,0001) sau 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ và 24 giờ (Hình 7B). Biểu hiện MIH tăng lên sau 3 giờ, 6 giờ và 12 giờ sau khi tiêm so với nhóm đối chứng được tiêm nước muối cua (Hình 7C). Tương tự như vậy, biểu hiện CHH3 tăng lên (P < 0,05; P < 0,0001) sau 3 giờ và 24 giờ sau khi tiêm peptide RPCH (Hình 7D).

Hình 7. Tác động của peptide RPCH trưởng thành lên biểu hiện gen họ neuropeptide CHH trong hạch mắt in vivo. A: RPCHR; B: VIH; C: MIH; D: CHH3. Tất cả dữ liệu được hiển thị dưới dạng trung bình ± SEM (n = 4); phân tích thống kê theo kiểm định Student t-test. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001.

3.5 Tác động của việc hạ gục RPCH đối với biểu hiện gen CHH

Sau khi can thiệp với RPCH dsRNA, biểu hiện RPCH giảm 58,5% ở hạch cuống mắt sau 48 giờ so với đối chứng trống (P < 0,01). Không có sự khác biệt đáng kể giữa đối chứng âm tính (được xử lý bằng GFP dsRNA) và đối chứng trống (Hình 8A). Biểu hiện VIH được điều chỉnh tăng đáng kể (P < 0,05; Hình 8C). Đồng thời, biểu hiện RPCHR, MIH và CHH3 giảm đáng kể sau khi tiêm RPCH dsRNA (P < 0,01; P < 0,05; P < 0,0001; Hình 8B, D, E).

Hình 8. Tác động của dsRNA RPCH lên biểu hiện gen họ neuropeptide RPCHR và CHH trong hạch mắt in vivo. Tất cả dữ liệu được biểu diễn dưới dạng trung bình ± SEM (n = 4); phân tích thống kê theo kiểm định Student t-test. *P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; **** P < 0,0001.

4. Thảo luận

Hormone tập trung sắc tố đỏ được báo cáo là có liên quan đến việc điều chỉnh nhiều chức năng sinh lý ở động vật chân khớp thông qua các thụ thể liên kết của nó, bao gồm kiểm soát các thay đổi về màu sắc cơ thể và chuyển động của các hạt sắc tố, thúc đẩy sự trưởng thành của tuyến sinh dục và làm tăng lượng đường trong máu ở động vật giáp xác (Zeng và cộng sự, 2016; Alexander và cộng sự, 2018; Wei và cộng sự, 2021). Để minh họa chức năng của RPCH trong S. paramamosain, các trình tự tiền thân của RPCHR từ S. paramamosain đã được xác định trong nghiên cứu này. Nghiên cứu này cho thấy RPCHR là một thụ thể liên kết với protein G có cấu trúc xuyên màng 7 điển hình, phù hợp với các phát hiện ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Trong cây phát sinh loài được xây dựng, RPCHR của S. paramamosain tập hợp lại với RPCHR của C. maenas và GnRHR của P. vannamei thành một đơn vị duy nhất, tách biệt rõ ràng với GnRHR/AKHR của các loài chân khớp khác. Điều này chỉ ra rằng RPCHR được bảo tồn cao ở giáp xác mười chân, gợi ý thêm rằng RPCH có thể có chức năng tương tự như GnRH. Kết quả này tương tự như kết quả được báo cáo ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng RPCH ở S. paramamosain không chỉ điều chỉnh sự thay đổi màu sắc và sự phát triển của buồng trứng mà còn tham gia vào việc điều chỉnh các chức năng sinh lý khác (Zeng và cộng sự, 2016). Nghiên cứu hiện tại tiếp tục chứng minh rằng RPCHR được phân bố rộng rãi trên nhiều mô khác nhau, bao gồm buồng trứng và hạch cuống mắt, được biết là tổng hợp, giải phóng và lưu trữ nhiều loại hormone neuropeptide như VIH, MIH và CHH điều chỉnh sự phát triển của buồng trứng, lột xác và lượng đường trong máu. Những phát hiện này cho thấy rằng sự liên kết của RPCH với các thụ thể được cho là của nó có thể đóng vai trò trong việc điều chỉnh nhiều quá trình sinh lý khác nhau, bao gồm sự phát triển của buồng trứng, lột xác và lượng đường trong máu. Một hiện tượng tương tự đã được mô tả ở C. maenas, tức là RPCHR được biểu hiện cao không chỉ trong các mô thần kinh mà còn trong buồng trứng (Alexander và cộng sự, 2018). Điều thú vị là RPCHR được biểu hiện cao nhất ở cơ quan hàm dưới ở S. paramamosain, cho thấy RCPH có thể đóng vai trò có ảnh hưởng đến sự phát triển buồng trứng thông qua cơ quan hàm dưới và một hiện tượng tương tự đã được báo cáo ở P. clarkii, tức là RCPH có thể hướng dẫn sự phát triển buồng trứng bằng cách kích thích tổng hợp MF ở cơ quan hàm dưới (Sarojini và cộng sự, 1995).

VIH ức chế quá trình tổng hợp vitellogenin ở buồng trứng và gan tụy, do đó ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển của tuyến sinh dục (Devaraj và cộng sự, 2012). Trong nghiên cứu này, kết quả thực nghiệm in vivo cho thấy peptide RPCH trưởng thành ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt, cho thấy RPCH có thể thúc đẩy sự phát triển của tuyến sinh dục bằng cách ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt. Phù hợp với các kết quả trước đây, tức là chỉ số tuyến sinh dục-thể xác, chỉ số gan tụy-thể xác và mức độ biểu hiện Vg của S. paramamosain được tiêm peptide RPCH được tăng cường đáng kể, từ đó thúc đẩy quá trình trưởng thành của buồng trứng (Zeng và cộng sự, 2016). Tương tự, điều trị in vivo bằng RPCH kích thích hiệu quả quá trình trưởng thành giảm phân của tế bào trứng ở E. japonica (Wei và cộng sự, 2021). Ở L. vannamei, tiêm RPCH làm tăng đáng kể nồng độ Vg trong buồng trứng và huyết tương cũng như đường kính tế bào trứng, dẫn đến tác động tích cực đến sự phát triển của buồng trứng (Chen và cộng sự, 2018). Ở P. clarkii, RPCH thúc đẩy sự phát triển của buồng trứng bằng cách kích thích giải phóng GSH từ não và hạch ngực hoặc bằng cách tăng tốc tổng hợp MF ở cơ quan hàm dưới (Sarojini và cộng sự, 1995). RPCH có thể hoạt động như một hormone hạ lưu của chất dẫn truyền thần kinh 5-HT để thúc đẩy sự trưởng thành của tuyến sinh dục ở S. olivacea cái (Kornthong và cộng sự, 2013). Nghiên cứu này cho thấy rằng dsRNA RPCH thúc đẩy đáng kể biểu hiện VIH, cho thấy rằng việc im lặng RPCH ức chế quá trình sinh noãn hoàng bằng cách tăng cường biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt ở S. paramamosain. Song song với đó, những kết quả này chứng minh rằng RPCH kích thích sự phát triển buồng trứng ở S. paramamosain bằng cách ức chế biểu hiện VIH ở hạch cuống mắt. Phương pháp truyền thống là loại bỏ VIH bằng cách cắt bỏ cuống mắt do đó thúc đẩy sự trưởng thành và sinh sản của buồng trứng ở S. paramamosain. Tuy nhiên, phương pháp này dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ chết, giảm tỷ lệ sinh sản và tỷ lệ nở (Liu và cộng sự, 2018), do đó cần phát triển một phương pháp tiếp cận thay thế. Chu kỳ tổng hợp ngắn (khoảng 1 tuần), liều lượng thấp (chỉ 10 ng trên 1 g trọng lượng cơ thể) và chi phí tổng hợp peptide trưởng thành RPCH thấp khiến việc tiêm peptide tổng hợp RPCH trở thành một giải pháp thay thế đầy hứa hẹn cho việc cắt bỏ cuống mắt.

CHH thường tham gia vào quá trình điều hòa nhiều chức năng sinh lý khác nhau như nồng độ glucose trong máu và điều hòa thẩm thấu ở giáp xác (Liu và cộng sự, 2019; Chung và cộng sự, 2010). Việc làm im lặng CHH3 làm giảm nồng độ glucose trong máu ở S. paramamosain, cho thấy CHH3 chịu trách nhiệm điều hòa nồng độ glucose trong máu ở S. paramamosain (Liu và cộng sự, 2019). Trong nghiên cứu này, biểu hiện CHH3 được tăng cường đáng kể sau khi tiêm peptide trưởng thành RPCH trong 3, 6, 9 và 24 giờ. Ngược lại, biểu hiện CHH3 bị giảm đáng kể sau khi can thiệp vào RPCH và những kết quả này cho thấy RPCH có thể làm tăng nồng độ glucose trong máu của S. paramamosain bằng cách kích thích biểu hiện CHH3 ở hạch cuống mắt. Tương tự, nồng độ glucose lưu thông tăng đáng kể trong vòng 90 phút sau khi tiêm RPCH ở C. maenas (Alexander và cộng sự, 2018). Do đó, tác động mới của RPCH có thể là giải phóng CHH, gây ra tình trạng tăng đường huyết, tương tự như các kết quả trước đây đã báo cáo (Webster và cộng sự, 2012; Alexander và cộng sự, 2018). Đáng chú ý, CHH cũng tham gia vào quá trình điều hòa sự phát triển của buồng trứng (Wang và cộng sự, 2019), sinh sản (Tang và cộng sự, 2022; Zhou và cộng sự, 2019) và lột xác (Chung và cộng sự, 2010), cho thấy rằng RPCH có thể điều chỉnh các chức năng sinh lý của sự phát triển, sinh sản và lột xác của buồng trứng S. paramamosain bằng cách thúc đẩy biểu hiện CHH ở cuống mắt, phù hợp với các báo cáo trước đây (Zeng và cộng sự, 2016; Fu và cộng sự, 2016).

Ở giáp xác, MIH đóng vai trò thiết yếu trong quá trình lột xác chủ yếu bằng cách hạn chế sản xuất ecdysteroid (Lee và cộng sự, 2007; Zmora và cộng sự, 2009). Trong nghiên cứu này, biểu hiện MIH tăng đáng kể ở thời điểm 3, 6, 9 và 12 giờ sau khi tiêm RPCH và sự can thiệp vào RPCH làm giảm hiệu quả biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt, cho thấy rằng sự biểu hiện quá mức RPCH có thể hạn chế quá trình lột xác ở S. paramamosain, trong khi việc loại bỏ RPCH sẽ đẩy nhanh quá trình lột xác. Những kết quả này chỉ ra rằng RPCH có thể hạn chế quá trình lột xác của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt. Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng đầu tiên cho thấy RPCH có thể tham gia vào quá trình lột xác của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở hạch cuống mắt. Như đã biết, quá trình lột xác theo chu kỳ ở giáp xác đi kèm với sự tăng trưởng và kích thước của S. paramamosain tăng lên sau mỗi lần lột xác, điều này rất có ý nghĩa đối với việc nuôi cấy S. paramamosain (Chen và cộng sự, 2021; Zhang và cộng sự, 2021). Do đó, nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng việc can thiệp vào RPCH có thể góp phần kiểm soát sự tăng trưởng và lột xác trong quá trình nuôi cấy S. paramamosain. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng MIH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình trưởng thành buồng trứng của các loài giáp xác trưởng thành, ví dụ, MIH góp phần vào quá trình sinh noãn hoàng bằng cách tăng cường biểu hiện và tiết Vg trong gan tụy ở C. sapidus (Zmora và cộng sự, 2009; Huang và cộng sự, 2015; Chung và cộng sự, 2010). Những kết quả này cho thấy RPCH có thể liên quan đến quá trình lột xác không chỉ bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở cuống mắt ở S. paramamosain, mà còn gián tiếp tham gia vào quá trình phát triển buồng trứng bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH ở S. paramamosain.

Dựa trên các nghiên cứu trên, chúng tôi đã xây dựng một cơ chế điều hòa tiềm năng của RPCH trên các neuropeptide họ CHH trong hạch cuống mắt S. paramamosain, tức là RPCH không chỉ thúc đẩy sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain bằng cách tăng biểu hiện/tổng hợp gen hạ lưu thông qua ức chế biểu hiện VIH trong hạch cuống mắt, mà còn điều hòa quá trình lột xác và mức glucose bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH trong hạch cuống mắt (Hình 9). Ngoài ra, RPCH cũng điều hòa sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH trong hạch cuống mắt (Hình 9). Tuy nhiên, cần có các nghiên cứu chức năng để xác minh các cơ chế cơ bản của RPCH trong S. paramamosain.

Hình 9. Cơ chế điều hòa tiềm năng của RPCH trên neuropeptide họ CHH ở hạch mắt S. paramamosain. RPCH không chỉ thúc đẩy sự phát triển buồng trứng S. paramamosain bằng cách tăng biểu hiện/tổng hợp gen hạ lưu thông qua ức chế biểu hiện VIH ở hạch mắt, mà còn điều hòa quá trình lột xác và mức glucose bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH ở hạch mắt. Ngoài ra, RPCH cũng điều hòa sự phát triển buồng trứng S. paramamosain bằng cách điều chỉnh biểu hiện MIH và CHH ở hạch mắt.

5. Kết luận

Nghiên cứu này cung cấp báo cáo toàn diện đầu tiên rằng RPCH có thể liên quan đến quá trình trưởng thành của buồng trứng, mức glucose trong máu và lột xác ở S. paramamosain bằng cách điều chỉnh các neuropeptide họ CHH trong hạch cuống mắt. Điều quan trọng là nghiên cứu này phát hiện ra rằng sự phát triển buồng trứng của S. paramamosain có thể được thúc đẩy bằng cách tiêm hoặc ủ peptide tổng hợp RPCH để cải thiện khả năng sống sót, khả năng nở và lợi ích kinh tế của nó. Do đó, nghiên cứu này có một giải pháp thay thế cho các rủi ro về tỷ lệ tử vong tăng và tỷ lệ sinh sản và nở giảm do cắt bỏ cuống mắt, và do đó có ứng dụng tuyệt vời trong nuôi cấy S. paramamosain.

Theo Mei Wang, Jigui Yuan, Haihui Ye, Xiaohang Geng

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513424004836

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Ttôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức