Phần 1: Glutamate tăng cường khả năng kháng khuẩn của tôm bằng cách tăng cường khả năng miễn dịch tế bào của tôm

Tóm tắt

Glutamate đã được sử dụng phổ biến trong ngành chăn nuôi nhằm thúc đẩy sự phát triển và cải thiện chất lượng thịt của động vật. Tuy nhiên, việc ứng dụng glutamate trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là đối với giáp xác, vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định rằng glutamate trong hemolymp có liên quan đến sự gia tăng tổng số lượng tế bào máu ở tôm trong vòng hai giờ, và hiệu ứng này bị ngăn chặn khi tiêm đồng thời chất ức chế Grik2. Các thí nghiệm cho ăn tiếp theo cho thấy việc bổ sung 0,25% glutamate vào khẩu phần ăn giúp tăng đáng kể hàm lượng glutamate trong mô cơ, với mức tăng lên đến 7%. Thêm vào đó, kết quả từ các thí nghiệm cho ăn kết hợp với phân tích phiên mã cho thấy tôm được bổ sung glutamate thể hiện khả năng kháng Vibrio cao hơn, có thể là do sự tăng cường biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch. Những kết quả này cho thấy glutamate không chỉ cải thiện khả năng kháng bệnh ở tôm mà còn góp phần nâng cao hương vị của sản phẩm. Vì vậy, glutamate có tiềm năng trở thành một chất phụ gia thức ăn hữu ích trong nuôi trồng thủy sản tôm để nâng cao sức đề kháng và chất lượng sản phẩm.

Giới thiệu

Glutamate là một phụ gia thức ăn quan trọng, được sử dụng phổ biến trong chăn nuôi nhiều loài động vật như lợn và cá. Chất này mang lại nhiều lợi ích, bao gồm giảm tổn thương do oxy hóa, tăng sản lượng sữa ở lợn nái trong giai đoạn cho con bú, cũng như thúc đẩy tăng trưởng, nâng cao khả năng chống oxy hóa, cải thiện năng suất và sức khỏe tổng thể ở gia cầm. Tuy nhiên, mặc dù đã được ứng dụng rộng rãi ở vật nuôi, cơ chế tác động của glutamate ở động vật giáp xác vẫn chưa được hiểu rõ. Sự thiếu hụt kiến thức này đang hạn chế tiềm năng mở rộng ứng dụng của glutamate trong nuôi trồng thủy sản giáp xác.

Glutamate không chỉ đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi mà còn được ứng dụng rộng rãi trong y học như một chất dinh dưỡng cho hệ thần kinh. Các thụ thể của glutamate, vốn được bảo tồn cao ở các loài động vật đa bào, được chia thành hai nhóm chính: thụ thể glutamate ionotropic (iGluRs) và thụ thể glutamate metabotropic (mGluRs). Những thụ thể này phân bố ở nhiều cơ quan khác nhau, bao gồm cả hệ thần kinh trung ương (CNS) và hệ nội tiết, ở cả động vật có xương sống và không xương sống. Các nghiên cứu gần đây cho thấy thụ thể glutamate (GluR) cũng được biểu hiện trên một số loại tế bào miễn dịch đặc hiệu, chẳng hạn như tế bào ức chế có nguồn gốc từ tủy (MDSC) và tế bào T.

Các loài Vibrio được xác định là những tác nhân gây bệnh chủ yếu trong ngành nuôi tôm, đóng vai trò quan trọng trong các đợt bùng phát dịch nghiêm trọng như Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) và Hội chứng chết sớm (EMS). Tôm chống lại sự xâm nhập của Vibrio thông qua hệ thống miễn dịch, bao gồm cả yếu tố dịch thể và tế bào. Vì vậy, việc gia tăng tổng số lượng tế bào máu (THC) ở tôm được xem là một chiến lược tiềm năng nhằm nâng cao khả năng miễn dịch chống lại Vibrio.

Trong nghiên cứu trước, chúng tôi đã phát hiện rằng Grik2, một thụ thể glutamate ionotropic có tính bảo tồn cao được biểu hiện một cách chuyên biệt trong các tế bào tiền hồng cầu của tôm. Phát hiện này gợi ý rằng glutamate có thể đóng vai trò thúc đẩy phản ứng miễn dịch ở tôm thông qua Grik2 hiện diện trong các tế bào máu. Trong nghiên cứu hiện tại, chúng tôi tiến hành khảo sát một cách hệ thống mối liên hệ giữa glutamate và khả năng miễn dịch tế bào ở tôm, từ đó xây dựng cơ sở khoa học vững chắc cho việc ứng dụng glutamate trong ngành nuôi tôm.

Vật liệu và phương pháp

Tuyên bố về đạo đức trên động vật

Tất cả các thí nghiệm trên động vật đều được tiến hành theo các hướng dẫn đã thiết lập và được Ủy ban nghiên cứu động vật và đạo đức tại Đại học Shantou chấp thuận.

Tôm

Tôm khỏe mạnh (1–2 g) cho thí nghiệm nhân giống được cung cấp bởi Cơ sở nhân giống tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei thuộc Viện Hàn lâm Khoa học Thủy sản Quảng Tây. Tôm khỏe mạnh (5–10 g) cho các thí nghiệm sinh hóa được mua từ một trang trại nuôi cá địa phương ở Shantou. Trước khi thí nghiệm, tôm được thích nghi trong 5 ngày trong điều kiện thử nghiệm.

Chuẩn bị thức ăn

Công thức thức ăn và sản xuất được cung cấp bởi Guangdong Nutriera Group Co., Ltd. (Chu Hải, Trung Quốc). Nguyên liệu thô được cân theo Bảng 1, trộn bằng máy trộn trong 20 phút, sau đó nghiền trong máy nghiền trong hai vòng. Hỗn hợp được rây qua rây 40 mắt lưới và sau đó trộn với 10% nước. Thức ăn được tạo hạt bằng máy tạo viên trong phòng thí nghiệm (50 kg) (Số ZC-2,206,200,002, Hạ Môn, Trung Quốc) và sấy khô ở 95℃ trong 5 giờ. Thức ăn đã chuẩn bị được bảo quản ở nhiệt độ − 20℃ để sử dụng sau này. Glutamate được mua từ Shanghai Macklin Biotechnology Co., Ltd (Thượng Hải, Trung Quốc).

Bảng 1 Thành phần khẩu phần thí nghiệm và mức độ dinh dưỡng.

Mỗi kg Premix 972 cho tôm chứa các thành phần sau: Vitamin A>250000IU, Vitamin D3:55.000–166000IU, Vitamin E ≥ 4000 mg, Vitamin K3 ≥ 400 mg, Vitamin B1 ≥ 820 mg, Vitamin B2 ≥ 800 mg, Vitamin B6 ≥ 2500 mg, Vitamin B12 ≥ 6 mg, Vitamin C ≥ 12000 mg, D-Calcium Pantothenate ≥ 2500 mg, Nicotinamide ≥ 6000 mg, Axit folic ≥ 500 mg, D-Biotin ≥ 10 mg, Inositol ≥ 8000 mg, Magnesi sulfat ≥ 5000 mg, Kẽm Sunfat: 2250–12500 mg, Mangan sunfat: 650–8300 mg, Đồng sunfat: 160–2000 mg, Sắt sunfat: 4500–62500 mg, Coban sunfat: 125–160 mg, Kali iodua: 75–1600 mg, Natri selenat: 25–40 mg, Độ ẩm ≤ 10 %, Chất mang: thêm canxi cacbonat nhẹ và vỏ trấu để đạt 1 kg.

Thí nghiệm cho ăn

Tổng cộng 900 con tôm (trọng lượng ban đầu trung bình là 1,19 ± 0,07 g) được phân bố vào 15 bể có kích thước 96 cm × 80 cm × 73 cm, với 60 con tôm trong mỗi bể. Mỗi ba bể được gộp thành một nhóm, tạo thành năm nhóm khác nhau, tương ứng với các mức bổ sung glutamate trong thức ăn là 0; 0,10%; 0,25%; 0,50% và 1,00%. Thí nghiệm được tiến hành trong 35 ngày (xem Bảng 1). Tôm được cho ăn bốn lần mỗi ngày vào các khung giờ 8:00, 11:00, 15:00 và 18:00. Lượng thức ăn được điều chỉnh theo mức độ tiêu thụ của tôm, và phần thức ăn thừa cùng chất thải được thu gom sau 1,5 giờ kể từ mỗi lần cho ăn. Tôm được cho ăn đến khi no nhằm hạn chế tình trạng dư thừa thức ăn. Trong mỗi lần cho ăn, các mảnh thức ăn còn lại được loại bỏ bằng cách hút chân không, đồng thời thay mới 30% thể tích nước trong bể mỗi ngày. Các chỉ tiêu chất lượng nước được duy trì ổn định, bao gồm: độ mặn 20 ‰, nhiệt độ từ 23 đến 27℃, pH trong khoảng 7,8–8,2, nồng độ oxy hòa tan 6,8–7,0 mg/L và hàm lượng nitơ amoniac 0,3–0,4 mg/L.

Đo lường cơ thể tôm

Vào cuối thí nghiệm, tôm bị bỏ đói trong 24 giờ và sau đó cân riêng từng con để đảm bảo dữ liệu chính xác (Bảng 2). Trọng lượng cơ thể ban đầu (IBW) và trọng lượng cơ thể cuối cùng (FBW) đã được ghi lại. Các chỉ số sau đây đã được tính toán: tỷ lệ sống (SR), tỷ lệ tăng trọng (WGR), tỷ lệ tăng trưởng cụ thể (SGR), tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR), hệ số điều kiện (CF) và chỉ số gan tụy (HSI). Các công thức như sau:

SR % = 100 × (số lượng tôm cuối cùng / số lượng tôm ban đầu).

WGR % = 100 × [(trọng lượng cơ thể cuối cùng) − (trọng lượng cơ thể ban đầu)] / trọng lượng cơ thể ban đầu.

SGR (%/ngày) = 100 × ln (trọng lượng cơ thể cuối cùng / trọng lượng cơ thể ban đầu) / ngày.

FCR = thức ăn khô tiêu thụ / (trọng lượng cơ thể cuối cùng − trọng lượng cơ thể ban đầu).

CF % = 100 × (trọng lượng cơ thể cuối cùng / (chiều dài cơ thể cuối cùng)³)

HSI % = 100 × (trọng lượng gan tụy / tổng trọng lượng cơ thể).

Bảng 2 Hiệu suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được cho ăn các loại glutamate khác nhau.

Dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (n = 3 bể), sự khác biệt về mặt thống kê được đánh giá bằng ANOVA một chiều. Các giá trị được đánh dấu bằng “a, b và c” khác biệt đáng kể theo phép thử phạm vi đa biến của Duncan.

SR: tỷ lệ sống, IBW: trọng lượng cơ thể ban đầu, FBW: trọng lượng cơ thể cuối cùng, WGR: tỷ lệ tăng trọng, SGR: tỷ lệ tăng trưởng riêng, FCR: tỷ lệ chuyển đổi thức ăn, CF: hệ số điều kiện, HIS: chỉ số gan.

Phân tích thành phần của tôm

Thành phần của thức ăn (Bảng 1) và cơ tôm (Bảng 3) được phân tích theo phương pháp AOAC. Vật chất khô được xác định bằng cách sấy ở 105℃ cho đến khi trọng lượng không đổi. Protein thô được đo bằng phương pháp Kjeldahl (Kjeltec™ 8400, FOSS), với hàm lượng nitơ nhân với 6,25. Chất béo thô được đo bằng phương pháp chiết xuất ete sử dụng máy chiết xuất Soxhlet (SZF-06A, Xinjia Instrument). Hàm lượng tro được xác định bằng cách đốt các mẫu trong lò nung (CWF1100; Carbolite) ở 550℃ trong 6 giờ. Hàm lượng axit amin trong thức ăn thử nghiệm và cơ tôm được phân tích bởi Guangdong Nutriera Group Co., Ltd. (Chu Hải, Trung Quốc) (Bảng 4, 5)

Bảng 3 Thành phần cơ của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei được nuôi bằng các loại glutamate khác nhau.

Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD. (n = 3 bể), sự khác biệt về mặt thống kê được đánh giá bằng ANOVA một chiều. Các giá trị được đánh dấu bằng “a và b” khác biệt đáng kể theo thử nghiệm phạm vi đa dạng của Duncan.

Bảng 4 Thành phần axit amin của khẩu phần ăn thử nghiệm (% vật chất khô).

NEAA: Axit amin thiết yếu.

EAA: Axit amin không thiết yếu.

TAA: Tổng số axit amin.

Đo glutamate hemolymp tôm

Bảng 5 Hàm lượng axit amin thủy phân (g/ kg) trong cơ của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei sau khi bổ sung glutamate trong khẩu phần ăn trong 35 ngày.

NEAA: Axit amin thiết yếu.

EAA: Axit amin không thiết yếu.

Hemolymp từ mỗi con tôm được thu thập và trộn với một thể tích bằng nhau (1:1, v/v) dung dịch chống đông (140 mM NaCl, 110 mM glucose, 25,8 mM natri citrat, 32,8 mM axit citric, pH 6,0). Hỗn hợp được ly tâm ở tốc độ 800 g trong 10 phút để loại bỏ tế bào máu và phần dịch trong được gửi đến Công ty TNHH Công nghệ sinh học Qiyi Thượng Hải (Thượng Hải, Trung Quốc) để đo glutamine. Hàm lượng glutamate được đo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng RIGOL L3000 (Quảng Châu, Trung Quốc). Nồng độ glutamate được tính như sau:

Nồng độ glutamate (μg / mL) = f1/f2 × C,

trong đó

f1: diện tích đỉnh của glutamate trong dung dịch mẫu/diện tích đỉnh chuẩn nội;

f2: diện tích đỉnh của glutamate trong dung dịch chuẩn axit amin hỗn hợp/diện tích đỉnh chuẩn nội;

C: nồng độ glutamate trong dung dịch chuẩn axit amin hỗn hợp.

Thí nghiệm tiêm

Tôm được tiêm 100 μL dung dịch chứa 10 μM glycine, 10 μM glutamine hoặc kết hợp 10 μM glutamine với 250 nM WAY-303,290 (chất ức chế Grik2; Aladdin®, Thượng Hải, Trung Quốc) đã hòa tan trong PBS, với liều lượng tương ứng cho mỗi 5 g khối lượng tôm. Mẫu tế bào máu được thu thập tại các thời điểm 0, 2, 4 và 8 giờ sau tiêm để phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

Đo tổng số lượng tế bào máu

Thu thập hemolymp từ mỗi con tôm và trộn với một thể tích bằng nhau (1:1, v/v) dung dịch chống đông. Đếm tế bào máu được thực hiện bằng máy đếm tế bào máu (Qiujing, Thượng Hải, Trung Quốc).

Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn Vibrio

Chủng vi khuẩn gây bệnh Vibrio parahaemolyticus được cung cấp bởi Viện Hàn lâm Khoa học Thủy sản Quảng Tây. Vi khuẩn được nuôi qua đêm trong môi trường LB ở 37°C, sau đó cấy chuyển sang 50 mL môi trường LB tươi và tiếp tục nuôi trong 4 giờ. Các tế bào vi khuẩn được thu bằng cách ly tâm ở 10.000 g trong 10 phút, sau đó rửa bằng dung dịch PBS và được huyền phù lại. Từ mỗi nhóm tôm được cho ăn, 40 cá thể được chọn ngẫu nhiên để tiêm huyền phù V. parahaemolyticus với liều lượng 5 × 10⁵ CFU/g. Tỷ lệ sống của tôm được ghi nhận định kỳ mỗi 6 giờ trong vòng 120 giờ sau khi tiêm.

Phân tích phiên mã

Vào cuối thí nghiệm, các mẫu tế bào máu được thu thập từ 12 con tôm được chọn ngẫu nhiên trong mỗi nhóm. Sau đó, các tế bào này được ly tâm ở 900 g trong 3 phút để tách chiết RNA tổng số, và RNA thu được được gửi đến Công ty Genedenovo (Quảng Châu, Trung Quốc) để thực hiện giải trình tự phiên mã. Dữ liệu giải trình tự sau khi được lắp ráp đã được nộp lên GenBank với số hiệu truy cập PRJNA1085979. Phân tích các gen có biểu hiện khác biệt (DEG) được thực hiện theo phương pháp đã công bố trước đó. Các DEG được xác định là những gen có giá trị FDR ≤ 0,05 và tỷ lệ biểu hiện TPM (số bản sao trên một triệu lượt đọc) lớn hơn 2.

Chuẩn bị cDNA và PCR định lượng thời gian thực (qPCR)

Trong thí nghiệm tiêm, các tế bào máu từ mỗi mười con tôm được xử lý theo cùng một phương pháp được gộp lại thành một mẫu duy nhất để tiến hành chuẩn bị cDNA. Đối với thí nghiệm cho ăn, 15 con tôm được chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm sau 35 ngày cho ăn, sau đó các tế bào máu từ mỗi năm con tôm được gộp lại để tạo thành một mẫu duy nhất. Tổng RNA được tách chiết bằng bộ kit RNAfast200 (FeiJie, Thượng Hải, Trung Quốc). Các mẫu tế bào máu được ly tâm ở 800 g trong 10 phút, giữ lại khoảng 150 μL phần dịch nổi. Phần dịch còn lại được lắc đều cho đến khi không còn thấy cục tế bào. Tiếp đó, 100 μL hỗn hợp này được chuyển vào ống Eppendorf, trộn với 500 μL dung dịch đệm RA2 và lắc nhẹ trong 1 phút. Hỗn hợp phân hủy sau đó được chuyển vào cột RNAfast200 và ly tâm ở tốc độ 10.000 g trong 1 phút. Dịch chảy qua bị loại bỏ, và cột được rửa hai lần bằng 500 μL dung dịch rửa, mỗi lần đều ly tâm trong 1 phút. Một lần quay khô bổ sung được thực hiện để loại bỏ hết ethanol còn sót lại. RNA được rửa giải bằng cách thêm 25 μL dung dịch rửa giải trực tiếp vào màng, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút trước khi ly tâm trong 1 phút. Để loại bỏ DNA bộ gen bị nhiễm, sử dụng bộ phản ứng PrimeScript™ RT với gDNA Eraser (TaKaRa, Nhật Bản). Sau đó, quá trình phiên mã ngược được tiến hành để tổng hợp cDNA, phục vụ cho phản ứng qPCR bằng các cặp mồi được liệt kê trong Bảng 6. Biểu hiện tương đối của các gen mục tiêu được tính toán theo phương pháp 2^-ΔΔCT, với Lv-EF1α được sử dụng làm đối chứng nội tại. Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần độc lập.

Bảng 6 Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu này.

Phân tích thống kê

Dữ liệu tăng trưởng thực nghiệm, bao gồm thành phần thức ăn/cơ, thành phần axit amin và biểu hiện gen tương đối, được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (trung bình ± SD). Phần mềm SPSS 27.0.1 (SPSS Inc., Michigan Avenue, Chicago, IL, Hoa Kỳ) được sử dụng để thực hiện phân tích ANOVA một chiều và so sánh bội số Duncan nhằm xác định sự khác biệt có ý nghĩa, với giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác biệt đáng kể. Dữ liệu tỷ lệ sống sót được phân tích bằng kiểm định log-rank (Mantel_Cox). Đối với thí nghiệm tiêm, kiểm định Student t-test hai đuôi không ghép đôi được áp dụng để phân tích dữ liệu.

…Còn tiếp…

Theo Lei Ma, Wenyong Jiang, Zhiyao Lu, Yanmei Tong, Qingyun Liu, Zhonghua He, Xiuli Chen, Yongzhen Zhao, Fan Wang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2950311625000102

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

Đọc thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức