Phần 1: Nhận dạng và đặc tính của một loại Probiotic tiềm năng, Clostridium butyricum G13, được phân lập từ ruột cua bùn (Scylla paramamosain)

Tóm tắt

Vi khuẩn sản xuất butyrate Clostridium butyricum đã được chứng minh quan trọng trong việc cải thiện sự tăng trưởng và lợi ích sức khỏe của động vật thủy sinh. Trong nghiên cứu này, C. butyricum G13 đã được phân lập lần đầu tiên từ ruột của cua bùn (Scylla paramamosain). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy C. butyricum G13 có thể sản xuất nồng độ axit butyric cao và phát triển tốt trong phạm vi rộng của độ pH (4 đến 9) và nồng độ NaCl (1 đến 2,5%) và muối mật (0,2 đến 1,0%). Đặc tính trong ống nghiệm cho thấy C. butyricum G13 là vi khuẩn Gram dương và hemolymp gamma nhạy cảm với hầu hết các loại kháng sinh và biểu hiện tính kỵ nước và khả năng phân hủy tinh bột. Quá trình lên men trong ống nghiệm sử dụng ruột cua bùn cho thấy C. butyricum G13 đơn lẻ hoặc kết hợp với galactooligosaccharides (GOS) và/hoặc tinh bột kháng (RS) làm tăng đáng kể sản xuất axit butyric và ảnh hưởng có lợi đến sự phong phú và đa dạng của hệ vi khuẩn đường ruột. Ngoài ra, C. butyricum G13 có thể cải thiện tỷ lệ sống của cua bùn và duy trì hiệu quả cấu trúc bình thường của hình thái ruột sau khi nhiễm Vibrio parahaemolyticus. Tóm lại, C. butyricum G13 có thể được coi là một loại men vi sinh tiềm năng giúp cải thiện khả năng miễn dịch và mang lại lợi ích sức khỏe cho cua bùn.

TẦM QUAN TRỌNG Với sự phát triển của xã hội, nhu cầu về động vật thủy sinh ngày càng tăng. Việc thâm canh quy mô nuôi trồng thủy sản đang phải đối mặt với các vấn đề như bùng phát dịch bệnh, phú dưỡng các vùng nước và sử dụng kháng sinh sai mục đích. Trong số những thách thức này, bùng phát dịch bệnh là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nuôi trồng thủy sản. Việc khám phá các phương pháp tiếp cận mới có hiệu quả để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh là rất quan trọng. Probiotic đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản và đã cho thấy những tác dụng có lợi đối với vật chủ. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn sản xuất butyrate Clostridium butyricum G13 đã được phân lập lần đầu tiên từ ruột cua bùn thông qua quá trình lên men trong ống nghiệm. Vi khuẩn này có đặc tính probiotic và thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột để có lợi cho vật chủ trong ống nghiệm cũng như bảo vệ vật chủ khỏi nhiễm trùng Vibrio parahaemolyticus trong cơ thể sống. Kết quả của nghiên cứu này chỉ ra rằng C. butyricum G13 có thể được sử dụng như một loại probiotic tiềm năng trong nuôi cua biển.

Cua bùn (Scylla paramamosain) là một trong những loài nuôi trồng thủy sản thương mại quan trọng ở vùng ven biển đông nam Trung Quốc. Việc mở rộng liên tục quy mô nuôi dẫn đến tần suất bùng phát dịch bệnh ở cua bùn nuôi ngày càng tăng, dẫn đến sản lượng nuôi trồng thủy sản giảm dần và thiệt hại kinh tế lớn. Các bệnh truyền nhiễm xảy ra ở cua bùn chủ yếu do các thành viên của chi Vibrio gây ra, chẳng hạn như Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae và V. vulnificus. Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo về việc sử dụng kháng sinh, vắc-xin và phụ gia thức ăn (bao gồm cả probiotic, prebiotic và synbiotic) được sử dụng để phòng ngừa hoặc kiểm soát bệnh ở động vật thủy sản. Trong số các phương pháp này, kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất, cho thấy hiệu quả cao trong điều trị các bệnh truyền nhiễm ở động vật nuôi. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi kháng sinh lại tác động trực tiếp đến vật nuôi và môi trường cũng như những tác động gián tiếp đến sức khỏe con người. Hệ vi sinh vật đường ruột đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển khỏe mạnh của vật chủ. Điều thú vị là việc sử dụng men vi sinh đã được thảo luận như một trong những cách tiếp cận phù hợp nhất để giảm nguy cơ nhiễm trùng ở cua bùn. Một nghiên cứu trước đây cho thấy việc bổ sung khẩu phần ăn Bacillus subtilis DCU hoặc Bacillus pumilus BP giúp cải thiện tỷ lệ sống, tăng cường chức năng miễn dịch và giảm tỷ lệ nhiễm trùng của vật chủ sau khi cảm nhiễm với V. parahaemolyticus. Trong một nghiên cứu khác, Yang và cộng sự đã tiết lộ rằng vi khuẩn Enterococcus faecalis Y17 và Pediococcus pentosaceus G11 có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng và khả năng miễn dịch của cua bùn. Kết quả của những nghiên cứu này chỉ ra tiềm năng sử dụng men vi sinh trong nuôi cua bùn. Mặc dù lợi ích sức khỏe của chế phẩm sinh học đối với cua bùn đã được chứng minh, số lượng loài được sử dụng làm chế phẩm sinh học vẫn còn hạn chế, chỉ bao gồm các thành viên của Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus và Pediococcus. Việc khám phá ra các loài mới để sử dụng làm vi sinh vật sinh học là cần thiết để làm giàu nguồn cung cấp cho nghề nuôi cua bùn.

Clostridium butyricum là một loại vi khuẩn Gram dương kỵ khí bắt buộc tạo ra một lượng lớn khí trong môi trường chứa carbohydrate có thể lên men. C. butyricum cũng có thể lên men carbohydrate để tạo ra các axit béo chuỗi ngắn (SCFA), đặc biệt là axit butyric, được sử dụng để tái tạo và sửa chữa biểu mô ruột và điều chỉnh hệ vi sinh đường ruột. Vi khuẩn này được mô tả là có khả năng chống chịu tốt hơn với môi trường pH thấp, nhiệt độ cao và nhiều loại kháng sinh so với các loại men vi sinh khác (như Bacillus, Lactobacillus và nấm men) và được sử dụng làm men vi sinh trong nuôi trồng thủy sản. Việc bổ sung C. butyricum vào khẩu phần ăn đã cho thấy vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất tăng trưởng và lợi ích sức khỏe của một số loài động vật thủy sinh, chẳng hạn như cá vược cát đốm (Paralabrax maculatofasciatus), tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), tôm sú (Penaeus monodon) và rùa cỏ (Chinemys reevesii), cũng như tế bào biểu mô ruột (FIEC) của cá chép crucian (Carassius vulgaris). Ví dụ, việc bổ sung C. butyricum vào khẩu phần ăn của L. vannamei và cho ăn trong 42 ngày có thể cải thiện hiệu quả trọng lượng cơ thể, tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ sống của tôm, cũng như khả năng kháng bệnh chống lại nhiễm trùng V. parahaemolyticus. Một nghiên cứu khác cho thấy việc bổ sung C. butyricum CB vào khẩu phần ăn cơ bản giúp cải thiện cấu trúc ruột (chiều cao nhung mao và chiều dài tế bào biểu mô) và điều chỉnh sự cân bằng của hệ vi khuẩn đường ruột, do đó cải thiện sự phát triển của ấu trùng Larimichthys crocea. Ngoài ra, Luo và cộng sự (32) cho thấy khẩu phần ăn bổ sung C. butyricum kích thích hoạt tính của các enzym chống oxy hóa và sức khỏe mô ruột, cũng như tăng tỷ lệ sống của rùa cỏ non (C. reevesii) sau khi nhiễm Aeromonas veronii. Những kết quả này cho thấy tiềm năng của C. butyricum ở động vật thủy sinh, nhưng hầu hết các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ các nguồn khác chứ không phải từ ruột của động vật thủy sinh. Ngoài ra, việc phân lập C. butyricum từ cua bùn vẫn chưa đạt được. Trong nghiên cứu này, vi khuẩn sản xuất butyrate C. butyricum G13 đã được phân lập lần đầu tiên từ đường ruột của cua bùn. Nó được đặc trưng thêm bằng cách đánh giá khả năng chịu đựng của nó đối với các điều kiện đường tiêu hóa (pH, NaCl và muối mật), tính kỵ nước, khả năng phân hủy tinh bột và xenluloza, độ nhạy cảm với kháng sinh và khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh. Ngoài ra, ảnh hưởng của C. butyricum G13 đơn lẻ hoặc kết hợp với prebiotic (galactooligosacarit [GOS] và/hoặc tinh bột kháng [RS]) đối với sản xuất SCFA và hệ vi sinh vật đường ruột đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng quá trình lên men trong ống nghiệm. Ngoài ra, vai trò bảo vệ của C. butyricum G13 đơn lẻ hoặc kết hợp với cả GOS và RS (G13 + GOS + RS) ở cua bùn chống lại các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn đã được nghiên cứu. Kết quả của nghiên cứu này chứng minh rằng C. butyricum G13 có thể được coi là một loại men vi sinh tiềm năng để sử dụng trong nuôi cua bùn.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Phân lập và định danh vi khuẩn

18 con cua bùn khỏe mạnh (trọng lượng cơ thể, thích hợp là 43,3 g) được mua từ một trang trại nuôi ở Niutianyang (Sán Đầu, Quảng Đông, Trung Quốc) và được chia ngẫu nhiên thành ba nhóm. Tiến hành mổ cua bùn vô trùng trên đá, thu thập ruột một cách vô trùng và nạo nhẹ phần ruột sau, cho vào ống Eppendorf vô trùng và nhanh chóng chuyển đến trạm kỵ khí (10% H₂, 5% CO₂, 85% N₂; Thượng Hải Longyue, Trung Quốc). Phần ruột được trộn kỹ trong dung dịch pha loãng 10 lần của dung dịch đệm natri phosphat kỵ khí 0,1 M (pH 6,8). Thể tích 0,1 mL được ủ trong các ống Hungate được đậy kín bằng nút cao su butyl và nắp vặn chứa môi trường nuôi cấy CO₂-PY không có O₂ (5,0 g pepton, 5,0 g trypsin, 1 mg vitamin K1, 10,0 g chiết xuất nấm men, 0,5 g cysteine, 4,0 g NaCO₃, 10 mL dung dịch heme 0,05%, 0,4 g K₂HPO₄, 0,04 g KH₂PO₄, 0,08 g NaHCO₃, 0,04 g NaCl, 8 mg CaCl₂, 1,9 μg MgSO₄·7H₂O [pH 6,8]) (5 mL) bổ sung 0,05 g GOS hoặc RS. Các ống nuôi cấy được ủ trên máy lắc (Công ty TNHH Bluepard Instruments Thượng Hải) ở tốc độ 140 × g trong 24 giờ ở 28°C và sau đó được sử dụng để phân lập vi khuẩn. Sau khi ủ trong 24 giờ, dung dịch gốc được pha loãng thành các pha loãng nối tiếp 10⁻⁶, 10⁻⁷ và 10⁻⁸, và một hỗn dịch 100 μL được trải lên các đĩa thạch PY và nuôi cấy trong buồng kỵ khí ở 28°C trong 24 giờ. Các khuẩn lạc có màu sắc và hình dạng khác nhau được chọn và chuyển sang các đĩa thạch PY mới. Các khuẩn lạc được làm sạch 4 đến 5 lần cho đến khi chúng phát triển thành các khuẩn lạc đơn lẻ. Các khuẩn lạc đơn lẻ được chuyển sang môi trường nuôi cấy PY riêng lẻ hoặc bổ sung GOS hoặc RS và lắc ở tốc độ 200 × g trong 24 giờ ở 28°C. Các nền nuôi được sử dụng để xác định sản xuất axit butyric bằng sắc ký khí, và các phân lập vi khuẩn sản xuất butyrat được xác định với giá trị ròng >2 mM sản xuất axit butyric (56). Hình thái của các phân lập vi khuẩn được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (JSM-6360LA, Jeol, Nhật Bản).

DNA bộ gen của các phân lập được chiết xuất bằng bộ DNA bộ gen TIANamp (Tiangen Biotech Co., Ltd., Bắc Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA chiết xuất được sử dụng để khuếch đại PCR gen rRNA 16S bằng cách sử dụng các mồi phổ biến 27F/1492R. Chương trình khuếch đại là 95°C trong 5 phút, 94°C trong 30 giây và 55°C trong 1 phút, tiếp theo là 30 chu kỳ ở 72°C trong 2 phút và sau đó là 72°C trong 5 phút. Các mẫu khuếch đại được phát hiện bằng điện di gel agarose 1%. Các sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự 16S rRNA bởi một công ty thương mại. Danh tính của trình tự gen được xác định bằng cách sử dụng tìm kiếm BLASTN trong cơ sở dữ liệu GenBank.

Phân tích axit béo chuỗi ngắn

Nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường nuôi cấy PY, lắc và ủ ở 200 × g trong 24 giờ ở 28°C. Vào lúc 0 giờ và 24 giờ, 2 mL dung dịch nuôi cấy được lấy mẫu bằng ống tiêm vô trùng. Các mẫu được ly tâm ở 12.000 × g trong 10 phút ở 4°C và giữ lại phần dịch nổi. Phần dịch nổi được điều chỉnh đến độ pH từ 2 đến 3 bằng cách thêm H₂SO₄, ly tâm ở 12.000 × g trong 10 phút ở 4°C và thu thập bằng màng lọc 0,22 μm. Xác định SCFA được thực hiện bằng máy sắc ký khí mạng Agilent GC6890N (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Hoa Kỳ) với các cột mao quản HP-InnoWax. Nitơ (độ tinh khiết, >99,99%) được sử dụng làm khí mang và khí thổi đuôi với lưu lượng lần lượt là 1,0 mL/phút và 45 mL/phút. Lưu lượng khí hydro là 40 mL/phút, lưu lượng khí là 450 mL/phút. Thiết bị ban đầu được vận hành ở 50°C trong 6 phút và sau đó ở 230°C trong 8 phút. Mỗi thể tích tiêm là 0,5 μL; nhiệt độ phát hiện ion hóa ngọn lửa (FID) là 250°C.

Đường chuẩn của SCFA được chuẩn bị bằng phương pháp chuẩn bên ngoài. Dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp của axit axetic, propionic và butyric được tạo ra. Nồng độ axit axetic được điều chỉnh thành 0,089 đến 22,876 mM, axit propionic là 0,117 đến 29,931 mM và axit butyric là 0,143 đến 36,560 mM. Mỗi mẫu được thiết lập theo bộ ba. Đường cong hiệu chuẩn được chuẩn bị bằng cách vẽ diện tích đỉnh tương đối với nồng độ mol của dung dịch. Nồng độ axit axetic, propionic và butyric được xác định bằng cách sử dụng đường cong chuẩn của từng SCFA và được biểu thị dưới dạng nồng độ milimol trung bình.

Đặc tính in vitro của vi khuẩn phân lập

Để xác định khả năng chịu đựng pH, NaCl và khả năng kháng muối mật, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy PY trong 24 giờ ở 28°C bằng cách lắc ở 200 × g. Sau khi ủ 24 giờ, mật độ vi khuẩn được điều chỉnh thành 107 CFU/mL và 100 μL huyền phù vi khuẩn được chuyển vào môi trường nuôi cấy PY được điều chỉnh theo các giá trị pH khác nhau (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8), muối mật (0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 và 1%) hoặc NaCl (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 và 3%). Mỗi nghiệm thức được thực hiện trong ba lần lặp lại. Quá trình ủ được lắc ở 200 × g trong 24 giờ ở 28°C. Độ hấp thụ được phát hiện bằng mật độ quang học (OD) ở 600 nm để xác định sự phát triển của vi khuẩn.

Hoạt tính kháng khuẩn và thử nghiệm tính nhạy cảm với kháng sinh

Hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa. Phân lập vi khuẩn (G13) được nuôi qua đêm trong môi trường PY trong 24 giờ ở 28°C với tốc độ lắc 200 × g. Các nền nuôi cấy được ly tâm ở tốc độ 12.000 × g trong 10 phút ở 4°C và thu được phần dịch nổi và sử dụng cho các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn. Các vi khuẩn gây bệnh V. parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus và Aeromonas hydrophila đã được sử dụng trong thử nghiệm này. Các vi khuẩn V. parahaemolyticus, S. aureus và V. harveyi được nuôi cấy trong môi trường LB (37°C), trong khi V. alginolyticus và A. hydrophila được nuôi cấy trong môi trường tryptic soy broth (TSB) (28°C) trong 24 giờ với tốc độ lắc 200 × g. Đầu tiên, một hỗn dịch vi khuẩn 100 μL được rải lên các đĩa thạch, và đĩa giấy (đường kính 6 mm) được làm ướt bằng dịch nổi từ nuôi cấy C. butyricum G13 được đặt trên bề mặt đĩa thạch. Mỗi lần xử lý được thực hiện trong ba lần lặp lại. Các đĩa được nuôi cấy trong 24 giờ ở 28°C và quan sát thấy sự xuất hiện của vùng ức chế.

Thử nghiệm nhạy cảm với kháng sinh được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Tổng cộng có 19 chất kháng khuẩn, bao gồm penicillin (10 μg), oxacillin (1 μg), ampicillin (10 μg), amikacin (30 μg), acid amoxicillin (30 μg), enrofloxacin (10 μg), cefuroxime (30 μg), chloramphenicol (10 μg), cephazolin (30 μg), ceftazidime (30 μg), erythromycin (15 μg), gentamicin (10 μg), midecamycin (30 μg), polymyxin B (300 μg), neomycin (30 μg), minocycline (10 μg), tetracycline (30 μg), vancomycin (30 μg) và trimethoprim (30 μg) đã được sử dụng cho nghiên cứu này. Một thể tích 100 μL dung dịch vi khuẩn (1 × 10⁸ CFU/mL) được trải lên các đĩa thạch PY và các đĩa tác nhân kháng khuẩn (Nhà máy thuốc thử vi sinh Hàng Châu, Hàng Châu, Trung Quốc) được đặt trên bề mặt thạch. Mỗi nghiệm thức được thực hiện ba lần. Quá trình ủ được tiến hành trong một trạm làm việc kỵ khí trong 24 giờ ở 28°C và đường kính của các vòng tròn kìm khuẩn được đo.

Phát hiện enzyme tiêu hóa

Quá trình phân hủy tinh bột bằng enzyme của vi khuẩn phân lập được phát hiện bằng cách nuôi cấy trong môi trường thích hợp và kiểm tra vùng thanh thải. Đối với xét nghiệm amylase, vi khuẩn được cấy vào đĩa thạch amylase (chứa 5,0 g tinh bột hòa tan, 5,0 g pepton, 3,0 g agar, 2,5 g chiết xuất thịt bò, 2,5 g NaCl và 500 mL nước cất hai lần [ddH₂O] [pH 7,0 đến 7,2]). Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy PY trong 24 giờ ở 28°C với tốc độ lắc 200 × g và mật độ vi khuẩn được điều chỉnh thành 10⁸ CFU/mL. Một hỗn dịch vi khuẩn 2 μL được cấy vào đĩa thạch amylase và nuôi cấy trong trạm làm việc kỵ khí trong 24 giờ ở 28°C. Sau đó, dung dịch iốt Lugo được thêm vào và kiểm tra xem có vòng tròn trong suốt hay không.

Xét nghiệm hemolymp và kỵ nước

Để xác định hoạt tính hemolymp, 2 μL huyền phù vi khuẩn được cấy vào đĩa thạch máu cừu (Huankai Biotechnology Co. Ltd., Quảng Đông, Trung Quốc) và nuôi cấy trong trạm làm việc kỵ khí trong 48 giờ ở 28°C. Các đĩa chứa thạch máu cừu được sử dụng làm đối chứng trắng. Các đĩa được quan sát để tạo ra các vùng hemolymp, không có vùng trong (hemolymp gamma), sạch (hemolymp beta) hoặc màu xanh lục (hemolymp alpha) xung quanh các khuẩn lạc vi khuẩn.

Để phát hiện tính kỵ nước của vi khuẩn, phương pháp liên kết carbon hydroxyl đã được sử dụng trong thí nghiệm này. Theo tính kỵ nước của bề mặt tế bào vi khuẩn, H% = [(OD0 − OD)/OD0] × 100, trong đó OD0 biểu thị giá trị OD của huyền phù vi khuẩn và OD biểu thị giá trị OD của huyền phù vi khuẩn trộn với xylen. Ly tâm thể tích 2 mL huyền phù vi khuẩn ở tốc độ 5.000 × g trong 5 phút và thu thập kết tủa của chủng. Rửa kết tủa hai lần bằng dung dịch đệm K₂HPO₄ 50 mM, tái huyền phù vi khuẩn bằng một lượng dung dịch đệm thích hợp, điều chỉnh nồng độ huyền phù vi khuẩn (OD₅₆₀ = 1,0) và sử dụng dung dịch đệm làm đối chứng. Trộn đều 1 mL huyền phù vi khuẩn và 4 mL xylen và ổn định ở 37°C trong 1 giờ, sau đó kiểm tra giá trị nước (OD₅₆₀).

Thí nghiệm lên men trong ống nghiệm

Ứng cử viên vi khuẩn probiotic (C. butyricum G13) được cấy vào môi trường nuôi cấy PY ở 28°C trong 24 giờ với tốc độ lắc 200 × g được sử dụng để chuẩn bị huyền phù vi khuẩn với 10⁷ CFU/mL. Các chất trong đường ruột được thu thập từ 12 con cua bùn khỏe mạnh (trọng lượng cơ thể, thích hợp là 40 g). Một thể tích 100 μL các chất trong đường ruột được thêm vào môi trường nuôi cấy PY (5 mL) bổ sung nước muối vô trùng (đối chứng) và C. butyricum G13 (ở 10⁷ CFU/mL) riêng lẻ (G13) hoặc kết hợp với GOS (0,5%) (G13 + GOS), RS (0,5%) (G13 + RS), hoặc cả GOS (0,5%) và RS (0,5%) (G13 + GOS + RS). Các ống nuôi cấy được ủ trong 24 giờ ở 28°C và lắc ở 200 × g. Các mẫu (2 mL) từ các ống nuôi cấy được thu thập và ly tâm ở tốc độ 12.000 × g trong 10 phút. Các chất nổi được sử dụng để xác định sản xuất SCFA bằng sắc ký khí và các viên vi khuẩn được sử dụng để chiết xuất DNA bộ gen. DNA bộ gen được sử dụng làm khuôn mẫu cho PCR để khuếch đại vùng V3-V4 của gen 16S rRNA. Giải trình tự được thực hiện bởi một công ty thương mại sử dụng Illumina NovaSeq 6000 (Illumina Novogene, Thiên Kinh, Trung Quốc).

Phân tích tin sinh học và phân tích dữ liệu

Tất cả các trình tự thu được đều được sắp xếp dựa trên mã vạch duy nhất tương ứng của chúng. Trình tự của mỗi mẫu được hợp nhất bằng Flash-1.2.8 (57). Các trình tự được ghép kênh bằng chương trình phân tích hệ vi sinh vật (QIIME1.8.0) và trải qua quá trình lọc chất lượng (58). Trình tự chimeric được phát hiện thông qua việc so sánh các trình tự chất lượng cao với cơ sở dữ liệu chú thích loài và được loại bỏ bằng thuật toán UCHIME (59). Để nghiên cứu thành phần loài của từng nhóm, phân tích cụm OTU đã được tiến hành với mức độ đồng nhất 97% và chú thích loài được thực hiện dựa trên các trình tự OTU. Các chỉ số đa dạng alpha (độ phong phú của cộng đồng, Chao1 và ACE; độ đồng đều, Shannon và Simpson), độ phủ Good và các đường cong thưa thớt đã được phân tích và tính toán bằng gói phần mềm QIIME. Phân tích tọa độ chính (PCoA) được thực hiện bằng công cụ UniFrac (60). Sử dụng kích thước hiệu ứng Galaxy/Hutlab (https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) (LEfSe), phân tích phân biệt tuyến tính đã được thực hiện để xác định sự khác biệt đáng kể về số lượng giữa các nhóm vi sinh vật. PICRUSt1.0.0 đã được sử dụng để dự đoán phổ chức năng của cộng đồng vi sinh vật (61). Phân tích cụm đã được thực hiện bằng PAST2.16. Sự khác biệt thu được từ các thử nghiệm được coi là có ý nghĩa thống kê ở giá trị P <0,05.

Thử nghiệm cảm nhiễm Vibrio parahaemolyticus

Thức ăn viên thương mại được sử dụng làm thức ăn cơ bản (45% protein thô, 9% chiết xuất ete, 14% tro và 12% độ ẩm) (Công ty TNHH Nghiên cứu và Phát triển Sinh học Biển Yuequn Quảng Đông, Trung Quốc). C. butyricum G13 và V. parahaemolyticus được nuôi cấy trong môi trường PY và LB tương ứng trong 24 giờ. Nuôi cấy vi khuẩn được ly tâm, rửa ba lần bằng dung dịch muối vô trùng 0,9% và huyền phù trong dung dịch muối vô trùng. Huyền phù vi khuẩn (C. butyricum G13 hoặc V. parahaemolyticus) được phun vào thức ăn cơ bản. Thí nghiệm bao gồm bốn nhóm: nhóm đối chứng (nước muối vô trùng) và nhóm được xử lý (V. parahaemolyticus [1 × 10⁷ mL/g] đơn lẻ hoặc kết hợp với C. butyricum G13 [10⁷ CFU/g] [G13+V. parahaemolyticus] hoặc C. butyricum G13 [10⁷ CFU/g], GOS [0,5%] và RS [0,5%] [G13+GOS+RS+V. parahaemolyticus]). Tất cả thức ăn đều được sấy khô ở 40°C trước khi sử dụng. Nồng độ vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này dựa trên các nghiên cứu trước đây.

Tổng cộng 120 con cua bùn (trọng lượng cơ thể, thích hợp là 30,4 g) được mua từ một trang trại nuôi ở Niutianyang (Sán Đầu, Quảng Đông, Trung Quốc) được chia ngẫu nhiên thành bốn nhóm. Cua bùn được thuần hóa theo điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ, 27°C; pH 7,95; và độ mặn, 15‰). Cua bùn được cho ăn khẩu phần ăn cơ bản một lần một ngày (17:00) trong 7 ngày. Vào ngày thứ 8, mỗi con cua bùn trong các nhóm được điều trị được uống 200 μL V. parahaemolyticus (ở mức 1 × 10⁷ CFU/mL). Nhóm đối chứng được điều trị bằng cùng một thể tích dung dịch muối vô trùng 0,9%. Vào ngày thứ 8 và ngày thứ 9, cua bùn trong mỗi nhóm V. parahaemolyticus, G13 và G13+GOS+RS được cho ăn khẩu phần ăn tương ứng có chứa 1 × 10⁷ CFU/g V. parahaemolyticus để duy trì sự hiện diện của mầm bệnh trong ruột. Từ ngày thứ 10 trở đi, cua bùn trong mỗi nhóm được cho ăn khẩu phần ăn tương ứng một lần mỗi ngày (17:00). Trong thời gian thử nghiệm, thức ăn thừa và phân được loại bỏ và nước được thay hàng ngày. Tỷ lệ sống của cua bùn được ghi lại trong 7 ngày.

Sau thử nghiệm cảm nhiễm, cua bùn được khử trùng và mổ trên đá. Gan tụy và nội dung ruột được thu thập nhanh chóng và lưu trữ trong nitơ lỏng và sau đó được lưu trữ ở nhiệt độ -80°C. Ruột được thu thập và ngâm hoàn toàn trong dung dịch cố định mô 4% để cắt mô và quan sát nhuộm H&E. Gan tụy được cân chính xác và trộn đều theo tỷ lệ gan tụy (gam)/0,9% nước muối vô trùng là 1:9. Phần dịch nổi được ly tâm ở tốc độ 2.500 × g trong 10 phút trong điều kiện bồn nước đá, sau đó thu được 10% dịch đồng nhất từ ​​phần dịch nổi, được sử dụng để phát hiện hoạt tính của enzyme, chủ yếu bao gồm phosphatase kiềm (AKP), phosphatase axit (ACP), catalase (CAT), malonaldehyde (MDA) và superoxide dismutase (SOD), bằng cách sử dụng bộ dụng cụ thử nghiệm thương mại tương ứng (Viện Kỹ thuật sinh học Jiengcheng Nam Kinh, Trung Quốc). Các chất trong đường ruột được sử dụng để phát hiện những thay đổi trong hàm lượng SCFA sau thử nghiệm cảm nhiễm. Tất cả các quy trình xử lý động vật đã được ủy ban đạo đức của “Quy định về quản lý các vấn đề liên quan đến động vật thí nghiệm” xem xét và phê duyệt.

KẾT QUẢ

Phân lập và định danh vi khuẩn

Tổng cộng 7/102 chủng vi khuẩn phân lập từ ruột cua bùn tạo ra nồng độ butyrate cao (>2 mM) (Hình 1A). Trình tự 16S rRNA được so sánh với các trình tự cơ sở dữ liệu có sẵn bằng cách sử dụng tìm kiếm BLASTN và kết quả được thể hiện trong Hình 1B. Tìm kiếm BLASTN và phân tích phát sinh loài cho thấy G13 rất giống với loài Clostridium butyricum (số hiệu NR_113244.1) (99,85%) và được xác định là C. butyricum G13 (số hiệu GenBank OQ607756). Phân tích cây phát sinh loài cho thấy C. butyricum G13 tạo thành một cụm riêng biệt với Clostridium spp. (Hình 1C). Hơn nữa, kết quả cho thấy trong số các phân lập vi khuẩn thu được, C. butyricum G13 tạo ra nồng độ butyrate cao nhất, do đó, nó được chọn làm chủng đại diện cho các nghiên cứu tiếp theo. C. butyricum G13 là vi khuẩn Gram dương, có hình que ngắn (1 đến 2 μm), khuẩn lạc tròn, trắng, ẩm và phát triển nhanh trên thạch peptone-yeast extract (PY) (đường kính 30 mm sau 2 ngày nuôi cấy). Các đặc điểm hình thái của C. butyricum G13 được thể hiện trong Hình 1D.

HÌNH 1 Phân lập, định danh và mô tả đặc điểm in vitro của C. butyricum G13. (A) Sản xuất axit butyric trong môi trường PY ủ với các chủng vi khuẩn khác nhau (bao gồm C. butyricum G13). (B) Định danh vi khuẩn sản xuất butyrat dựa trên trình tự 16S rRNA và so sánh với trình tự cơ sở dữ liệu có sẵn bằng cách sử dụng tìm kiếm BLASTN. (C) Cây phát sinh loài liên kết lân cận cho thấy mối quan hệ giữa C. butyricum G13 và các loài khác (số hiệu truy cập trong ngoặc đơn), được tạo bởi phần mềm MEGA 5.2.2; các số ở các nhánh biểu thị các giá trị hỗ trợ bootstrap (1.000 lần sao chép). (D) Hình thái của C. butyricum G13 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét. (E đến G) Sự phát triển của C. butyricum G13 ở các mức pH, NaCl và muối mật khác nhau. (H và I) và hoạt động Amylase và xét nghiệm hemolymp tương ứng. (J) Hoạt tính kháng khuẩn của C. butyricum G13 đối với vi khuẩn gây bệnh. (K) Tính nhạy cảm với kháng sinh của Clostridium butyricum G13. (L) Sản xuất axit béo chuỗi ngắn (SCFA) trong môi trường nuôi cấy PY bổ sung C. butyricum G13 (G13), G13 và tinh bột kháng (G13+RS), G13 và GOS (G13+GOS), hoặc G13, tinh bột kháng và GOS (G13+RS+GOS) sau quá trình lên men trong ống nghiệm của ruột cua bùn. So sánh sự khác biệt giữa từng nhóm kết hợp với phân tích kiểm định t-test (P < 0,05) và sự khác biệt có ý nghĩa được biểu thị bằng dấu hoa thị (*, P < 0,05; **, P < 0,01).

Các đặc điểm sinh học của C. butyricum G13 đã được xác định và kết quả cho thấy vi khuẩn có thể phát triển trong phạm vi rộng của pH từ 4 đến 9, nồng độ NaCl (1 đến 2,5%) và nồng độ muối mật (0,2 đến 1,0%) (Hình 1E đến G). Vi khuẩn biểu hiện hoạt động amylase mạnh, với vùng ức chế có đường kính 14 mm (Hình 1H). Kết quả hoạt động hemolymp cho thấy C. butyricum G13 không độc và hoạt động này được phân loại là hemolymp gamma (Hình 1I). C. butyricum G13 cho thấy tính kỵ nước cao, 43,8% (mật độ quang học ở 560 nm [OD₅₆₀] của huyền phù vi khuẩn có và không có xylen lần lượt là 1,345 và 0,907), cho thấy khả năng bám dính mạnh của vi khuẩn vào đường ruột. Kết quả xét nghiệm kháng khuẩn cho thấy C. butyricum G13 ức chế sự phát triển của các tác nhân gây bệnh V. parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Vibrio harveyi, V. alginolyticus và Aeromonas hydrophila, với đường kính vùng ức chế >9 mm (Hình 1J). Kết quả nhạy cảm với kháng sinh cho thấy C. butyricum G13 nhạy cảm với penicillin, ampicillin, amikacin, amoxicillin, enrofloxacin, cefuroxime, chloramphenicol, cephazolin, gentamicin, midecamycin, polymyxin và minocycline; nhạy cảm với oxacillin, erythromycin, neomycin và tetracycline và kháng với ceftazidime, vancomycin và trimethoprim (Hình 1K).

Theo Huifen Liang, Ngoc Tuan Tranh, Taoqiu Deng, Jinkun Lia, Yifan Lei, Mohammad Akibul Hasan Bakky, Ming Zhang, Rui Li, Wenxuan Chen, Yueling Zhang, Xiuli Chen, Shengkang Li

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/org/science/article/pii/S2165049723004961

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

• Tác dụng của mannan oligosaccharide trong khẩu phần ăn đối với tôm thẻ chân trắng
• Các chất hóa học thực vật bromelain có thể tăng cường sự phát triển và cung cấp khả năng bảo vệ lâu dài cho tôm chống lại AHPND
• Đánh Giá Hạt Sấy Khô Bằng Phương Pháp Chưng Cất Với Chất Hòa Tan Trong Khẩu Phần Ăn Cho Tôm Thẻ Chân Trắng Litopenaeus Vannamei nuôi Trong Điều Kiện Ao