English
中文 (中国)
Tóm tắt
Crom hóa trị sáu (Cr6+) là một chất gây ô nhiễm kim loại trong cơ thể và gây ra mối đe dọa lớn đến sức khỏe sinh học và hệ sinh thái do độc tính và sự khuếch đại sinh học của nó. Tuy nhiên, các rủi ro sức khỏe tiềm ẩn đối với cua bùn và con người do khẩu phần ăn quá nhiều Cr6+ hiện vẫn chưa được biết đến. Do đó, một thử nghiệm cho ăn kéo dài 9 tuần đã được tiến hành để đánh giá tác động độc hại của các mức Cr6+ trong khẩu phần ăn (1.4, 77.5 và 312.2 mg/kg) đối với cua bùn (Scylla paramamosain). Kết quả chỉ ra rằng mức Cr6+ trong khẩu phần ăn không có tác động đáng kể đến hiệu suất tăng trưởng của cua bùn. Nồng độ Cr trong gan tụy và cơ tăng đáng kể khi mức Cr6+ trong khẩu phần ăn tăng từ 1.4 đến 312.2 mg/kg. Khả năng chống oxy hóa của cua bùn được tăng cường bằng cách tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) và khả năng dọn gốc tự do hydroxyl (SCHR) để chống lại độc tính của Cr6+. Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê về tốc độ apoptosis trong tế bào máu giữa tất cả các nghiệm thức. Mức độ biểu hiện của gen caspase 2 liên quan đến apoptosis trong tế bào máu tăng đáng kể khi mức Cr6+ trong khẩu phần ăn tăng từ 1.4 lên 312.2 mg/kg. Về an toàn thực phẩm, cua được cho ăn khẩu phần ăn có 77.5 và 312.2 mg/kg Cr6+ có giá trị thương số nguy cơ mục tiêu (THQ) lớn hơn 1 đối với gan tụy, cho thấy nguy cơ nghiêm trọng đối với người tiêu thụ. Theo phân tích nguy cơ ung thư mục tiêu (TCR), những người ăn cơ trong khẩu phần ăn cua bùn có 312.2 mg/kg Cr6+ có nguy cơ ung thư không thể chấp nhận được. Nhìn chung, kết quả của nghiên cứu hiện tại chỉ ra rằng cua bùn có khả năng kháng độc tính Cr6+ mạnh và khẩu phần ăn có quá nhiều Cr6+ không làm giảm hiệu suất tăng trưởng và tỷ lệ sống, stress oxy hóa và apoptosis ở cua bùn. Cr6+ dư thừa tích tụ trong các mô như gan tụy và cơ, và việc tiêu thụ mô cua được cho ăn khẩu phần ăn có 77.5 và 312.2 mg/kg Cr6+ sẽ gây ra nguy cơ ung thư và sức khỏe ở người.
1. Giới thiệu
Một loạt các hoạt động của con người đã dẫn đến việc xử lý chất thải không đúng cách khiến môi trường ngày càng bị ô nhiễm các kim loại nặng độc hại (Aslam và Yousafzai, 2017). Môi trường nước tiếp nhận một lượng lớn chất thải và thường là nơi chứa cuối cùng các chất gây ô nhiễm kim loại nặng (Velma và cộng sự, 2009). Nồng độ kim loại nặng thải ra môi trường trong quá trình sản xuất công nghiệp đã tăng đáng kể và ô nhiễm kim loại nặng hiện đã trở thành mối nguy hiểm nghiêm trọng đối với sức khỏe của động vật thủy sinh và con người (Fung và cộng sự, 2004; Gao và cộng sự, 2014; Luo và cộng sự, 2014). Crom (Cr) là một kim loại nặng có trong tự nhiên với nhiều trạng thái hóa trị khác nhau, thường tồn tại trong môi trường dưới dạng crom hóa trị ba (Cr3+) và crom hóa trị sáu (Cr6+) (Patlolla và cộng sự, 2009). Cr3+ là thành phần cấu trúc của yếu tố dung nạp glucose (GTF), đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucose (Zhang và cộng sự, 2022). Ngược lại, Cr6+ độc hại và gây ung thư hơn Cr3+ (Agustini và Sanjaya, 2018; Sabonian và Mahanpoor, 2019), nó được phân loại là chất gây ung thư và có đặc tính gây đột biến và gây dị tật đối với sức khỏe con người (Velma và cộng sự, 2009). Điều nghiêm trọng hơn là với nhu cầu quá mức từ các hoạt động sản xuất công nghiệp này, hầu hết nước thải chưa qua xử lý đều thải Cr6+ vào nước (Awasthi và cộng sự, 2018).
Một trong những cơ chế độc tính quan trọng của Cr6+ đối với sinh vật thủy sinh là thúc đẩy sản xuất quá mức các loài oxy phản ứng (ROS) và gây ra stress oxy hóa (Awasthi et al., 2018; Feng et al., 2017; García-Rodríguez et al., 2016; Singh và Chowdhuri, 2018). Khi vào tế bào, Cr6+ đầu tiên được chuyển thành các chất trung gian phản ứng là crom hóa trị năm (Cr5+) và crom hóa trị bốn (Cr4+), có khi được chuyển thành Cr3+ ổn định hơn thông qua quá trình khử tế bào (Liu và Shi, 2001; Sugiyama et al., 1991). Những Cr chuyển đổi này có thể trực tiếp làm tăng sản xuất ROS bằng cách xúc tác cơ chế chu trình oxy hóa khử giống như fenton (Shi và Dalal, 1990), cơ chế này cũng có thể gián tiếp thúc đẩy căng thẳng gốc tự do thông qua tương tác với chuyển hóa lysosome và ty thể, v.v. (Pourahmad và O’Brien, 2001). Sản xuất ROS quá mức cũng có thể làm hỏng các phân tử sinh học như DNA, lipid và protein, từ đó gây ra apoptosis và chết tế bào (Awasthi và cộng sự, 2018; Kim và cộng sự, 2015; Marouani và cộng sự, 2015; Sun và cộng sự, 2015). Cr6+ có hại cho thực vật và động vật trong môi trường nước và cũng gây ra sức khỏe con người (Garg và cộng sự, 2012). Với sự tích tụ Cr6+ sinh học trong các sinh vật thủy sinh, nồng độ lớn Cr6+ được nạp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn (Garg và cộng sự, 2012). Do tính bền bỉ, thời gian bán hủy sinh học dài và độc tính tiềm ẩn, Cr6+ có thể gây ra mối đe dọa lớn đối với sức khỏe con người khi xâm nhập vào cơ thể người (Bonsignore và cộng sự, 2018).
Cua bùn (Scylla paramamosain) phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên thế giới. Ở Trung Quốc, cua bùn được tìm thấy ở hầu hết các tỉnh dọc theo bờ biển đông nam, chẳng hạn như Hải Nam, Quảng Đông, Phúc Kiến và Chiết Giang (Li và cộng sự, 2018). Cua bùn có đặc điểm là tăng trưởng nhanh và thịt ngon, nên được người tiêu dùng ưa chuộng trong những năm gần đây (Zhao và cộng sự, 2015). Với sự phát triển của công nghiệp hóa vùng duyên hải trong những năm gần đây, ô nhiễm Cr6+ trên biển đã trở thành một vấn đề môi trường ngày càng nghiêm trọng (Yang và cộng sự, 2020). Vì môi trường sống và thức ăn của cua bùn thường bị ô nhiễm bởi nhiều kim loại nặng khác nhau, nên đây cũng là một sinh vật chỉ thị phù hợp để theo dõi tác động độc tính của kim loại nặng đối với động vật giáp xác trong môi trường nước (Zhu và cộng sự, 2018). Động vật thân mềm có khả năng tích tụ sinh học kim loại mạnh, chúng cũng là nguồn thức ăn quan trọng cho cua (Luo và cộng sự, 2014; Li và cộng sự, 2018). Ở các vùng ven biển bị ô nhiễm kim loại nặng của Trung Quốc, các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng nồng độ Cr trong động vật thân mềm lên tới gần 80 mg/kg (trọng lượng khô) (Gao và cộng sự, 2014). Nhưng ở các vùng ven biển không bị ô nhiễm của Trung Quốc, động vật thân mềm chỉ chứa gần 2,18 mg/kg Cr (trọng lượng khô) (Fung và cộng sự, 2004). Đã có báo cáo rằng khi giá trị THQ (thương số nguy cơ mục tiêu) lớn hơn 1 mg/kg Cr, điều này cho thấy nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người khi tiêu thụ các sản phẩm thủy sản có chứa Cr (USEPA, 2011). Nồng độ Cr trong cua bùn cũng có thể quá cao do sự khuếch đại sinh học và việc con người tiêu thụ cua bùn bị ô nhiễm Cr6+ có thể gây ra nguy cơ cho sức khỏe. Do đó, tác động tiềm ẩn của việc gia tăng ô nhiễm Cr6+ đã thu hút sự chú ý của các nhà độc chất sinh thái (Yang và cộng sự, 2020). Trong nghiên cứu này, 1.4 mg/kg Cr6+ (nồng độ Cr6+ trong thành phần thức ăn) trong khẩu phần ăn đối chứng đã được sử dụng để phản ánh diện tích tự nhiên không bị ô nhiễm, 77.5 mg/kg Cr6+ để phản ánh diện tích ô nhiễm kim loại và 312.2 mg/kg Cr6+ để nghiên cứu nguy cơ tiềm ẩn của ô nhiễm Cr dư thừa đối với cua bùn. Mục tiêu của nghiên cứu hiện tại là đánh giá các tác động mãn tính của mức Cr6+ trong khẩu phần ăn đối với tỷ lệ sống, tăng trưởng, stress oxy hóa và apoptosis của cua con và để làm sáng tỏ các rủi ro sức khỏe đối với những người tiêu thụ cua bùn bị ô nhiễm Cr6+.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1 Hướng dẫn đạo đức
Các điều khoản về phúc lợi động vật và giải quyết được thực hiện trong nghiên cứu này đã được Ủy ban nghiên cứu động vật và đạo đức của Đại học Ninh Ba thống nhất.
2.2 Khẩu phần ăn thử nghiệm
Ba khẩu phần ăn isonitrogenous (khoảng 48% protein thô) và iso lipidic (khoảng 8% lipid thô) được xây dựng để chứa các mức Cr6+ khác nhau (kali dichromate là nguồn Cr, Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.). Kali dichromate được thêm vào khẩu phần ăn cơ bản ở mức 0, 0,28 và 1,13 g/kg, giá trị phân tích của Cr trong ba khẩu phần ăn lần lượt là 1.4 (khẩu phần ăn cơ bản), 77.5 và 312.2 mg/kg (Bảng S1). Các khẩu phần ăn thử nghiệm được chuẩn bị theo các phương pháp như đã mô tả chi tiết trước đây (Luo và cộng sự, 2021). Tóm lại, tất cả các thành phần được sàng qua máy nghiền 80 lưới, hỗn hợp khoáng chất và vitamin được thêm vào các thành phần lớn hơn bằng phương pháp giãn nở dần dần để trộn đều, sau đó thêm lipid và nước cất (350 g/kg) và trộn đều lại bằng máy trộn Hobart. Các khẩu phần ăn được đùn thành các dải bằng máy đùn (F-26, Nhà máy cơ khí của Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc) và sau đó cắt thành thức ăn viên cứng có đường kính lần lượt là 2,0 mm và 3,0 mm bằng máy tạo viên (G-250, Nhà máy cơ khí của Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc). Các khẩu phần ăn đã chuẩn bị được đun nóng ở 90℃ trong 30 phút, sấy khô trong không khí đến độ ẩm khoảng 100 g/kg, sau đó các khẩu phần ăn được đóng gói chân không và bảo quản ở nhiệt độ -20℃ cho đến khi sử dụng.
2.3 Nuôi cua và điều kiện thử nghiệm
Các thử nghiệm cho ăn được tiến hành tại cơ sở thí nghiệm của Cơ sở Meishan thuộc Đại học Ninh Ba, và cua giống được lấy từ cơ sở nhân giống địa phương. Trước khi tiến hành thí nghiệm cho ăn, cua được nuôi trong bể nuôi tuần hoàn (RAS) 50 L (48,3 × 28,4 × 38 cm) trong hai tuần để thích nghi với môi trường phòng thí nghiệm và được cho ăn khẩu phần ăn thương mại (khoảng 450,0 g/kg protein thô, 100,0 g/kg lipid thô) trong hai tuần để thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm. Nước biển được xử lý bằng một loạt các bộ lọc, bao gồm hệ thống lọc cơ học và sinh học, và làm sạch liên tục bằng đèn cực tím (UV). Cua được nuôi trong hệ thống chiếu sáng nhân tạo gồm khoảng 12 giờ sáng và 12 giờ tối (8:00 sáng đến 8:00 tối). Tổng cộng có 96 con cua con khỏe mạnh, hoạt động bình thường và có kích thước tương tự nhau (trọng lượng ban đầu 21,34 ± 0,61 g) được phân bổ ngẫu nhiên vào 24 bể nuôi. Từng con cua sẽ ở một khu vực riêng biệt (hai tấm chắn phân cách trong mỗi bể nuôi, chia thành bốn khu vực riêng biệt) để ngăn ngừa cua hung dữ và mỗi khẩu phần ăn thử nghiệm được chỉ định ngẫu nhiên cho bốn lần lặp lại với tám con cua ở mỗi lần lặp lại (sự phân bố của thiết kế thử nghiệm được thể hiện trong Hình 1). Cua được cho ăn một lần mỗi ngày cho đến khi no rõ ràng với 4–6% trọng lượng cơ thể ướt lúc 18:00 trong thử nghiệm cho ăn kéo dài 9 tuần. Phân và thức ăn thừa được loại bỏ hàng ngày và 40% nước biển được thay mới sau mỗi hai ngày để duy trì chất lượng nước. Trong thời gian thử nghiệm, độ mặn khoảng 22–25 ppt, nhiệt độ nước là 26–28℃, oxy hòa tan là 6,50 × 10-3 – 7,20 × 10-3 kg/m3, nitơ amoniac nhỏ hơn 1 × 10-5 kg/m3 và pH là 7,3–7,5.
Hình 1. Phân bố thiết kế thử nghiệm. Khẩu phần ăn 1, 1.4 mg/kg Cr6+; khẩu phần ăn 2, 77.5 mg/kg Cr6+; khẩu phần ăn 3, 312.2 mg/kg Cr6+.
2.4 Thu thập mẫu
Vào cuối thử nghiệm cho ăn, tất cả cua đều nhịn ăn trong 24 giờ và cân để xác định tỷ lệ sống, phần trăm tăng trọng (PWG) và tốc độ tăng trưởng riêng (SGR). Hemolymp được lấy từ bốn con cua trong mỗi lần lặp lại sau khi gây mê bằng đá. Một phần mẫu hemolymp được thu thập trong các ống chứa đệm chống đông ACD lạnh (natri citrat 1,32%, axit citric 0,48%, glucose 1.47%) và ly tâm ngay lập tức ở tốc độ 956 g trong 10 phút ở 4℃ (Eppendorf 5810 R, Đức) để tách các tế bào máu, sau đó được sử dụng cho xét nghiệm đo lưu lượng tế bào và phân tích biểu hiện gen. Một phần khác của mẫu hemolymp được cho vào các ống ly tâm 1,5 ml và để yên trong 24 giờ ở 4℃ trước khi ly tâm (956 x g, 10 phút). Phần dịch nổi được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ -80℃ trước khi phân tích các thông số sinh hóa và hoạt tính của enzyme. Các mẫu gan tụy của cùng bốn con cua trên mỗi lần lặp lại được mổ nhanh và lưu trữ trong dung dịch bảo vệ RNA (Công ty TNHH Khoa học và Công nghệ Solarbio Bắc Kinh) trước khi phân tích biểu hiện gen, cùng một đoạn gan tụy được đông lạnh ngay lập tức trong nitơ lỏng và sau đó được lưu trữ ở nhiệt độ -80℃ để xác định các thông số sinh hóa và hoạt tính của enzyme. Các mẫu gan tụy, cơ và mai ở cùng một vị trí được thu thập bởi hai con cua khác trên mỗi lân lặp lại và được lưu trữ ở nhiệt độ -80℃ trước khi xác định thành phần cơ thể và nồng độ Cr. Cua bùn nuôi và hoang dã được lấy từ chợ thủy sản địa phương, trong đó gan tụy và cơ ở cùng một vị trí được thu thập từ hai con cua trên mỗi lần lặp lại và được lưu trữ ở nhiệt độ -80℃ trước khi phân tích nồng độ Cr, THQ và nguy cơ ung thư mục tiêu (TCR) trong gan tụy.
2.5 Phân tích nồng độ Cr
Phân tích nồng độ Cr trong mô được xác định bằng phương pháp đã mô tả trước đây của Shi và cộng sự (2021). Tóm lại, các mẫu được đông khô và cân trước khi tiêu hóa bằng axit, các mẫu được tiêu hóa trong dung dịch HNO3 68% ở 80℃ và cuối cùng Cr được xác định bằng máy quang phổ phát xạ plasma cảm ứng (ICP-OES, PE 2100DV, Perkin Elmer, Hoa Kỳ).
2.6 Phân tích hoạt tính của enzyme trong gan tụy và hemolymp
Mô gan tụy được cân chính xác, đồng nhất trên đá bằng cách thêm chín lần thể tích nước muối theo tỷ lệ khối lượng (g): thể tích (ml) = 1: 9, sau đó ly tâm ở 850 x g trong 10 phút ở 4℃. Thu thập phần dịch nổi và sử dụng để phân tích các thông số sinh hóa tiếp theo. Hoạt động của gốc tự do hydroxyl (SCHR), superoxide dismutase (SOD), tổng khả năng chống oxy hóa (T-AOC), alanine aminotransferase (GPT), aspartate aminotransferase (GOT) và nồng độ malondialdehyde (MDA) và glutathione (GSH) trong gan tụy được đo bằng bộ dụng cụ chẩn đoán liên quan (Công ty Nanjing Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt tính của SOD, T-AOC và SCHR cũng như nồng độ MDA và GSH trong hemolymp được thử nghiệm bằng Multiskan spectrum (Thermo) bằng bộ dụng cụ chẩn đoán (Công ty Nanjing Jiancheng, Nam Kinh, Trung Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.7 PCR định lượng thời gian thực
Chiết xuất RNA, phiên mã ngược và PCR định lượng thời gian thực được tiến hành theo các phương pháp được mô tả chi tiết trước đây (Luo và cộng sự, 2020). Tóm lại, RNA được chiết xuất và phiên mã ngược lần lượt bằng TRIzol Reagent (Vazyme, Trung Quốc) và bộ HiScript® RT SuperMix Reagent (Vazyme, Trung Quốc). Các đoạn mồi cụ thể được trình bày trong Bảng S2. Các thành phần phản ứng và điều kiện chu kỳ khuếch đại PCR được mô tả trong nghiên cứu trước đây (Zhang và cộng sự, 2022). Mức độ biểu hiện tương đối được tính toán bằng phương pháp 2–ΔΔCt (Livak và Schmittgen, 2001), với β-actin được sử dụng làm gen housekeeping, với nhóm cơ bản (Cr 1.4) được sử dụng làm nhóm đối chứng/tham chiếu.
2.8 Xét nghiệm phân tích tế bào dòng chảy
Tỷ lệ apoptosis của tế bào máu được thực hiện theo các phương pháp được mô tả chi tiết trước đây (Liu và cộng sự, 2020a). Tóm lại, các tế bào máu thu thập được trong các nghiệm thứuc được rửa hai lần bằng PBS. Bộ dụng cụ phát hiện apoptosis Annexin-VFITC (MultiSciences Biotech Co., Ltd, Trung Quốc) được sử dụng để xác định mức độ apoptosis của tế bào máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Tóm lại, 2 × 106 tế bào máu được huyền phù lại trong 200 μL đệm liên kết Annexin V-FITC. Sau đó, hỗn hợp 10 μL PI và 5 μL Annexin VFITC được thêm vào tế bào để nhuộm Annexin V-FITC/PI. Cuối cùng, các mẫu được ủ trong bóng tối trong 10 phút ở 25℃ trước khi được phân tích bằng FACScan (Becton Dickinson Biosciences, Hoa Kỳ).
2.9 Tính toán và phân tích thống kê
PWG (%) = 100 × [Trọng lượng cơ thể cuối cùng (g) – Trọng lượng cơ thể ban đầu (g)] / Trọng lượng cơ thể ban đầu (g);
SGR (%/ ngày) = 100 × [Ln (trọng lượng cơ thể cuối cùng) – Ln (trọng lượng cơ thể ban đầu)] / ngày thử nghiệm;
Tỷ lệ sống (%) = 100 × (số lượng cua cuối cùng) / (số lượng cua ban đầu);
Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR) = lượng thức ăn tiêu thụ (g) / [trọng lượng cơ thể cuối cùng (g) + trọng lượng cơ thể chết (g) – trọng lượng cơ thể ban đầu (g)];
Lượng thức ăn tiêu thụ (FI, %/ ngày) = 100 × lượng thức ăn tiêu thụ / [(trọng lượng cơ thể cuối cùng + trọng lượng cơ thể ban đầu) / 2] / ngày thử nghiệm;
THQ = ((cf x EFr x ED x FIR) / (RfD x Bw x AT)) × CF
TCR = ((cf x EFr x ED x FIR x CSF) / (Bw x AT)) × 10−3
trong đó cf, nồng độ kim loại nặng trong mỗi mô của cua bùn (trọng lượng ướt); EFr, tần suất tiêu thụ (ngày/năm); ED, thời gian tiêu thụ (năm)；FIR, tỷ lệ tiêu thụ (người lớn 29,6 g/ngày, trẻ em 17,76 g/ngày, tỷ lệ trẻ em ăn cua bằng 60% so với người lớn theo Zhai và Yang, 2006); RfD, liều tham chiếu để tiêu thụ (RfD 0,003 mg/kg/ngày đối với Cr được lấy từ USEPA (2012); Bw, cân nặng trung bình (55,9 kg đối với người lớn và 32,7 kg đối với trẻ em, dữ liệu từ Gupta và cộng sự, 2015); AT, thời gian trung bình tiếp xúc với chất không gây ung thư (Efr × ED); CF, hệ số chuyển đổi (10-3 kg/mg, từ USEPA, 2012); CSF, hệ số độ dốc gây ung thư đường uống (0,50 mg/kg/ngày, dữ liệu từ USEPA, 2012).
Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình đã được kiểm tra bằng ANOVA một chiều theo sau là kiểm định đa phạm vi của Tukey. Dữ liệu trong toàn bộ văn bản được thể hiện dưới dạng giá trị trung bình ± SEM như đã chỉ ra và các chữ cái khác nhau chỉ ra sự khác biệt giữa các nghiệm thức.
Theo Yingying Zhang, Jiaxiang Luo, Tingting Zhu, Zheng Yang, Min Jin, Lefei Jiao, Qicun Zhou
Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352513422003933
Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh
TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG
Xem thêm:
- Phần 1: Crom trong khẩu phần ăn có thể cải thiện sự tăng trưởng, khả năng chống oxy hóa, sự tích tụ crom trong các mô và biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa glucose và lipid ở cua con Scylla paramamosain
- Phần 2: Crom trong khẩu phần ăn có thể cải thiện sự tăng trưởng, khả năng chống oxy hóa, sự tích tụ crom trong các mô và biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình chuyển hóa glucose và lipid ở cua con Scylla paramamosain
- Sử Dụng Hỗn Hợp Các Phụ Phẩm Thực Vật (Jatropha curcas) Và Động Vật (Cá Ủ Chua) Làm Nguồn Protein Trong Khẩu Phần Ăn Của Tôm (Litopenaeus Vannamei)