Đánh giá vai trò của việc bổ sung tryptophan trong việc tăng trưởng, giảm hành vi hung hăng và tăng cường khả năng miễn dịch ở cua con Scylla paramamosain

Tóm tắt

Nghiên cứu này nhằm xác định mức tryptophan (Trp) trong khẩu phần ăn tối ưu cho cua bùn Scylla paramamosain và đánh giá tác động lên sự tăng trưởng, hành vi hung hăng và khả năng miễn dịch. Qua thử nghiệm cho ăn trong 56 ngày với 5 khẩu phần ăn có mức Trp lần lượt là 2,94, 3,38, 3,68, 4,05 và 4,39 g Trp/kg thức ăn (khẩu phần ăn khô) cho thấy khi bổ sung 3,68 g Trp/kg đã tối đa hóa sự tăng trưởng và làm tăng đáng kể hàm lượng protein, mức axit amin thơm, hoạt động của enzyme tiêu hóa và biểu hiện của các gen liên quan đến tổng hợp protein (Tor và S6k1) (P < 0,05). Khẩu phần ăn có 4,05 g Trp/kg làm giảm hành vi hung hăng (P < 0,05), dẫn đến tăng mức serotonin (P < 0,05), cho thấy Trp có thể được chuyển hóa thành serotonin trong cơ thể sống để ngăn chặn hành vi hung hăng. Mặc dù Trp có vai trò quan trọng trong tăng trưởng, nhưng việc bổ sung quá nhiều (trên 4,05 g/kg) lại làm giảm hoạt tính của các enzyme miễn dịch như trypsin và lysozyme, tiềm ẩn nguy cơ gây hại cho sức khỏe của cua con. Phân tích hồi quy đa thức bậc hai, sử dụng dữ liệu về tỷ lệ tăng trọng (WGR) và tỷ lệ tăng trưởng riêng (SGR), cho thấy phạm vi bổ sung Trp trong khẩu phần ăn tối ưu là 3,94–3,98 g/kg đối với S. paramamosain non. Những kết quả này cung cấp thông tin chi tiết có giá trị để xây dựng khẩu phần ăn trong nuôi trồng thủy sản giáp xác, có thể cải thiện hiệu suất tăng trưởng và hỗ trợ phúc lợi động vật của cua bùn.

1. Giới thiệu

Các axit amin chức năng đang là tâm điểm của các nghiên cứu gần đây nhờ vào vai trò đa dạng và quan trọng của chúng trong các quá trình sinh học (Takagi, 2019; Ren và cộng sự, 2020). Các axit amin này không chỉ bao gồm các axit amin thiết yếu mà còn bao gồm một số axit amin không thiết yếu (Ren và cộng sự, 2020). Các axit amin chức năng phát huy tác dụng sinh học bằng cách tham gia vào các con đường chuyển hóa cụ thể, bao gồm điều chỉnh hệ thống miễn dịch, tăng cường sức khỏe đường ruột và thúc đẩy quá trình dị hóa và đồng hóa protein của động vật thủy sinh (Wu, 2010; Hoseini và cộng sự, 2019).

Tryptophan (Trp) là một axit amin thiết yếu và là một axit amin chức năng quan trọng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tăng trưởng, ăn uống, miễn dịch và hành vi của động vật thủy sinh (Cerqueira và cộng sự, 2020). Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc bổ sung Trp đầy đủ có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ sống và tăng trọng của tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei (Sun và cộng sự, 2016), cá tráp mõm Megalobrama amblycephala (Ji và cộng sự, 2019) và cá trắm cỏ non Ctenopharyngodon idellus (Wen và cộng sự, 2014). Ngoài ra, Trp thúc đẩy quá trình tổng hợp protein bằng cách tăng biểu hiện của các gen chính trong con đường truyền tín hiệu TOR, điều chỉnh quá trình tổng hợp protein để đáp ứng với tình trạng sẵn có của axit amin và các yếu tố khác, do đó hỗ trợ sự tăng trưởng và chức năng tế bào (Bond, 2016). Ngoài ra, mức khẩu phần ăn Trp tối ưu làm tăng đáng kể hoạt động của enzyme chống oxy hóa, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hóa bằng cách trung hòa các loại oxy phản ứng (ROS) ở động vật thủy sinh (Wang, 2013; Qiu và cộng sự, 2015; Xu, 2018). Hơn nữa, Trp đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh phản ứng miễn dịch của giáp xác (Huang và cộng sự, 2020), cho thấy sự biểu hiện cao của các gen liên quan đến miễn dịch bao gồm yếu tố giống NF-kappa-B Relish (Relish) (Sun và cộng sự, 2022) và Lysozyme (Ferraboschi và cộng sự, 2021). Việc tăng cường hoạt động của enzyme chống oxy hóa và các gen liên quan đến miễn dịch giúp tăng cường khả năng chịu đựng căng thẳng và chống lại bệnh tật của cơ thể (Mates và cộng sự, 1999). Do đó, cần việc xác định nhu cầu Trp tối ưu để thúc đẩy tăng trưởng khỏe mạnh, khả năng miễn dịch và cải thiện hiệu quả sinh sản của động vật thủy sản.

Hành vi hung hăng rất phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, gây ảnh hưởng đáng kể đến cả năng suất và phúc lợi của các sinh vật nuôi (Albalat và cộng sự, 2022). Các cuộc xung đột giữa các cá thể có thể dẫn đến tổn thương vật lý, làm giảm tỷ lệ sống và tốc độ tăng trưởng, đồng thời gia tăng nguy cơ lây lan bệnh tật (Albalat và cộng sự, 2022; Romano và Zeng, 2017). Vai trò ức chế của Trp trong khẩu phần ăn đối với hành vi hung hăng đã được ghi nhận ở nhiều loài thủy sinh khác nhau (Hoglund và cộng sự, 2005; Winberg và cộng sự, 2001; Harlıoglu và cộng sự, 2014; Sneddon và cộng sự, 2000), đặc biệt là ở các loài giáp xác như cua đồng Trung Quốc Eriochier sinensis (Pang và cộng sự, 2024) và cua bùn Scylla serrata (Laranja và cộng sự, 2010). Trp là tiền chất của serotonin (5-HT), tương tác với thụ thể 5-Hydroxytryptamine 1 (5-HTR1) để điều chỉnh tín hiệu nội bào và giảm giải phóng chất dẫn truyền thần kinh, từ đó ức chế hành vi hung hăng (Siegel và cộng sự, 2007). Làm rõ nhu cầu về Trp cũng như cơ chế mà Trp ảnh hưởng đến hành vi hung hăng có thể giúp cải thiện phúc lợi động vật và tăng hiệu quả sản xuất của động vật thủy sinh.

Scylla paramamosain, một thành viên của họ Portunidae và chi Scylla, là một loài giáp xác phân bố chủ yếu dọc theo các vùng ven biển đông nam của Trung Quốc. (Wu và cộng sự, 2024). S. paramamosain được công nhận là một trong bốn loài cua chính ở Trung Quốc, do tốc độ tăng trưởng nhanh, thời gian nuôi ngắn và giá trị kinh tế đáng kể, quy mô và sản lượng nuôi S. paramamosain đã tăng liên tục trong hai mươi năm qua (Li và cộng sự, 2018), với sản lượng hàng năm đạt 154.600 tấn theo báo cáo năm 2022 (Niên giám thống kê nghành nuôi trồng thủy sản Trung Quốc, 2023). Những tiến bộ trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản đã dẫn đến sự mở rộng đáng kể của ngành nuôi cua. Trong khi đó, nghiên cứu đang được tiến hành sâu hơn vào nhu cầu dinh dưỡng của axit amin chức năng đối với S. paramamosain (Wu và cộng sự, 2024, 2022). Tuy nhiên, bản chất hung hăng của S. paramamosain dẫn đến tỷ lệ chết, thương tích cao hơn và tác động tiêu cực đến sự tăng trưởng và năng suất chung của S. paramamosain (Romano và Zeng, 2017). Do đó, cần phải áp dụng một chiến lược quản lý phù hợp để giảm thiểu tác động của hành vi hung hăng của cua. Nghiên cứu này nhằm xác định lượng Trp cần thiết để thúc đẩy tăng trưởng và phản ứng miễn dịch của S. paramamosain, đồng thời giảm thiểu tác động của hành vi hung hăng. Dự kiến sẽ cung cấp cơ sở khoa học để phát triển thức ăn cua chất lượng cao nhằm thúc đẩy tăng trưởng và giảm ăn thịt đồng loại.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Khẩu phần ăn

Năm khẩu phần ăn isonitrogenous (45%) và iso-lipidic (11%) đã được xây dựng, với mức Trp lần lượt là 2,94, 3,38, 3,68, 4,05 và 4,39 g/kg (trọng lượng khô) (Sun và cộng sự, 2015; Jin và cộng sự, 2017). Bột cá và casein được sử dụng làm nguồn protein hoàn chỉnh, alanine được bổ sung để duy trì isonitrogenous của khẩu phần ăn (Bảng 1). Hỗn hợp axit amin trong thức ăn được xây dựng dựa trên thành phần axit amin của S. paramamosain (Wu và cộng sự, 2022, 2024). Hàm lượng axit amin chi tiết được trình bày trong Bảng 2. Các thành phần được xử lý thành bột mịn (<125 μm) bằng máy nghiền siêu nhỏ (WFS-8, Jiangsu Hongda Powder Equipment Co., Ltd., Trung Quốc). Hỗn hợp axit amin kết tinh được phủ carboxymethyl cellulose (CMC) và trộn đều trong máy khuấy (Alam và cộng sự, 2005). Sau đó, lipid và nước cất được đưa vào hỗn hợp khô để tạo thành bột đồng nhất. Bột được đùn thành các hạt 0,8 mm bằng máy đùn trục vít đôi (G-250, Đại học Công nghệ Nam Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc). Các hạt được hấp ở 45℃ trong 1 giờ và sấy khô trong không khí đến khối lượng không đổi. Sau đó, thức ăn được bảo quản trong điều kiện kín ở nhiệt độ – 20℃.

Bảng 1 Công thức thức ăn thử nghiệm và thành phần cơ thể (g/ kg chất khô).

^a. Mua từ Trident Seafoods Corporation, Seattle, Hoa Kỳ.

^b. Hỗn hợp axit amin, hỗn hợp g/kg: Isoleucine, 8,2; Leucine, 17,2; Arginine, 33,5; Methionine, 12,1; Phenylalanine, 8,7; Threonine, 10,8; tryptophan, 2,6; Valine, 9,4; Axit aspartic, 30,2; Axit glutamic, 36,3; Serine, 8,7; Proline, 1,9; Glycine, 33,8; Alanine, 22,7; Tyrosine, 9,5; cysteine, 6,5.

^c. Hỗn hợp vitamin, hỗn hợp g/kg: thiamine B1, 5,0; riboflavin, 8,0; nicotinamide, 26,0; biotin, 1,0; canxi pantothenat, 15,0; vitamin B6, 3,0; axit folic, vitamin B9, 5,0; vitamin C, 121,0; vitamin K, 2,02; axit p-aminobenzoic, 3,0; vitamin B12, 1,0; xenluloza, 529,0; vitamin A, 25,0; vitamin D3, 25,0; vitamin E, 50,0; inositol, 181,0.

^d. Hỗn hợp khoáng chất, hỗn hợp g/kg: canxi dihydro phosphat, 122,87; lactat, 474,22; natri dihydro phosphat, 42,03; kali persulfat, 163,83; sắt (II) sulfat, 10,78; sắt citrat, 38,26; magiê sulfat, 44,19; kẽm sulfat, 4,74; mangan sulfat, 0,33; đồng sunfat, 0,22; coban clorua, 0,43; iodat, 0,02; natri clorua, 32,33; kali clorua, 65,75.

Bảng 2 Thành phần axit amin (g/100 g thức ăn khô) trong thức ăn thí nghiệm

Lưu ý: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3; Trp: Tryptophan; Thr: Threonine; Val: Valine; Ile: Isoleucine; Leu: Leucine; Phe: Phenylalanine; Lys: Lysine; His: Histidine; Arg: Arginine; Met: Methionine; Asp: Axit aspartic; Ser: Serine; Glu: Axit glutamic; Pro: Proline; Gly: Glycine; Ala: Alanine; Cys: Cysteine; Tyr: Tyrosine.

2.2 Động vật

Cua con được lấy từ một trại giống thương mại ở Taizhou, Trung Quốc. Sau thời gian thích nghi kéo dài một tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm, 300 con cua có kích thước đồng đều (29,31 ± 6,13 mg) với các chi còn nguyên vẹn đã được chọn. Những con cua này được phân bổ ngẫu nhiên vào các thùng chứa 250 ml riêng lẻ và mỗi khẩu phần ăn được thiết lập ba lần lặp lại (20 con cua cho mỗi lần lặp lại). Một thí nghiệm trong nhà kéo dài 8 tuần đã được tiến hành, với các lần cho ăn hàng ngày được lên lịch vào lúc 9:30 sáng và 4:30 chiều. Thức ăn còn lại được loại bỏ và nước được thay hoàn toàn sau một giờ cho ăn. Quá trình lột xác và tỷ lệ chết hàng ngày đã được ghi lại. Nhiệt độ nước được duy trì trong khoảng từ 27 đến 29℃, độ mặn được giữ ở mức 27–28 g/L, oxy hòa tan luôn ở mức trên 6 mg/L và mức nitơ amoniac được giữ dưới 0,05 mg/L.

2.3 Thu thập mẫu và tính toán thông số tăng trưởng

Trước khi bắt đầu thí nghiệm, 60 con cua từ mỗi nghiệm thức được cân để ghi lại trọng lượng cơ thể ban đầu. Trước khi kết thúc thí nghiệm nuôi, cua con được nhịn ăn trong 24 giờ. Sau thí nghiệm nuôi, trọng lượng cơ thể cuối cùng của cua được ghi lại bằng cân điện tử (độ chính xác 0,001 g). Sau đó, các mẫu vật được đông lạnh nhanh trong nitơ lỏng và bảo quản ở nhiệt độ -80℃ để phân tích tiếp theo. Các thông số tăng trưởng được tính theo các công thức sau (Wu và cộng sự, 2024):

Trọng lượng cơ thể ban đầu (IBW, g/ cua);

Trọng lượng cơ thể cuối (FBW, g/ cua);

Tỷ lệ tăng trọng (WGR, %) = 100 × (FBW – IBW) / IBW;

Tỷ lệ tăng trưởng riêng (SGR, %/ ngày) = 100 × (ln (FBW) – ln (IBW)) / ngày;

Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR, g/ g) = lượng thức ăn khô tiêu thụ / tăng trọng ướt;

Tần suất lột xác (MF) = (Σ thời gian lột xác của mỗi con cua sống sót) / lượng cua cuối cùng;

Tỷ lệ sống (%) = 100 × (lượng cua cuối cùng) / (lượng cua ban đầu).

2.4 Phân tích thành phần sinh hóa

Các mẫu cua nguyên con được sấy khô đến trọng lượng không đổi bằng máy sấy đông lạnh (LL1500, Thermo, Waltham, Hoa Kỳ; − 110℃) hoặc lò nướng (105℃) để xác định hàm lượng ẩm của cả cua nguyên con và thức ăn. Theo AOAC (1995), protein thô (tổng nitơ) được đo bằng máy phân tích nitơ Kjeldahl (K355/K437, Buchi, Flawil, Thụy Sĩ), chất béo thô được xác định bằng thiết bị chiết Soxhlet (E816, Buchi, Flawil, Thụy Sĩ) và hàm lượng tro được đánh giá bằng lò nung ở 550℃.

Thành phần axit amin của thức ăn và cua nguyên con được phân tích bằng máy phân tích tự động (L-8900, Hitachi, Tokyo, Nhật Bản). Các mẫu đồng nhất đầu tiên được thủy phân trong dung dịch HCl 6,0 M ở 110℃ trong 24 giờ trong môi trường nitơ. Nhận dạng và số lượng axit amin được đánh giá bằng cách tham khảo thời gian lưu và diện tích đỉnh của axit amin chuẩn (Sigma-Aldrich, St. Louis. MO, Hoa Kỳ)

2.5 Xác định hoạt động của enzyme và các thông số chống oxy hóa

Các mẫu cua nguyên con được nghiền thành bột bằng cối gốm và trộn với nước muối đã làm lạnh trước theo tỷ lệ 1:9 (w:v) để tạo thành hỗn hợp đồng nhất. Sau đó, hỗn hợp đồng nhất được ly tâm ở tốc độ 2500 vòng/phút trong 10 phút ở 4℃ bằng máy ly tâm đông lạnh (Fresco17, Thermo Scientific, Waltham, Hoa Kỳ) để tách phần dịch nổi để phân tích tiếp theo. Tổng lượng protein được xác định bằng albumin huyết thanh bò làm chuẩn (Bradford, 1976).

Hoạt động của enzyme, bao gồm enzyme tiêu hóa (amylase (C016–2–1), trypsin (A080–2–1) và lipase (A054–2–1)), các thông số chống oxy hóa (malondialdehyde (MDA, A003–1–2), superoxide dismutase (SOD, A001–3–2), catalase (CAT, A007–1–1)), cũng như phosphatase axit (ACP, A060–2–1) và phosphatase kiềm (AKP, A059–2–2) đều được đo bằng bộ dụng cụ thương mại (Viện Kỹ thuật sinh học Tấn Thành Nam Kinh, Nam Kinh, Trung Quốc), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Serotonin (5-HT, ml874512), melatonin (MLT, ml025846), tryptophan hydroxylase (TPH, ml037506) và histone acetyltransferase (HAT, HZ68932 MLBIO) được đo bằng bộ dụng cụ Elisa (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., LTD, Trung Quốc), theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.6 Biểu hiện gen

Phân tích biểu hiện gen được tiến hành bằng cách chiết xuất RNA từ toàn bộ cua bằng thuốc thử Trizol (Invitrogen CA, Hoa Kỳ). Nồng độ và độ tinh khiết của tổng RNA được xác định bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 và điều chỉnh đến 500 ng/µl. cDNA thu được thông qua phiên mã ngược của tổng RNA bằng Bộ thuốc thử PrimeScript RT (Takara, Đại Liên, Trung Quốc). Các đoạn mồi Target of rapamycin (Tor), Ribosome protein S6 kinase beta-1 (S6k1), NF-kappa-B-like factor Relish (Relish), Lysozyme và 5-hydroxytryptamine receptor 1 (5-HTR1) được tổng hợp bởi Sangon Biotech Co. Ltd. Trung Quốc. Và trình tự của các đoạn mồi được thể hiện trong Bảng 3. Hệ thống PCR thời gian thực QuantStudio™ 6 Flex (Life Technologies, CA, Hoa Kỳ) được sử dụng cho qPCR. Tính toán biểu hiện gen tương đối được thực hiện theo Livak và Schmittgen (2001), với beta-actin đóng vai trò là đối chứng nội bộ.

Bảng 3 Trình tự của các đoạn mồi

Lưu ý:

^a Tor: Target of rapamycin.

^b S6k1: Ribosomal protein S6 kinase beta-1.

^c 5-HTR1: 5-hydroxytryptamine receptor 1.

^d Relish: NF-kappa-B-like factor Relish.

2.7 Đánh giá hành vi hung hăng

Trong giai đoạn giữa (tuần thứ 4) và giai đoạn cuối (tuần thứ 8) của thí nghiệm, 10 cặp cua con có trọng lượng cơ thể tương đương ở mỗi nghiệm thức được cho vào một hộp đựng 250 ml sau thời gian nhịn ăn 6 giờ. Hành vi của chúng được ghi lại trong một giờ bằng máy ảnh có độ phân giải cao (EOS R7, Canon, Nhật Bản) và sau đó được đánh giá dựa trên các mô tả về hành vi hung hăng được nêu trong Bảng 4 (Ayres-Peres và cộng sự, 2011; Zhu và cộng sự, 2021). Cụ thể, hành vi của cua con được phân loại thành ba cấp độ: tiếp cận hoặc đuổi theo, tiếp xúc vật lý nhẹ hoặc tấn công bằng cả hai càng và tấn công dữ dội. Sau đó, mỗi nhóm cua con được chấm điểm theo các định nghĩa chi tiết về các hành vi này để định lượng mức độ hung hăng của chúng. Thiết lập này được lặp lại 10 lần. Điểm hung hăng được tính theo công thức sau (Ayres-Peres và cộng sự, 2011; Zhu và cộng sự, 2021):

Điểm hung hăng = Số lần tiếp cận×1 + Số lần tiếp xúc×2 + Số lần chiến đấu×3

Bảng 4 Tiêu chí chấm điểm cho hành vi hung dữ của Scylla paramamosain

Hệ thống phân cấp	Hành vi	Mô tả
1	Tiếp cận	Một con cua tiếp cận hoặc đuổi theo con cua khác dọc theo mép bể mà không có bất kỳ hành động hung hăng cụ thể nào.
2	Tiếp xúc	Một con cua chạm vào con cua kia bằng chân đi bộ hoặc trèo lên lưng đối thủ, nhưng không có hành vi hung hăng nào. Con cua cấp dưới liên tục tránh con cua ở trên hoặc nhanh chóng rút lui đến một khu vực xa hơn. Cả hai con cua đều mở càng và chạm hoặc đánh nhau bằng càng, tham gia vào cuộc đối đầu giữa càng và càng. Con cua bị đánh bại phải vật lộn để trốn thoát.
3	Chiến đấu	Con cua dùng càng để đẩy và kéo nhau, khóa và kiềm chế lẫn nhau. Con cua chiếm ưu thế trèo lên lưng con cua bị đánh bại, nhấc bổng hoặc thậm chí lật ngược đối thủ, tạo nên một cuộc chiến rất dữ dội.

2.8 Phân tích thống kê

Tất cả dữ liệu được xử lý bằng thuật toán chuyển đổi hai bước như Templeton (2011) mô tả để ổn định phương sai, sau đó là kiểm định Shapiro-Wilk để đánh giá tính chuẩn và kiểm định Levene để kiểm tra tính đồng nhất của các phương sai. Để phân tích sự khác biệt về đặc điểm tăng trưởng, thành phần dinh dưỡng, hành vi và các chỉ số liên quan đến miễn dịch của cua con dưới các nồng độ Trp khác nhau, dữ liệu không tuân theo phân phối chuẩn (hành vi và biểu hiện gen) đã được phân tích bằng các kiểm định phi tham số (kiểm định Kruskal-Wallis), sau đó là kiểm định Steel-Dwass để so sánh nhiều lần. Dữ liệu còn lại tuân theo phân phối chuẩn ban đầu được đưa vào phân tích phương sai một chiều ANOVA, sau đó là kiểm định Tukey sau hoc để so sánh nhiều lần. Ngoài ra, để khám phá mối quan hệ giữa mức Trp và các thông số được đo, một phân tích thành phần chính (PCA) đã được tiến hành trên các chỉ số này. Tất cả các phân tích đều được thực hiện bằng phần mềm SPSS 26.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, Hoa Kỳ) và R 3.3.3 (Nhóm R Core, 2016).

3. Kết quả

3.1 Tỷ lệ sống và hiệu suất tăng trưởng

Trong nghiên cứu này, các nghiệm thức khác nhau của khẩu phần ăn thử nghiệm đã tác động đáng kể đến hiệu suất tăng trưởng của S. paramamosain non, như được trình bày chi tiết trong Bảng 5. Đáng chú ý, tỷ lệ sống ở những con non trong nhóm 3,38 g/kg cao hơn so với các nhóm khác, mặc dù không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Sự gia tăng Trp trong khẩu phần ăn có liên quan đến sự gia tăng đáng kể trong FBW, WGR và SGR của cua con (P < 0,05), với nhóm 3,68 g/kg đạt được các giá trị cao nhất (P < 0,05). Có FCR thấp nhất và MF cao nhất ở mức 3,68 g/kg (P < 0,05). Phân tích hồi quy đa thức bậc hai dựa trên WGR và SGR chỉ ra rằng mức bổ sung Trp tối ưu trong khẩu phần ăn của cua là 3,94–3,98 g/kg (8,87–9,96 g/kg protein trong khẩu phần ăn), như thể hiện trong Hình 1.

Bảng 5 Hiệu suất tăng trưởng của cua Scylla paramamosain được cho ăn chế độ ăn có chứa hàm lượng tryptophan khác nhau.

Lưu ý: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3. Dữ liệu có các chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể giữa các phương pháp xử lý (P < 0,05). IBW: Khối lượng cơ thể ban đầu; FBW: Khối lượng cơ thể cuối; WGR: Tỷ lệ tăng trọng; SGR: Tỷ lệ tăng trưởng cụ thể; FCR: Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn; MF: Tần suất lột xác.

Hình 1. Mối quan hệ giữa tỷ lệ tăng cân (WGR, %) (A) và tỷ lệ tăng trưởng cụ thể (SGR, % / ngày) (B) với mức Trp trong chế độ ăn. Thuật ngữ ‘Xopt’ biểu thị mức tryptophan trong chế độ ăn tối ưu giúp tối đa hóa cả WGR và SGR.

3.2 Thành phần toàn thân và axit amin

Thành phần toàn thân và axit amin của S. paramamosain được thể hiện trong Bảng 6 và Bảng 7. Trp ảnh hưởng đáng kể đến độ ẩm và hàm lượng protein thô trong S. paramamosain non (P < 0,05), với nhóm nhận được 4,05 g/kg Trp thể hiện hàm lượng protein thô của cua nguyên con cao hơn đáng kể so với các nghiệm thức khác (P < 0,05). Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy về hàm lượng chất béo thô giữa các nhóm (P > 0,05) (Bảng 6). Ngoài ra, việc bổ sung Trp có tác động đáng kể đến mức độ của nhiều loại axit amin khác nhau trong cua con (P < 0,05). Hàm lượng isoleucine (Ile), leucine (Leu), tyrosine (Tyr) và phenylalanine (Phe) tăng đáng kể khi mức Trp tăng (P < 0,05) (Bảng 7).

Bảng 6 Ảnh hưởng của mức độ tryptophan trong chế độ ăn đến thành phần toàn thân của Scylla paramamosain.

Lưu ý: Trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3. Dữ liệu có chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P < 0,05).

Bảng 7 Ảnh hưởng của mức tryptophan trong chế độ ăn đến thành phần axit amin (g/100 g cua khô) của cua Scylla paramamosain.

Lưu ý: Trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3; Lưu ý: Trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3; Trp: Tryptophan; Thr: Threonine; Val: Valine; Ile: Isoleucine; Leu: Leucine; Phe: Phenylalanine; Lys: Lysine; His: Histidine; Arg: Arginine; Met: Methionine; Asp: Axit aspartic; Ser: Serine; Glu: Axit glutamic; Pro: Proline; Gly: Glycine; Ala: Alanine; Cys: Cysteine; Tyr: Tyrosine. Dữ liệu có các chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P < 0,05).

3.3 Hoạt động của enzyme tiêu hóa

Mức Trp biểu hiện khác nhau trong thức ăn ảnh hưởng đáng kể đến hoạt động của enzyme tiêu hóa ở toàn bộ cua (P < 0,05) (Bảng 8). Hoạt động của trypsin được phát hiện ở mức tương đối cao trong nhóm 2,94–4,05 g/kg, với nhóm 4,39 g/kg thể hiện hoạt động thấp nhất. Cả hoạt động của amylase và lipase đều đạt đỉnh ở nhóm 3,38 g/kg và nhóm 3,68 g/kg (P < 0,05).

Bảng 8 Ảnh hưởng của hàm lượng tryptophan trong chế độ ăn đến hoạt động của enzyme tiêu hóa trong toàn bộ cua Scylla paramamosain.

Lưu ý: Trung bình ± SD, n=3. Dữ liệu có chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P < 0,05).

3.4 Khả năng miễn dịch và chống oxy hóa

Các thông số về khả năng miễn dịch và chống oxy hóa của S. paramamosain được thể hiện trong Bảng 9. Mức serotonin (5-HT) tăng cùng với Trp trong khẩu phần ăn tăng, cho thấy nhóm 4,05 g/kg tăng cao nhất (P < 0,05). Hoạt động cao đáng chú ý của acetyltransferase (HAT) và tryptophan hydroxylase (TPH) lần lượt được tìm thấy ở nhóm 3,68 g/kg và 4,39 g/kg (P < 0,05). Ngoài ra, mức melatonin tăng đáng kể ở nhóm 3,68 g/kg (P < 0,05). Nhóm 4,05–4,39 g/kg cũng nổi bật với hoạt động Superoxide Dismutase (SOD) cao hơn đáng kể, vượt trội hơn so với các nhóm khác (P < 0,05). Tuy nhiên, không thấy sự khác biệt đáng kể ở mức độ malondialdehyde (MDA) và catalase (CAT) giữa các nhóm (P > 0,05). Phosphatase axit và phosphatase kiềm của nhóm 3,38–3,68 g/kg biểu hiện hoạt động tương đối cao hơn so với các nhóm khác (P < 0,05).

Bảng 9 Ảnh hưởng của hàm lượng tryptophan trong chế độ ăn đến khả năng miễn dịch và chống oxy hóa của cua Scylla paramamosain.

Lưu ý: Trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 3. Dữ liệu có các chữ cái khác nhau có sự khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P < 0,05). 5-HT: Serotoni; MLT: Melatonin; TPH: Tryptophan hydroxylase; HAT: Histone acetyltransferase; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase; CAT: Catalase; ACP: Acid phosphatase; AKP: Alkaline phosphatase.

3.5 Biểu hiện gen

Trp trong khẩu phần ăn ảnh hưởng đáng kể đến mức độ biểu hiện của gen liên quan đến tổng hợp protein Tor, với nhóm 4,05 g/kg biểu hiện mức biểu hiện cao hơn đáng kể so với nhóm 2,94 g/kg (P < 0,05) (Hình 2). Tuy nhiên, gen S6k1 không khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P > 0,05). Ngoài ra, mức độ biểu hiện của 5- HTR1 tăng đáng kể ở nhóm 3,68 g/kg và 4,05 g/kg so với các nhóm khác (P < 0,05) (Hình 2). Đồng thời, Trp cũng ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của các gen liên quan đến miễn dịch ở cua con, với mức biểu hiện cao nhất được quan sát thấy đối với Lysozyme và Relish ở nhóm 4,05 g/kg (P < 0,05) (Hình 2).

Hình 2. Tác dụng của tryptophan lên biểu hiện gen ở toàn bộ cua Scylla paramamosain.

Lưu ý: Tor: Target of rapamycin; S6k1: Ribosomal protein S6 kinase beta-1; 5-HTR1: 5-hydroxytryptamine receptor 1; Relish: NF-kappa-B-like factor Relish.

3.6 Đánh giá hành vi hung hăng

Các mức độ khác nhau của hành vi hung hăng do S. paramamosain non thể hiện đã được phân loại và mô tả trong Hình bổ sung 1, và phân tích thống kê về các tần suất hành vi khác nhau ở cả giai đoạn trung hạn và giai đoạn cuối kỳ dưới các mức Trp khác nhau đã được trình bày trong Hình 3. Không có sự khác biệt đáng kể về thời gian tiếp cận, tiếp xúc và chiến đấu của cua con giữa các nghiệm thức trong giai đoạn trung hạn (P > 0,05) (Hình 3A). Tuy nhiên, về sau, cua con trong nhóm 2,94 g/kg Trp biểu hiện thời gian tiếp cận, tiếp xúc và chiến đấu cao hơn đáng kể so với các nhóm khác (P < 0,05) (Hình 3B). Ngoài ra, nhóm 2,94 g/kg Trp biểu hiện điểm hành vi cao hơn đáng kể và tỷ lệ hành vi hung hăng lớn hơn so với các nhóm khác (P < 0,05) (Hình 3C).’

Hình 3. Tác động của tryptophan lên các mức độ hành vi và điểm số khác nhau của Scylla paramamosain non.

Lưu ý: Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn, n = 10. Trong mỗi nhóm, giá trị trung bình (hình tròn mở) của dữ liệu quan sát được (điểm đóng) được hiển thị. A: Thời gian của các mức độ hành vi khác nhau ở giai đoạn giữa của thí nghiệm; B: Thời gian của các mức độ hành vi khác nhau ở giai đoạn cuối của thí nghiệm; C: Tỷ lệ phần trăm tương đối của các mức độ hành vi và điểm số ở giai đoạn giữa và cuối của các giai đoạn thí nghiệm. Dữ liệu có các chữ cái khác nhau khác biệt đáng kể giữa các nghiệm thức (P < 0,05)

3.7 Phân tích thành phần chính (PCA)

Để kiểm tra mối liên hệ giữa mức Trp trong khẩu phần ăn và các thông số tăng trưởng, hành vi, sinh lý và sinh hóa của S. paramamosain, một PCA đã được tiến hành (Hình 4). Hai thành phần đầu tiên tích lũy giải thích được 77,48% sự thay đổi trong các thông số đã xác định (Bảng bổ sung 1). Các vectơ riêng của các thông số cho mỗi PCA cho thấy 5-HTR1, Tor, Serotonin, Protein, WGR, SGR, S6k1 và MF đóng góp tích cực vào PC1, trong khi amylase, FCR và điểm số hành vi liên quan tiêu cực đến PC1 (Hình 4A, Bảng bổ sung 1). Lysozyme, ACP và AKP đóng góp tích cực vào PC2 (Hình 5A, Bảng bổ sung 1). Các thông số còn lại của lipase và trypsin đóng góp tích cực vào PC3 và PC4 (Hình 4B, Bảng bổ sung 1). Điểm của các PC này phần lớn khác nhau giữa các nhóm Trp khác nhau.

Hình 4. Kết quả PCA cho thấy biểu đồ kép về điểm PC của năm mức Trp trong chế độ ăn (2,94, 3,38, 3,68, 4,05 và 4,39 g/ kg) và tải trọng của các thông số tăng trưởng, hành vi, sinh lý và sinh hóa của Scylla paramamosain.

4. Thảo luận

Tỷ lệ sống cao là chỉ số chính đánh giá sự thành công của nuôi giáp xác. Nhìn chung, tỷ lệ sống trên 80% chấp nhận được trong các thử nghiệm nuôi giáp xác (Apine và cộng sự, 2023). Trong nghiên cứu này, tỷ lệ sống của cua bùn con được bổ sung 3,38–3,68 g/kg Trp là 75,76–87,88%, phần lớn phù hợp với tỷ lệ sống của S. paramamosain trong các thí nghiệm nghiên cứu dinh dưỡng trước đây (76,19%-92,86%, Zheng và cộng sự, 2020; 69,41%-76,47%, Zhou và cộng sự, 2020; 86,11%-98,61%, Xu và cộng sự, 2023). Các phát hiện cho thấy thiết lập thử nghiệm phù hợp với việc nuôi cấy S. paramamosain. Lượng Trp nạp vào thích hợp là rất quan trọng đối với sự tăng trưởng và phát triển tối ưu ở động vật thủy sinh. Sự tăng trưởng của giáp xác đạt được thông qua quá trình lột xác thường xuyên và liên tục (Nguyen và cộng sự, 2014). Trong nghiên cứu này, khi mức Trp trong thức ăn tăng lên 3,68 g/kg (8,16 g/kg protein thô), các giá trị MF, WGR và SGR của cua con tăng đáng kể. Tuy nhiên, khi mức Trp trong thức ăn tăng thêm, MF giảm đáng kể. Những kết quả này chỉ ra rằng việc bổ sung Trp thích hợp có thể thúc đẩy sự phát triển của S. paramamosain. Dựa trên phân tích hồi quy đa thức bậc hai của các giá trị SGR và WGR, mức Trp trong khẩu phần ăn tối ưu cho cua giống là 3,94–3,98 g/kg (8,87–9,96 g/kg protein trong khẩu phần ăn). Nhu cầu Trp tối ưu tương đương cũng đã được ghi nhận đối với các loài giáp xác khác, chẳng hạn như ở tôm thẻ chân trắng L. vannamei (3,7–4,0 g/kg trong thức ăn khô, Sun và cộng sự, 2015; Jin và cộng sự, 2017) và tôm kuruma Marsupenaeus japonicus (4,0 g/kg trong thức ăn khô, Teshima và cộng sự, 2002).

Sự cải thiện trong quá trình tăng trưởng của cua con có thể một phần là do sự tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa và hiệu quả chuyển đổi thức ăn được thúc đẩy bởi Trp (Esmaeili và cộng sự, 2024). Serotonin (5-HT), một chất chuyển hóa của Trp, đã được chứng minh là kích thích giải phóng các peptide giống cholecystokinin/cholecystokinin, do đó tạo điều kiện cho quá trình tiết enzyme tuyến tụy (Katz và Harris-Warrick, 1990; Li và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, lượng Trp quá mức có thể dẫn đến tình trạng tăng cao liên tục nồng độ 5-HT, có thể làm giảm nhu động ruột, làm chậm quá trình vận chuyển thức ăn qua hệ tiêu hóa, kéo dài thời gian tác dụng của enzyme lên chất nền và do đó làm giảm nhu cầu của cơ thể đối với enzyme tiêu hóa (Keating và Spencer, 2019). Trong nghiên cứu này, một số hoạt động chính của enzyme tiêu hóa, bao gồm protease, lipase và amylase, trong nhóm có 4,39 g/kg Trp thấp hơn đáng kể so với các giá trị tương ứng trong nhóm 3,66 g/kg. Do đó, nồng độ Trp cao có thể dẫn đến giảm hoạt động của enzyme tiêu hóa, tăng FCR và do đó ức chế sự phát triển.

Nguồn cung cấp axit amin cân bằng đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì trạng thái cân bằng axit amin, hạn chế quá trình dị hóa axit amin và do đó tăng cường tổng hợp protein ròng và lắng đọng nitơ trong cơ thể (Schuhmacher và cộng sự, 1997). Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein thô toàn thân tăng đáng kể khi mức Trp trong khẩu phần ăn tăng lên, đạt đỉnh ở mức Trp 3,68 g/kg. Trong khi đó, mức biểu hiện gen của TOR và S6k1 trong S. paramamosain tăng lên khi hàm lượng Trp trong khẩu phần ăn nằm trong khoảng 3,38–3,68 g/kg, cho thấy Trp có thể tăng cường tổng hợp protein bằng cách tăng biểu hiện của các gen chính trong con đường truyền tín hiệu TOR. Tuy nhiên, mức protein thô toàn thân giảm khi bổ sung Trp trong khẩu phần ăn vượt quá 3,68 g/kg. Tiêu thụ quá nhiều tryptophan có thể phá vỡ sự cân bằng axit amin, tăng cường quá trình khử amin và tăng bài tiết chất thải nitơ, chẳng hạn như amoniac và trimethylamine. Điều này có thể làm giảm hiệu quả giữ nitơ và tổng hợp protein, như đã quan sát thấy ở một số loài cá (Ahmed và Khan, 2004; Peres và Oliva-Teles, 2007). Ngoài ra, nồng độ axit amin trung tính lớn (tức là Phe, Tyr, Trp, Leu và Ile) trong cua con tăng lên cùng với việc bổ sung Trp trong khẩu phần ăn. Nhìn chung, nồng độ Trp cao hơn có thể ảnh hưởng đến sự hấp thụ cạnh tranh của các axit amin trung tính lớn vì chúng chia sẻ cùng các kênh vận chuyển, chẳng hạn như chất vận chuyển LAT1 (Diksic và Young, 2001). Nồng độ axit amin trung tính lớn cao được quan sát thấy trong nghiên cứu này có thể là do hai lý do tiềm ẩn: Thứ nhất, Phe, Tyr và Trp là các axit amin thơm. Trp ngoại sinh được chuyển thành axit indole-3-acetic thông qua hoạt động xúc tác của transaminase axit amin thơm, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp axit amin thơm (Paeslack và cộng sự, 2018). Thứ hai, mức Trp tăng có thể kích hoạt các cơ chế điều hòa trong cơ thể, chẳng hạn như tăng cường biểu hiện chất vận chuyển LAT1 hoặc kích hoạt các phản ứng thích nghi khác (Diksic và Young, 2001), có thể gián tiếp làm tăng mức axit amin khác. Cần có thêm các nghiên cứu để xác minh những lời giải thích tiềm năng này.

Giáp xác không có phản ứng miễn dịch thích ứng và chủ yếu dựa vào cơ chế miễn dịch bẩm sinh của chúng để nhận biết và ngăn chặn mầm bệnh (Iwanaga và Lee, 2005; Tran và cộng sự, 2020). Nghiên cứu này phát hiện ra rằng lượng Trp hấp thụ vào cơ thể phù hợp (3,68–4,05 g/kg ) có thể nâng cao biểu hiện gen của Relish và Lysozyme, cho thấy khả năng tăng cường miễn dịch Trp tối ưu của S. paramamosain non. Hơn nữa, chất chuyển hóa Trp là melatonin được ban tặng các đặc tính giúp tăng cường khả năng miễn dịch (Liu và cộng sự, 2019) và khả năng chống oxy hóa của sinh vật (Yang và cộng sự, 2020). Quá trình chuyển đổi Trp thành melatonin bên trong sinh vật được điều chỉnh bởi một loạt các cơ chế điều hòa nghiêm ngặt, liên quan đến một loạt các enzyme (như N-acetyltransferase) và các hợp chất trung gian (như 5-hydroxytryptophan, 5-HTP) (Roberts và Fitzpatrick, 2013). Nghiên cứu này cho thấy nhóm được bổ sung mức Trp tối ưu (3,68 g/ kg) biểu hiện mức melatonin cao hơn đáng kể, kết hợp với sự gia tăng hoạt động của N-acetyltransferase. Những phát hiện tương tự đã được ghi nhận ở cá ngựa vằn (Da Mota Teixeira, 2019) và cá O. mykiss non (Lepage, 2004).

Phosphatase và enzyme chống oxy hóa là thành phần không thể thiếu của hệ thống miễn dịch bẩm sinh của giáp xác và thường được sử dụng để đánh giá sức khỏe sinh lý của chúng (Fang và cộng sự, 2002; Baganz và Blakely, 2013). ACP và AKP là các enzyme đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa phốt pho bên trong các sinh vật sống và có liên quan chặt chẽ với quá trình chuyển hóa DNA, protein và lipid, cũng như nhiều quá trình sinh học khác nhau (Whyte, 1994; Goff, 2018; Zhu và cộng sự, 2024). Kết quả nghiên cứu này cho thấy cả hoạt động ACP và AKP ban đầu đều tăng và sau đó giảm khi nồng độ Trp tăng. Xu hướng này phù hợp với các nghiên cứu trên L. vannamei (Sun và cộng sự, 2016), cũng như các loài cá khác như cá lóc Channa argus (Han, 2022) và cá chép thường C. carpio var. (Tang và cộng sự, 2013). Hoạt động tăng cao của các enzyme này do cung cấp Trp thường chỉ ra rằng sinh vật đang tham gia vào quá trình trao đổi chất tích cực để hỗ trợ tăng trưởng và phản ứng miễn dịch. Hơn nữa, các enzyme chống oxy hóa, chẳng hạn như SOD, đóng vai trò chính trong việc trung hòa ROS phản ứng quá mức và bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hóa (Qiu và cộng sự, 2015). Hoạt động SOD cao nhất được quan sát thấy trong thức ăn cho cua con khi bổ sung 4,05 g/kg Trp. Cùng nhau, những kết quả này chỉ ra rằng việc tiêu thụ Trp hợp lý có thể tăng cường khả năng miễn dịch và chống oxy hóa ở S. paramamosain con, do đó thúc đẩy sức khỏe tổng thể của chúng.

Cua bùn S. paramamosain có bản năng lãnh thổ mạnh mẽ và hung hăng. Điều quan trọng là phải khám phá các phương pháp quản lý hiệu quả để giảm thiểu tác động của hành vi hung hăng đối với ngành nuôi cua. Nghiên cứu chứng minh rằng hành vi hung hăng giảm đáng kể khi nồng độ tryptophan là 3,68 g/kg , trùng với mức 5-HT tăng lên ở cua con. Phát hiện này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về nhiều loài thủy sinh khác nhau, bao gồm cua xanh Carcinus maenas (Sneddon và cộng sự, 2000), cá tuyết Đại Tây Dương non Gadus morhua (Hoglund và cộng sự, 2005), cá hồi cầu vồng O. mykiss (Winberg và cộng sự, 2001) và tôm càng xanh nước ngọt Astacus leptodactylus Eschscholtz (Harlıoglu và cộng sự, 2014). Tác động của Trp đối với hành vi hung hăng có liên quan đến chất chuyển hóa 5-HT của nó. 5-HT là một chất điều biến thần kinh quan trọng ảnh hưởng đến hành vi thông qua các cơ chế phân tử phức tạp trong hệ thần kinh trung ương (Shpakov và cộng sự, 2010). Nền tảng phân tử của các tác động hành vi của 5-HT bao gồm hoạt hóa thụ thể liên kết với một loạt các thụ thể liên kết với protein G (tức là 5-HTR1), khởi tạo các chuỗi truyền tín hiệu nội bào điều chỉnh hoạt động của tế bào thần kinh (Siegel và cộng sự, 2007). Nó tác động đến tính dẻo của khớp thần kinh và các con đường truyền tín hiệu tế bào như các con đường MAPK/ERK và PI3K/Akt, là một phần không thể thiếu của các quá trình như sự sống còn, tăng trưởng và biệt hóa của tế bào, do đó gián tiếp định hình hành vi (Chilmonczyk và cộng sự, 2017). Ngoài ra, 5-HT được biết là có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương để tăng cường cảm giác no, có khả năng làm giảm độ nhạy cảm với các kích thích bên ngoài và động lực gây hấn (Kravitz, 2000). Nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào cách tryptophan ảnh hưởng đến hành vi của S. paramamosain non thông qua con đường chuyển hóa 5-HT.

5. Kết luận

Dựa trên phân tích hồi quy đa thức của các giá trị WGR và SGR, nhu cầu tryptophan trong khẩu phần ăn tối ưu cho S. paramamosain là 3,94–3,98 g/kg khẩu phần ăn, tương đương với hàm lượng protein thô là 8,87–9,96 g/kg . Lượng Trp hấp thụ thích hợp có thể tạo điều kiện thuận lợi đáng kể cho sự phát triển của S. paramamosain, tăng cường hoạt động của enzyme tiêu hóa, tăng cường phản ứng miễn dịch và làm giảm các hành vi hung hăng. Ngược lại, lượng Trp hấp thụ quá mức có khả năng dẫn đến suy yếu khả năng miễn dịch. Những hiểu biết này rất quan trọng để nâng cao hiệu quả nuôi trồng thủy sản giáp xác và thiết lập môi trường nuôi trồng thủy sản thuận lợi. Hơn nữa, những kết quả này cung cấp định hướng quan trọng để đạt được lượng axit amin thiết yếu cân bằng và cải thiện công thức thức ăn thương mại.

Theo Wenping Feng, Zeping Zhao, Hanying Xu, Xueting Liu, Tao Han, Jiteng Wang

Nguồn: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235251342400471X?ref=pdf_download&fr=RR-2&rr=8db7e50249623db1

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hoá Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức