Phần 1: Virus Gây Hội Chứng Đốm Trắng Kích Hoạt Con Đường Glycolytic Trong Các Tế Bào Miễn Dịch Của Tôm (Tế Bào Máu) Để Có Lợi Cho Sự Nhân Lên Của Nó

Tóm tắt

Vi rút hội chứng đốm trắng (WSSV) là tác nhân gây bệnh trên tôm gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành nuôi tôm. WSSV kích hoạt quá trình glycolysis hiếu khí trong các tế bào miễn dịch của tôm (tế bào máu), nhưng cách thức vi rút này điều chỉnh các enzyme hoặc con đường glycolysis vẫn chưa được biết rõ. Do đó, mức độ mRNA và hoạt tính của 4 loại enzyme glycolysis quan trọng là Hexokinase (HK), Phosphofructokinase (PFK), Pyruvate kinase (PK) và Lactate dehydrogenase (LDH) được đo trong các tế bào máu của tôm bị nhiễm WSSV. Biểu hiện gen của HK và PFK, nhưng không phải LDH hoặc PK, đã tăng lên ở giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút (12 giờ); hơn nữa, hoạt tính của các enzyme này, ngoại trừ HK, đồng thời tăng lên. Tuy nhiên, không có sự gia tăng hoạt tính của enzyme ở giai đoạn cuối của vi rút (24 giờ). Vô hiệu hóa DSRNA in vivo và phá vỡ quá trình glycolysis bởi 2-DG đã khẳng định thêm vai trò của quá trình glycolysis trong quá trình nhân lên của virus. Dựa trên các nghiên cứu truy tìm bằng cách sử dụng glucose được đánh dấu bằng đồng vị ổn định, quá trình glycolysis được kích hoạt ở giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút, nhưng không phải ở giai đoạn cuối của vi-rút. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng WSSV đã tăng cường quá trình glycolysis bằng cách kích hoạt enzyme glycolysis ở giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút, cung cấp năng lượng và các phân tử sinh học để vi rút nhân lên.

1. Giới thiệu

Quá trình trao đổi chất bị virus tấn công đã được nghiên cứu trong nhiều năm để hiểu quá trình virus làm biến đổi quá trình trao đổi chất của vật chủ để thúc đẩy sự nhân lên của nó. Sự xen kẽ trao đổi chất do nhiễm vi-rút thường giống với quá trình tái lập trình trao đổi chất trong tế bào ung thư. Bằng cách tạo ra các con đường trao đổi chất của vật chủ, lượng phân tử sinh học tăng cao, bao gồm nucleotide, axit amin và lipid, sau đó có thể được sử dụng để tạo ra virion truyền nhiễm. Ngoài việc sản xuất phân tử sinh học, quá trình tái lập trình trao đổi chất do vi rút gây ra cũng có thể cung cấp ATP ở chế độ nhanh để hỗ trợ các quá trình sử dụng nhiều năng lượng như sao chép và đóng gói bộ gen của virus, hoặc NADPH để sinh tổng hợp khử (tổng hợp lipid) và duy trì cân bằng nội môi oxy hóa khử.

Quá trình glycolysis hiếu khí là một nguồn carbon thường được kích hoạt trong quá trình lây nhiễm vi rút để cung cấp ATP, NADPH và các phân tử carbon cho sự nhân lên của vi rút. Glycolysis là một con đường bắt buộc để đảm bảo sự nhân lên thành công của vi rút ở vi rút lây nhiễm cho động vật có xương sống. Vi rút nhắm đến các enzyme glycolysis giới hạn tốc độ, cụ thể là Hexokinase (HK), Phosphofructokinase (PFK) và Pyruvate kinase (PK), để kiểm soát tốc độ trao đổi chất của quá trình glycolysis. Một loại protein virut có tên là E4ORF1 từ adenovirus gây ra biểu hiện HK2 và PFKM thông qua kích hoạt Myc để hỗ trợ quá trình glycolysis và nhân lên của virut. Oncoprotein LMP1 của vi rút Epstein-Barr (EBV) thúc đẩy hoạt động phiên mã của HK2 via c-Myc điều hòa quá trình glycolysis. Vi rút không chỉ thúc đẩy sự biểu hiện của các enzyme glycolytic để tăng quá trình glycolysis mà còn có thể làm tăng hoạt tính của enzyme thông qua tương tác giữa protein của vi rút và enzyme glycolysis. Ví dụ, bằng cách tương tác với enzyme glycolytic, protein NS5A của vi rút viêm gan C (HCV) và protein NS1 của vi rút sốt xuất huyết (DENV) sẽ tăng cường hoạt tính của HK và GAPDH.

Việc lập trình lại quá trình trao đổi chất do vi rút gây ra không chỉ giới hạn ở các tế bào bị nhiễm vi rút ở động vật có xương sống, vì một loại vi rút không xương sống có tên là vi rút hội chứng đốm trắng (WSSV) cũng lập trình lại quá trình trao đổi chất của vật chủ (tôm) để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nhân lên của nó. Chu kỳ nhân lên WSSV in vivo là ~ 24 giờ, với giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút là 12 giờ và giai đoạn cuối là 24 giờ. Ở giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút (12 giờ), WSSV kích hoạt một số con đường trao đổi chất, ví dụ: glycolysis hiếu khí, con đường pentose phosphate, sinh tổng hợp nucleotide, glutaminolysis, lipolysis và sinh tổng hợp axit amin, trong các tế bào miễn dịch của tôm (tế bào máu) và các mô đích khác.

Để hoàn thành quá trình nhân lên của vi rút, WSSV gây ra quá trình glycolysis hiếu khí trong tế bào máu của tôm ở giai đoạn sao chép bộ gen của vi rút (12 giờ). Sự dịch chuyển glycolysis được hỗ trợ bởi sự điều hòa của các enzym glycolysis. Godoy-Lugo và cộng sự (2019) đã báo cáo rằng yếu tố phiên mã HIF-1 điều chỉnh HK, PFK và PK theo cách thức cụ thể của mô ở tôm thẻ chân trắng bị nhiễm WSSV. Ở tôm thẻ chân trắng (Exopalaemon carinicauda), WSSV làm tăng biểu hiện của HK và PFK. Khi nhiễm WSSV, hoạt động thấp của pyruvate dehydrogenase (PDH) chuyển glucose thành sản xuất lactate thay vì đi vào chu trình TCA. Lactate dehydrogenase xúc tác quá trình chuyển đổi pyruvate thành lactate, được kích hoạt trong quá trình nhiễm WSSV. Vì hầu hết pyruvate được chuyển thành lactate, nên quá trình ngưng kết hợp glutamate sẽ duy trì chu trình TCA, tạo điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất năng lượng và phân tử sinh học liên tục. Ngoài ra, Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) được kích hoạt trong quá trình nhiễm WSSV, chuyển hướng glucose-6-phosphate, một chất trung gian glycolysis, vào con đường pentose phosphate. Điều này không chỉ thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp nucleotide để vi rút nhân lên mà còn tạo ra đủ NADPH, một chất khử để vô hiệu hóa ROS được tạo ra trong quá trình lây nhiễm vi rút.

Quá trình glycolysis là một con đường quan trọng để sao chép vi rút đã được nghiên cứu ở tôm bị nhiễm WSSV; tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu chỉ mô tả một loại enzyme glycolysis riêng lẻ. Việc theo dõi glucose được dán nhãn đồng vị ở tôm bị nhiễm WSSV có thể cung cấp sự hiểu biết toàn diện về quá trình glycolysis trong quá trình nhiễm WSSV. Trong nghiên cứu này, glucose được đánh dấu bằng đồng vị ổn định ([U- ¹³C] Glucose) đã được sử dụng làm chất đánh dấu để theo dõi các chất chuyển hóa glycolysis khác nhau trong quá trình nhiễm WSSV. 4 enzyme glycolysis quan trọng (HK, PFK, PK và LDH) đã được nghiên cứu để đánh giá vai trò của chúng trong việc lây nhiễm WSSV.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Động vật thí nghiệm và chủng cấy WSSV

Tôm thẻ chân trắng chưa trưởng thành (Litopenaeus vannamei, 2~3 g) được sử dụng trong nghiên cứu này được lấy từ Trung tâm Quốc tế về Phát triển Khoa học Nuôi trồng Thủy sản Tôm, Đại học Quốc gia Cheng Kung (NCKU) và Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Đại học Khoa học và Công nghệ Quốc gia Pingtung (NPUST). Tôm được giữ trong nước biển tiệt trùng 30 ppt ở 27°C trong 1 ngày trước khi nhiễm virus. Nguồn giống WSSV (phân lập Đài Loan, gia nhập GenBank số AF440570) đã được chuẩn bị bằng cách thu thập bạch huyết của tôm SPF sắp chết bị nhiễm WSSV. Nguồn WSSV được pha loãng 10^-4 với 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ và 2 mM KH₂PO₄) và dùng để tiêm vào cơ tôm. Liều lượng cảm nhiễm WSSV (100 μl/3 g tôm) gây ra tỷ lệ chết ~50% trong 3 ngày và 100% trong 5 ngày, trong khi tôm được xử lý bằng PBS (100 μl/3 g tôm) được dùng làm đối chứng. Vào lúc 12 và 24 giờ sau cảm nhiễm WSSV, các tế bào máu được thu thập để đánh giá hoạt tính của enzyme và định lượng biểu hiện của gen glycolytic và WSSV. Chân bơi được thu thập để đo số lượng bản sao bộ gen của WSSV.

2.2. Định lượng gen Glycolytic và gen cấu trúc WSSV VP28 bằng PCR thời gian thực

Chiết xuất RNA từ tế bào máu thu được 12 và 24 giờ được thực hiện với REzol (Protech Enterprise) và cDNA được tổng hợp với SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen) và mồi Anchor-dTv (Bảng 1). cDNA thu được được sử dụng để đo biểu hiện của gen mục tiêu, sử dụng hệ thống phát hiện Bio-Rad và KAPA SYBR^® FAST qPCR Master Mix (KAPA). Bộ mồi của từng gen mục tiêu được liệt kê (Bảng 1). Dữ liệu được chuẩn hóa với các giá trị của EF-1α (đối chứng nội bộ) và được tính toán bằng phương pháp 2^-ΔCT. Quy tắc thực nghiệm được thực hiện trên tất cả các dữ liệu để phát hiện và loại trừ các ngoại lệ thống kê. Sự khác biệt giữa các nhóm được xác định bằng bài kiểm tra Student’s t-test.

Bảng 1. Bộ mồi được sử dụng trong nghiên cứu

^aBộ mồi cho gen glycolytic được thiết kế bằng cơ sở dữ liệu phiên mã nội bộ, với số gia nhập được viết bên cạnh gen tương ứng.

^bTrình tự quảng bá T7 được thêm vào được gạch

2.3. Số bản sao bộ gen WSSV

Quá trình trích xuất DNA bộ gen từ động vật chân đốt thu được 24 giờ được thực hiện bằng bộ chiết xuất DNA DTAB/CTAB (GeneReach Biotechnology Corp.) và số lượng bản sao bộ gen WSSV được xác định bằng hệ thống định lượng IQ Real™ WSSV (GeneReach Biotechnology Corp.). Sự khác biệt giữa các nhóm được phát hiện bằng bài kiểm tra Student’s t-test.

2.4. Hoạt tính của Hexokinase (HK) trong tế bào máu của tôm bị nhiễm WSSV

Các tế bào máu được thu thập ở 12 và 24 giờ (6 tôm/ bể và 4 bể/ nhóm) được sử dụng để đánh giá hoạt tính của hexokinase, với bộ xét nghiệm so màu hexokinase (Biovision). Tế bào máu được đồng nhất với bộ đệm xét nghiệm 100 µl HK. Chất đồng nhất này được ủ trên băng trong 10 phút và được ly tâm ở tốc độ ~13.000 x g trong 5 phút. Nồng độ protein trong phần nổi phía trên được xác định bằng xét nghiệm Bradford (Cô đặc thuốc thử thuốc nhuộm xét nghiệm protein Bio-Rad). 5 μg protein hemocyte đã được thêm vào một đĩa 96 giếng, với việc bổ sung 50 μl bộ đệm xét nghiệm HK. Đường chuẩn NADH được chuẩn bị cùng với nhóm mẫu. Hỗn hợp phản ứng sau đó được thêm vào để bắt đầu phản ứng (34 µl dung dịch đệm thử nghiệm HK, 2 µl hỗn hợp enzyme HK, 2 µl HK developer, 2 µl HK coenzyme và 10 µl HK cơ chất). Các biện pháp đối chứng tổng quan đã được chuẩn bị theo các mẫu ngoại trừ chất nền HK không được thêm vào. Độ hấp thụ được xác định ở bước sóng 450nm và nhiệt độ phòng cứ sau 2 phút trong 50 phút, với sản lượng NADH được tính bằng đường cong chuẩn. Hoạt tính HK của mẫu được tính theo phương trình sau: (B2-B1)/(ΔT x P), trong đó B2 là NADH được tạo ra từ mẫu (nmol) tại thời điểm đọc lần thứ 2; B1 là lượng NADH được tạo ra từ mẫu (nmol) tại thời điểm đọc đầu tiên; ΔT là thời gian phản ứng giữa lần đọc đầu tiên và lần đọc thứ 2 (phút); và P là lượng protein được thêm vào. Sự khác biệt giữa các nhóm được phát hiện bằng bài kiểm tra Student’s t-test. B1 là lượng NADH được tạo ra từ mẫu (nmol) tại thời điểm đọc đầu tiên; ΔT là thời gian phản ứng giữa lần đọc đầu tiên và lần đọc thứ 2 (phút); và P là lượng protein được thêm vào. Sự khác biệt giữa các nhóm được phát hiện bằng bài kiểm tra Student’s t-test. B1 là lượng NADH được tạo ra từ mẫu (nmol) tại thời điểm đọc đầu tiên; ΔT là thời gian phản ứng giữa lần đọc đầu tiên và lần đọc thứ 2 (phút); và P là lượng protein được thêm vào. Sự khác biệt giữa các nhóm được phát hiện bằng bài kiểm tra Student’s t-test.

2.5. Hoạt tính của phosphofructokinase (PFK) trong tế bào máu của tôm bị nhiễm WSSV

Một bộ xét nghiệm so màu hoạt tính phosphofructokinase (Biovision) đã được sử dụng để đo hoạt tính PFK. Các tế bào máu được thu thập ở 12 và 24 giờ (6 tôm/ bể và 4 bể/ nhóm) được đồng nhất với 100 µl dung dịch đệm xét nghiệm PFK. Chất đồng nhất được ly tâm ở tốc độ ~13.000 x g trong 5 phút và xét nghiệm Bradford được thực hiện để định lượng nồng độ protein. Sau đó, 1,25 µg protein hemocyte được thêm vào đĩa 96 giếng, và thêm vào 50 µl dung dịch đệm xét nghiệm PFK. Phản ứng được bắt đầu ở 37°C bằng cách thêm hỗn hợp phản ứng chứa 42 µl dung dịch đệm xét nghiệm PFK, 2 µl hỗn hợp enzym PFK, 2 µl chất phát triển PFK, 2 µl ATP và 2 µl chất nền PFK. Các biện pháp đối chứng tổng quan đã được chuẩn bị theo các mẫu ngoại trừ chất nền PFK không được thêm vào. Đường chuẩn NADH được chuẩn bị cùng với nhóm mẫu. Toàn bộ hỗn hợp được đọc ở bước sóng 450 nm mỗi phút trong 40 phút.

2.6. Hoạt tính của Pyruvate Kinase (PK) trong tế bào máu của tôm bị nhiễm WSSV

Trong các tế bào máu được thu thập ở 12 và 24 giờ (6 tôm/ bể và 4 bể/ nhóm), hoạt tính PK được xác định bằng bộ xét nghiệm đo màu/đo huỳnh quang hoạt tính pyruvate kinase (Biovision). Các tế bào máu được đồng nhất với 100 µl dung dịch đệm xét nghiệm PK và các mảnh vụn của tế bào được loại bỏ bằng cách ly tâm chất đồng nhất (10.000 x g trong 1 phút). Sau khi nồng độ protein được xác định, 2.5 μg protein hemocyte được thêm vào một đĩa 96 giếng, tiếp theo là 50 μl dung dịch đệm xét nghiệm PK. Một đường chuẩn pyruvate cũng đã được chuẩn bị. Phản ứng được bắt đầu ở nhiệt độ phòng bằng cách thêm 44 μl dung dịch đệm xét nghiệm PK, 2 μl hỗn hợp chất nền, 2 μl hỗn hợp enzyme và 2 μl Chất kiểm soát nền thăm dò OxiRed™ đã được chuẩn bị theo các mẫu ngoại trừ hỗn hợp chất nền không được thêm vào. Hoạt động được đo ở bước sóng 570nm mỗi phút trong 20 phút và hoạt động được tính như sau: (B2-B1)/(ΔT x P).

2.7. Hoạt tính của Lactate Dehydrogenase (LDH) trong tế bào máu của tôm bị nhiễm WSSV

Hoạt tính LDH trong tế bào máu được thu thập ở 12 và 24 giờ (6 tôm/ bể và 4 bể/ nhóm) được đánh giá bằng bộ xét nghiệm so màu hoạt tính lactate dehydrogenase (Biovision). Sau khi các tế bào máu được đồng nhất hóa trong 150 μl dung dịch đệm xét nghiệm LDH, chất đồng nhất này được ly tâm ở tốc độ 10.000 x g trong 15 phút ở 4°C và nồng độ protein trong dịch nổi phía trên được định lượng bằng xét nghiệm Bradford. Sau đó, 10 μg protein hemocyte được đưa đến thể tích cuối cùng là 50 μl với dung dịch đệm xét nghiệm LDH. Phản ứng được bắt đầu ở 37°C bằng cách thêm 48 μl dung dịch đệm xét nghiệm LDH và 2 μl dung dịch hỗn hợp cơ chất và hoạt tính được xác định ở bước sóng 450 nm cứ sau 2 phút trong 30 phút. Hoạt động được tính toán với phép tính sau: (B2-B1)/(ΔT x P). Bài kiểm tra Student’s t-test đã được sử dụng để phát hiện sự khác biệt.

2.8. Glycolytic Enzyme vô hiệu hóa gen In Vivo bằng sự can thiệp của dsRNA

Cơ sở dữ liệu phiên mã dạ dày L. vannamei nội bộ được thiết lập với trình tự thế hệ tiếp theo (dữ liệu không được hiển thị) đã được sử dụng để thiết kế các bộ mồi cho từng gen glycolysis. Trình tự của các bộ mồi được liệt kê trong Bảng 1. Một phần trình tự đối chứng HK, PFK, PK, LDH và luciferase được khuếch đại bằng cách sử dụng PCR và các bộ mồi tương ứng: HK-ds-F1/HK-ds-R1, PFK-ds-F1/PFK-ds-R1, LDH-ds-F1/LDH-ds-R1, PK-ds-F1/PK-ds-R1 và Luc-F/Luc-R. Trình tự khởi đầu T7 sau đó được tích hợp vào bộ khuếch đại bằng PCR, sử dụng các bộ mồi sau: HK: T7-HK-ds-F1/HK-ds-R1 và HK-ds-F1/T7-HK-ds-R1; PFK: T7-PFK-ds-F1/PFK-ds-R1 và PFK-ds-F1/T7-PFK-ds-R1; LDH: T7-LDH-ds-F1/LDH-ds-R1 và LDH-ds-F1/T7-LDH-ds-R1; PK: T7-PK-ds-F1/PK-ds-R1 và PK-ds-F1/T7-PK-ds-R1; Luc: T7-Luc-F/Luc-R và Luc-F/T7-Luc-R. Một bộ khuếch đại neo T7 đã được sử dụng để tạo ssRNA bằng cách sử dụng bộ hệ thống sản xuất RNA quy mô lớn T7 RiboMax™ express (Promega). Hai ssRNA bổ sung được ủ với nhau để tổng hợp DSRNA, được tinh chế bằng chiết xuất phenol/chloroform.

Tôm (~3 g trọng lượng cơ thể) được tiêm dsRNA tổng hợp (pha loãng với PBS được lọc 0,22 µm, 1 μg/g tôm) 3 ngày trước khi tiêm vi rút. Luciferase dsRNA hoặc PBS đóng vai trò đối chứng. Vào lúc 72 giờ sau khi tiêm dsRNA, một số tế bào máu đã được thu thập (3 con tôm/bể, 4 bể/nhóm) để xác nhận hiệu quả của việc vô hiệu hóa gen, trong khi những con tôm còn lại được tiêm chất cấy vi rút hoặc được sử dụng làm đối chứng.

2.9. Chất đánh dấu glucose được dán nhãn đồng vị ổn định và sắc ký lỏng Electrospray ion hóa khối phổ (LC-ESI-MS) để theo dõi các chất chuyển hóa

Tôm bị nhiễm WSSV được tiêm glucose [U-¹³C] để tạo điều kiện truy tìm đồng vị carbon ổn định thông qua quá trình glycolysis (Hình 1). Thủ tục đã được thực hiện như mô tả (15). Tóm lại, glucose [U-¹³C] đánh dấu đồng vị ổn định (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Hoa Kỳ) được tiêm vào xoang máu bụng (tôm 450 μg/g) ở 12 hoặc 24 giờ. Vào lúc 10 hoặc 30 phút sau khi tiêm chất đánh dấu, các mẫu tế bào máu (3 tôm/bể, 4 bể/nhóm) đã được thu thập và MeOH được sử dụng để chiết xuất các chất chuyển hóa, được đông khô và chịu các phân tích LC-ESI-MS.

Hình 1. Sơ đồ glucose [U-¹³C] đi vào chu trình TCA thông qua quá trình glycolysis. Các chất chuyển hóa ¹³C được phát hiện trong nghiên cứu này được hiển thị bằng phông chữ màu trắng trong hộp đen. Vòng tròn màu đỏ đại diện cho carbon-13 (¹³C) và vòng tròn màu trắng đại diện cho carbon-12 (¹²C). Biểu đồ này đã được điều chỉnh và sửa đổi từ McDonald và cộng sự (23) và Courtney và cộng sự (24). Đối với chất chuyển hóa, Glc, Glucose; G6P, Glucose-6-photphat; F6P, Fructose-6-photphat; FBP, Fructoza 1,6-biphotphat; G3P, Glyceraldehyd-3-photphat; DHAP, Dihydroxyacetone photphat; 13BP, 1,3-Bisphosphoglycerate; 3PG, 3-Phosphoglycerate; 2PG, 2-Phosphoglyxerat; PEP, Phosphoenolpyruvate; Pyr, Pyruvat; Lạc, Lactate; Ac-CoA, Acetyl-CoA; Xit, xitrat; Ict, Isocitrate; αKG, α-Ketoglutarate; Suc, Succinat; Fum, Fumarat; Mal, Malate; và Oac, Oxaloacetate. Đối với các enzyme, HK, Hexokinase; PFK, Phosphofructokinase; PK, Pyruvate kinase; và LDH, Lactate dehydrogenase.

Hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC) (Ultimate 3000 RSLC, Dionex) và khối phổ kế thời gian bay bốn cực (QTOF) với nguồn ion hóa phun điện (ESI) (hệ thống maXis HURQToF, Bruker Daltonics) đã được sử dụng cho LC-ESI -MS phân tích. Mẫu chất chuyển hóa được hòa tan trong ddH₂O, dung dịch đệm phản ứng (anilin 0,3 M [Sigma-Aldrich, USA] trong HCl 60 mM), và N-(3-dimenthylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC; Sigma-Aldrich, USA) và ủ trong 2 giờ ở 25°C, thêm 10% amoni hydroxit để dừng phản ứng. Các dẫn xuất được xử lý bằng sắc ký lỏng pha đảo (RPLC) với cột BEH C18 (2,1 x 100 mm, Waters). Quá trình rửa giải bắt đầu từ 99% pha động A (0,1% axit formic trong ddH₂O) và 1% pha động B (axit formic 0,1% trong ACN), giữ ở 1% B trong 0,5 phút, tăng lên 60% B trong 6 phút, tiếp tục tăng lên 90% B trong 0,5 phút, giữ ở 90% B trong 1,5 phút, sau đó giảm xuống 1% B trong 0,5 phút; sau đó, 1% B được sử dụng để cân bằng cột trong 4 phút. Thể tích tiêm là 10 µl và tốc độ dòng là 0,3 ml/phút. Sắc ký đồ LC-ESI-MS thu được dưới điện áp mao quản 4.500 hoặc 3.500 V ở chế độ ion âm, nhiệt độ khô 190°C, lưu lượng khí khô duy trì ở mức 8 l/phút, khí phun sương ở 1,4 bar, và phạm vi thu nhận từ 100-1.000 m/z.

Phần mềm điều khiển HyStar và microOTOF (Bruker Daltonics) đã được sử dụng để lấy dữ liệu, được đánh giá bằng phần mềm DataAnalysis và TargetAnalysis (Bruker Daltonics). Để theo dõi những thay đổi về số lượng của các chất chuyển hóa được dán nhãn ¹³C, các thay đổi về số lần trong nhóm WSSV được tính toán tương ứng với nhóm PBS tương ứng (nhóm WSSV/PBS). Tất cả số lượng tín hiệu đã được chuẩn hóa theo trọng lượng mẫu và sự khác biệt giữa các nhóm được phân tích bằng bài kiểm tra Student’s t-test.

2.10. Ảnh hưởng của 2-Deoxy-D-Glucose (2-DG) đối với sự sao chép của WSSV

Để nghiên cứu sự liên quan của quá trình glycolysis trong quá trình sao chép WSSV, 2-DG (Sigma), một chất tương tự cấu trúc của glucose, đã được sử dụng để phá vỡ quá trình glycolysis ở tôm bị nhiễm WSSV. Tôm được tiêm 100 μl dung dịch 2-DG (hòa tan trong PBS được lọc 0,22 µm, 0,5 mg/g tôm) 2 lần trước khi nhiễm WSSV (lúc 1 ngày và 2 giờ trước khi nhiễm vi-rút), với tôm được tiêm PBS như một điều khiển. Việc lấy mẫu được thực hiện ở 24 giờ và chịu sự biểu hiện của gen cấu trúc WSSV (VP28) và định lượng số lượng bản sao bộ gen của WSSV.

Theo Yen Siong Ng, Der-Yen Lee, Chun-Hung Liu, Cheng-Yi Tung, Shu-Ting He, Han-Ching Wang

Nguồn: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2022.901111/full

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức

Tóm tắt

1. Giới thiệu

2. Vật liệu và phương pháp

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Trả lời Hủy

Đăng nhập