Tóm tắt

Hội chứng phân trắng (WFS) gần đây đã được báo cáo là một vấn đề nghiêm trọng trong ngành nuôi tôm ở các quốc gia nuôi tôm chính. Tôm bị ảnh hưởng bởi WFS có ruột màu trắng/nâu vàng, giảm lượng thức ăn ăn vào, tăng trưởng còi cọc và thường có vỏ lỏng lẻo, trong khi ao nhiễm WFS có phân trắng nổi khối lượng lớn trên bề mặt ao. Sự tích tụ của các cấu trúc vi nhung mao biến đổi tổng hợp Aggregated transformed microvilli (ATM) trong lòng ống gan tụy (HP) có bề ngoài giống như Gregarine được báo cáo là gây ra WFS. Nhưng mối liên hệ giữa ATM và WFS vẫn chưa được biết đến nhiều. Ngoài ra, sự xuất hiện của WFS có liên quan đáng kể với tỷ lệ nhiễm vi bào tử trùng Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) trong hệ thống nuôi tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei thương phẩm. Nghiên cứu này cho thấy WFS ảnh hưởng đến sự xuất hiện của bào tử EHP cùng với cấu trúc ATM trên tôm. Phần mô học được nhuộm bằng thuốc thử Calcofluor trắng (CFW) và semithin cho thấy sự hiện diện của bào tử EHP trong và xung quanh ATM. Hơn nữa, các bào tử EHP đã được phát hiện trên tất cả các cá thể tôm bị nhiễm WFS và trên các sợi phân trắng bằng kính hiển vi ánh sáng và SWP-PCR. Tất cả các mẫu WFS được kiểm tra âm tính với WSSV (bệnh đốm trắng), IHHNV (bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô), IMNV (bệnh hoại tử cơ) và AHPND (bệnh hoại tử gan tuỵ cấp). Không tìm thấy chủng Vibrio phân lập nổi bật nào ở tôm nhiễm WFS. Trong các nghiên cứu xét nghiệm sinh học, bằng cách cho ăn các mô gan tụy HP nhiễm WFS, các sợi phân trắng đã được tái tạo thành công cùng với cấu trúc ATM và bào tử EHP. Tuy nhiên, bào tử EHP tinh khiết (10⁶/ ml) không tạo được WFS ở các động vật được cảm nhiễm. Trong thử nghiệm lâm sàng, khi tôm nhiễm WFS được nuôi trong môi trường phòng thí nghiệm tối ưu, vấn đề phân trắng được giải quyết và tôm thải ra phân bình thường trong khoảng 7-10 ngày mà không cần bất kỳ can thiệp nào. Hơn nữa, các nghiên cứu mô học cho thấy khả năng tái sinh tế bào biểu mô (tế bào E hoặc tế bào phôi) trên tôm đã được xử lý WFS. Tuy nhiên, sự phục hồi WFS không phải là sự phục hồi hoàn toàn vì những con tôm đã được xử lý vẫn tiếp tục phát tán các bào tử EHP trong phân bình thường. Người ta quan sát thấy EHP là mầm bệnh chính được bài tiết/phát tán qua phân trắng của tôm. Với nghiên cứu này, chúng tôi đặt giả định rằng WFS là một điều kiện lâm sàng hay tình trạng phân lỏng ở tôm có liên quan đến nhiễm trùng EHP nghiêm trọng. Điều này có thể do EHP kết hợp với một tác nhân không xác định gây ra.

1/ Giới thiệu

Nuôi tôm là một ngành sản xuất thực phẩm phát triển mạnh và là một hoạt động kinh tế quan trọng ở nhiều nước Đông Nam Á. Dịch bệnh là rào cản lớn trong quá trình sinh trưởng và phát triển của nghề nuôi tôm. Hoạt động nuôi tôm hiện nay, đặc biệt với việc thâm canh và thương mại hóa nhiều hơn, đã làm dịch bệnh trầm trọng thêm. Một số bệnh không rõ nguyên nhân thường xuyên thách thức ngành nuôi tôm và là nguyên nhân trực tiếp gây ra tỷ lệ chết hoặc giảm tốc độ tăng trưởng, do đó gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho người nuôi. Sự xuất hiện của các bệnh và hội chứng mới đã trở thành một hạn chế đáng kể đối với tính bền vững của ngành sản xuất thực phẩm này trên toàn cầu.

Hội chứng phân trắng (WFS), được báo cáo từ thập kỷ trước, gần đây đã được coi là một vấn đề nghiêm trọng mà nghề nuôi tôm trên toàn thế giới đang phải đối đầu, đặc biệt là nuôi tôm thẻ chân trắng. Bệnh này đã được báo cáo trên cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng nuôi (Somboon và cộng sự, 2012). WFS thường xảy ra hoặc trở nên rõ ràng sau 30–40 ngày nuôi, và nó có thể gây chết tôm. Các ao bị ảnh hưởng bởi WFS có phân trắng nổi, ruột trắng/vàng nâu, giảm tiêu thụ thức ăn, chậm phát triển (Sriurairatana và cộng sự, 2014), WFS đã được báo cáo là có liên quan đến sự hiện diện của cấu trúc vi nhung mao biến đổi tổng hợp (ATM) có hình dạng giống như ký sinh trùng Gregarine, bệnh Vibrio, vi bào tử trùng (EHP), tảo xanh lam và nấm (Chaweepack và cộng sự, 2015; Sriurairatana và cộng sự, 2014; Tangprasittipap và cộng sự, 2013). Tangprasittipap và cộng sự. (2013) báo cáo rằng EHP tìm thấy ở P. vannamei không liên quan nhân quả với WFS.

Gần đây, hội chứng WFS diễn ra nghiêm trọng ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng thương phẩm P. vannamei ở Ấn Độ và bị nghi ngờ có liên quan đến nhiễm trùng EHP. Nghiên cứu này nhằm mục đích điều tra các biểu hiện lâm sàng của WFS và mối liên quan có thể có của nó với EHP. Hơn nữa, chúng tôi thực hiện các nghiên cứu thử nghiệm để tái tạo WFS và kiểm tra khả năng phục hồi của tôm bị ảnh hưởng bởi WFS trong điều kiện phòng thí nghiệm.

2/ Vật liệu và phương pháp

2.1. Chi tiết trang trại và thu thập mẫu

Các mẫu tôm thẻ chân trắng được thu thập từ 25 trại nuôi tôm bị ảnh hưởng của WFS ở các huyện Thiruvallur, huyện Chengalpattu và huyện Cuddalore – bang Tamil Nadu, huyện Nellore và huyện Guntur – bang Andhra Pradesh của Ấn Độ. Trong mỗi trang trại bị ảnh hưởng bởi WFS sẽ có 30 con tôm được thu thập. Trong đó bao gồm những con tôm có dấu hiệu tổng quát khác biệt, bị ảnh hưởng WFS như có ruột màu trắng/nâu vàng và tôm không có ruột màu trắng/nâu vàng (ruột bình thường với thức ăn), đã được lựa chọn và sử dụng trong nghiên cứu này (Bảng 1). Các mẫu tôm như chuỗi phân bình thường và chuỗi phân trắng từ ao nuôi được thu thập và vận chuyển đến phòng thí nghiệm bằng cách ướp đá. Các mô gan tụy (HP) đã được mổ vô trùng của tôm được thu thập trong 90% cồn ethanol và vận chuyển đến phòng thí nghiệm ở nhiệt độ phòng. Đối với kính hiển vi điện tử, các mẫu tôm được cố định trong 2,5% đệm glutaraldehyde và được vận chuyển bằng cách ướp đá, trong khi đối với phương pháp mô bệnh học, các mẫu được cố định trong chất cố định AFA của Davidson.

Bảng 1. Thông tin chi tiết về số lượng tôm thu được từ từng trại tôm.

Trang trại	Vị trí trại (Huyện, Bang)	Số tôm thu thập	Tôm bị nhiễm WFS	Tôm bình thường
1	Thiruvallur, Tamil Nadu	10	5	5
2		7	4	3
3		8	4	4
4		7	4	3
5		6	4	2
6	Chengelpattu, Tamil Nadu	6	4	2
7		10	7	3
8		7	5	2
9		6	4	2
10		7	3	4
11	Cuddalore, Tamil Nadu	7	4	3
12		8	5	3
13		6	4	2
14		6	4	2
15		7	3	4
16	Guntur, Andhra Pradesh	8	5	3
17		7	3	4
18		6	4	2
19		7	4	3
20		7	4	3
21	Nellore, Andhra Pradesh	6	3	3
22		10	8	2
23		7	5	2
24		7	4	3
25		7	4	3
Tổng		180	107	73

2.2. Tinh sạch bào tử EHP

Việc tinh sạch bào tử EHP được thực hiện theo các quy trình được mô tả trước đó (Aldama-Cano và cộng sự, 2018; Rajendran và cộng sự, 2016) với vài điều chỉnh nhỏ. Các chuỗi phân trắng và các mô HP nhiễm EHP được thu thập và đồng nhất. Một thể tích dietylete tương đương được thêm vào chất đồng nhất, quay ly tâm trong 30s, và ly tâm ở 7000 xg trong 3 phút.

Sản phẩm thu được sau ly tâm được sử dụng để tách gradient mật độ sử dụng 50, 60, 70, 90 và 100% Percoll (GE health care, USA) bằng cách ly tâm ở 40.000 x g (Optima XPN-100 ultracentrifuge, Beckman Coulter, USA) trong 1h ở 15 ◦C.

Các dải chứa bào tử được thu thập bằng cách sử dụng một ống tiêm 2 ml với kim có kích thước 25 (0,5 mm). Các bào tử được rửa ba lần bằng nước cất ở 7000 x g trong 3 phút ở 15 ◦C và được bảo quản ở 4 ◦C. Buồng đếm Hemocytometer đã được sử dụng để thống kê số lượng các bào tử.

2.3. Kính hiển vi ánh sáng

2.3.1. Soi tươi & mô bệnh học

Các mẫu tôm được tách vô trùng bằng các thiết bị vô trùng. Một tập hợp các mẫu HP và sợi phân trắng được phết trên lam kính sạch, sau đó được xem dưới kính soi hiển vi. Các mô tôm được cố định trong chất cố định AFA của Davidson trong 24–48h đã được xử lý mô bệnh học bằng cách tuân theo các quy trình tiêu chuẩn như đã mô tả (Bell và Lightner, 1988). Các phần mô (4–5 μm) được nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin (Hi Media, Ấn Độ) và chất calcofluor trắng (CFW) (Sigma Aldrich, Hoa Kỳ) (CFW và 10% KOH trong chế phẩm 1: 1) (Zhao và cộng sự, 2020). Các phiến kính nhuộm màu được gắn với giá đỡ DPX và được quan sát dưới kính hiển vi.

2.4. Kính hiển vi điện tử quét & truyền qua

Đối với kính hiển vi điện tử quét (SEM), các mẫu tôm được cố định trong 2,5% glutaraldehyde trong dung dịch đệm natri phosphat 0,1 M ở 4 ◦C trong 8 giờ và khử nước bằng loạt etanol (50%, 70%, 90%, 100%) trong 15 mỗi phút tối thiểu bằng cách làm khô bằng hóa chất với 100% etanol và 100% hexametylenđiamin (HMDS) trong chế phẩm 3:1, 1:1 và 1:3 trong 15 phút mỗi lần sau đó làm khô mẫu trong 100% hexametylenđiamin (HMDS) để qua đêm (Nikara và cộng sự, 2020). Các mẫu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JSM IT 300LV (JEOL Ltd., Japan). Đối với kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), các mẫu được xử lý theo quy trình tiêu chuẩn (Sathish Kumar và cộng sự, 2017). Các phần bán mỏng được nhuộm bằng màu xanh lam toluidine và được quan sát dưới kính hiển vi ánh sáng. Các phần siêu mỏng của kính soi điện tử truyền qua được nhuộm bằng uranyl axetat và chì Citrate và được kiểm tra theo tiêu chuẩn JEM 1400 (JEOL Ltd., Nhật Bản) tại Viện Nghiên cứu Ung thư (WIA) Adyar, Chennai, Ấn Độ.

2.5. Tách chiết DNA và RNA

DNA được tách chiết từ các mẫu tôm như gan tụy và phân bằng các quy trình tiêu chuẩn. Một cách ngắn gọn, 100 μl mẫu đã được đồng nhất được phân giải với 500 μl đệm ly giải (100 mM Tris-HCl, 20 mM Ethylene diamine axit tetra-axetic (EDTA), 1,4 mM NaCl, 2% CTAB) và 0,1 mgml− 1 proteinase K ở 56 ◦C trong 20 phút và ly tâm ở 12.000 × g (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) trong 10 phút ở 4 ◦C. Phần nổi phía trên được thu thập, và hai đến ba thể tích etanol được thêm vào và ly tâm ở 12.000 x g trong 10 phút ở 4 C. DNA kết quả được rửa bằng etanol lạnh 70% và làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Viên DNA được hòa tan trong nước không có nuclease và được bảo quản ở -20◦C. RNA được chiết xuất từ các mẫu cơ tôm bằng thuốc thử TRIzolTM (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Độ tinh khiết và nồng độ của RNA chiết xuất được ước tính bằng máy quang phổ Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Hoa Kỳ) và được bảo quản ở – 80 ◦C. DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp bằng bộ tổng hợp iScript cDNA (BioRad, Hoa Kỳ) theo quy trình của nhà sản xuất và được bảo quản ở -20 ◦C

2.6. PCR và qPCR

DNA và RNA tách chiết từ mô tôm đã được kiểm tra WSSV (Kimura và cộng sự, 1996), IHHNV và IMNV (OIE, 2019) bằng PCR.

Sự lây nhiễm EHP ở tôm được kiểm tra bằng PCR sử dụng mồi gen protein vách bào tử (SWP-PCR) (Jaroenlak và cộng sự, 2016), và AHPND được kiểm tra bằng giao thức PCR AP4 (Dangtip và cộng sự, 2015). Tất cả các phản ứng PCR được thực hiện trong một máy tuần hoàn nhiệt (Eppendorf, Hoa Kỳ) theo các quy trình tiêu chuẩn. Các sản phẩm PCR khuếch đại được phân giải trên 1,8% điện di ngang gel agarose và được ghi lại bằng hệ thống tài liệu gel (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hoa Kỳ). PCR thời gian thực cho EHP được thực hiện với 20 μl hỗn hợp PCR chứa 2 × hỗn hợp chính chứa kháng thể Taq hiệu suất cao, các enzym PCR thời gian thực khởi động nóng và bộ đệm với 0,25 μM mồi thuận, 0,25 μM mồi ngược và 0,125 Đầu dò μM TaqMan và 100 ng DNA làm tiêu bản. Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là FP- 5’ -GCAGAGTGTTGTTAAGGGTTTAAG 3’, RP – 5’-GCTGTGTCTGTGTAAATATCGTC-3’ và đầu dò 5 ′ -FAMTGGTGAAAATGTTTGAGAATTGTGCCGC– 3’ BHQ. Quá trình khuếch đại được thực hiện trong hệ thống PCR thời gian thực nhanh ABI 7500 (Hệ thống sinh học ứng dụng, Hoa Kỳ), và chương trình khuếch đại bao gồm biến tính ban đầu là 30 giây ở 95 ◦C sau đó là 40 chu kỳ biến tính trong 5 giây và ủ và kéo dài 20 giây ở 60 ◦C. Plasmid chứa amplicon đích được pha loãng từ 107 đến 10 bản sao và được sử dụng làm chất chuẩn trong PCR thời gian thực.

2.7. Nghiên cứu thử nghiệm – Kiểm tra sinh học WFS

Những con tôm có trọng lượng cơ thể trung bình là 4,7 ± 0,16 g được đưa về từ một trang trại nuôi tôm gần Ponneri, huyện Thiruvallur, Tamil Nadu, Ấn Độ. Tôm âm tính với EHP trong chuỗi phân bằng PCR đã được chọn. Ba nhóm 20 con tôm trong các lứa ba được cho ăn với mô HP bị nhiễm WFS, bào tử EHP tinh khiết và mô HP bình thường (đối chứng), và được nuôi ở các thông số chất lượng nước tối ưu trong điều kiện phòng thí nghiệm. Mô HP băm nhỏ đã nhiễm WFS (bản sao EHP 10⁶ bản sao ng− 1 DNA) và mô HP băm nhỏ bình thường (EHP âm tính) được trộn với thức ăn viên hỗn hợp dạng viên; sau đó được cho ăn với tỷ lệ 6% trọng lượng cơ thể một lần mỗi ngày, trong vòng ba ngày. Tương tự, bào tử EHP được tinh sạch (10⁶ml/1) được trộn với thức ăn và cho ăn với tỷ lệ 6% trọng lượng cơ thể trong ba ngày. Sau cảm nhiễm, tất cả tôm đều được duy trì khẩu phần ăn bình thường với thức ăn viên. Sáu con tôm mỗi nhóm (2 con/lần nhắc lại) được lấy mẫu ở 3, 7, 14, 21, 30 ngày sau khi nhiễm bệnh (dpi).

2.8. WFS- chẩn đoán lâm sàng

Tôm sống từ các trang trại bị ảnh hưởng bởi WFS, bao gồm tôm bị ảnh hưởng bởi WFS và tôm không có ruột trắng (ruột bình thường), được thu thập từ các huyện Thiruvallur (Trang trại A), Chengalpattu (Trang trại B), Cudda-lore (Trang trại C) của Tamil Nadu, và Nellore (Trang trại D) của Andhra Pradesh. Tôm được cho ăn bằng thức ăn viên nhân tạo thương mại ở tất cả các trại. WFS được chú ý ở 30, 50, 43 và 56 DOC (ngày nuôi) ở các trang trại lần lượt là A, B, C và D. Các mẫu được thu thập lần lượt ở 31, 52, 45 và 58 DOC ở các trang trại A (5 ± 1,2g), B (8,07 ± 0,9g), C (6,1 ± 0,9g) và D (8,09 ± 0,8 g) , và được vận chuyển đến phòng thí nghiệm. Trong phòng thí nghiệm, tôm bị ảnh hưởng bởi WFS và tôm có ruột bình thường được nuôi trong bể 150L ở điều kiện tối ưu (độ mặn – 25 ppt, pH – 7,8 ± 0,25, nhiệt độ – 29 ◦C, oxy hòa tan 6,6 ± 0,14 mgl-1) và quan sát lâm sàng trong quá trình thử nghiệm trong 20 ngày, riêng biệt. Tôm được cho ăn 4–6% trọng lượng cơ thể bằng thức ăn viên. Tôm nhiễm WFS (n = 25) được lấy mẫu khi bắt đầu thí nghiệm (ngày thứ 0), và tôm được xử lý WFS (n = 25) được lấy mẫu vào ngày thứ 20. Trong khi tôm ruột bình thường được lấy mẫu ở ngày thứ 0 (A) (n = 15) và ngày thứ 20 (B) (n = 25).

2.9. Vi khuẩn học

Để kiểm tra vi sinh vật, hemolymph của tôm nhiễm WFS và tôm có ruột bình thường (n = 20) từ các trang trại A, B, C, D được thu thập khi bắt đầu thử nghiệm. Huyết sắc tố của tôm được thu thập vô trùng bằng kim 24 khổ (0,55 × 25 mm / 24 × 1) và được quét trên đĩa Zobell marine agar (ZMA) để kiểm tra tổng vi sinh vật hiếu khí (TPC) và trên đĩa thạch Thiosulfate citrate bile salt sucrose (TCBS ) để đếm Vibrio. Các đĩa được ủ ở 30 ± 1 ◦C và quan sát sau 24 giờ. Các vi khuẩn dị dưỡng cơ bản được xác định dựa trên các đặc điểm sinh hóa và kiểu hình (Garrity, 2004; Noguerola và Blanch, 2008).

2.10. Phân tích thống kê

Tính bình thường và tính đồng nhất của phương sai của tất cả các biến dữ liệu đã được kiểm tra lần lượt bằng cách sử dụng các kiểm định Kolmogorov-Smirnoff và Leven’s. Phân tích phương sai một chiều One-way analysis of variance (ANOVA) với phép thử Duncan Duncans’s multiple range test được sử dụng để ước tính ý nghĩa thống kê giữa các phương pháp thử nghiệm lâm sàng WFS và thử nghiệm lâm sàng WFS ở P <0,05. Phương pháp kiểm định T-test được sử dụng để phân tích ý nghĩa thống kê của tải lượng EHP, tốc độ tăng trưởng trung bình hàng ngày và số lượng vi khuẩn giữa tôm bị ảnh hưởng WFS và tôm có đường ruột bình thường ở P <0,05. Tất cả các kiểm tra thống kê được thực hiện bằng phần mềm SPSS v 16.0. Tất cả dữ liệu được trình bày trong văn bản và số liệu là trung bình ± độ lệch chuẩn.

Nhóm tác giả: T. Sathish Kumar*, M. Makesh, S.V. Alavandi , K.K. Vijayan

Biên dịch: Hoàng Quyên – Công ty TNHH PTTS Bình Minh

Từ khóa: Hội chứng phân trắng (WFS), Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), Vi bào tử trùng, Viroform (ATM), Penaeus vannamei, phân lỏng ở tôm.

“Tôm Giống Gia Hóa – Chìa Khóa Thành Công”

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức

Phần 1 – BIỂU HIỆN LÂM SÀNG CỦA HỘI CHỨNG PHÂN TRẮNG White feces syndrome (WFS) VÀ MỐI LIÊN QUAN CỦA NÓ VỚI VI BÀO TỬ TRÙNG Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) TRONG CÁC TRANG TRẠI NUÔI TÔM THẺ CHÂN TRẮNG THƯƠNG PHẨM: MỘT CUỘC ĐIỀU TRA BỆNH HỌC