Ảnh Hưởng Của Chế Phẩm Sinh Học Loài Bacillus (Bacillus subtilis Và B. licheniformis) Đến Chất Lượng Nước, Phản Ứng Miễn Dịch Và Sức Đề Kháng Của Tôm Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) Chống Lại Nhiễm Nấm Fusarium solani

Tóm tắt

Nghiên cứu này điều tra tác động của việc sử dụng men vi sinh thương mại dòng loài Bacillus, SANOLIFE®PRO-W (chứa Bacillus subtilis và B. licheniformis), đối với chất lượng nước, enzyme tiêu hóa, hiệu suất tăng trưởng, chất chống oxy hóa, khả năng miễn dịch bẩm sinh, thành phần cơ thể và sức đề kháng của tôm thẻ chân trắng chống nhiễm Fusarium solani. Tổng cộng có 240 con (2,00 ± 0,07 g) được thả vào 12 ao bê tông rộng 1 m³ và chia thành bốn nghiệm thức với ba lần lặp lại. Trong 56 ngày, nước nuôi được bổ sung probiotic loài Bacillus ở mức 0, 0,01, 0,02 và 0,03 g/m³ và được xác định lần lượt là nhóm đối chứng, nghiệm thức T1, T2 và T3. Kết quả cho thấy chế phẩm sinh học của loài Bacillus làm tăng lượng oxy hòa tan và giảm tổng lượng amoniac, nitrit và amoniac liên kết trong ao nuôi. Tuy nhiên, việc bổ sung probiotic Bacillus vào nước nuôi làm tăng đáng kể các enzyme tiêu hóa (chymotrypsin, trypsin, protease, lipase và amylase) và các thông số hiệu suất tăng trưởng so với đối chứng. Mặt khác, mức độ chống oxy hóa của superoxide effutase, catalase và glutathione peroxidase tăng lên đáng kể, trong khi nồng độ malondialdehyde giảm đáng kể so với đối chứng. Hơn nữa, chế phẩm sinh học Bacillus đã tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh của tôm, biểu hiện bằng việc tăng hoạt tính của lysozyme, prophenoloxidase, hô hấp và tổng số lượng tế bào máu so với nghiệm thức đối chứng. Điều đáng quan tâm là tỷ lệ tôm chết sau khi nhiễm F. solani xuống 35% ở nhóm T3 so với 100% ở nhóm đối chứng. Tóm lại, việc sử dụng men vi sinh của loài Bacillus trong nước, đặc biệt ở mức 0,02 và 0,03 g/m³, đã cải thiện chất lượng nước, phúc lợi và khả năng kháng bệnh của tôm thẻ chân trắng đối với nhiễm F. solani.

1. Giới thiệu

Tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei, là một trong những loài tôm He có giá trị thương mại được nuôi ở một số quốc gia trên thế giới (FAO 2020; Islam và cộng sự 2020). Tuy nhiên, do thâm canh và biến đổi khí hậu (Byers 2021; Kibenge 2019), nghề nuôi tôm thẻ chân trắng L. vannamei đã bị ảnh hưởng bởi một số mầm bệnh, gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng (Khoa và cộng sự 2004; Kibenge 2019; Zhang và cộng sự cộng sự 2014; Zou và cộng sự 2020). Bệnh đốm đen (BSD) là một trong những bệnh ảnh hưởng đến sản xuất tôm vì nó gây ra tỷ lệ chết cao, đặc biệt là ở giai đoạn nuôi cuối (Pazir và cộng sự 2022). Bệnh này lần đầu tiên được báo cáo ở tôm Kuruma, Marsupenaeus japonicus, bởi Ishikawa (1968) và nguyên nhân là do nấm. Hatai và Egusa (1978) đã xác định tác nhân gây bệnh đốm đen (BSD- Black spot disease) là Fusarium solani, khi đó được coi là một trong những bệnh nhiễm trên M. japonicus nghiêm trọng nhất ở Nhật Bản (Khoa và cộng sự 2005; Yao và cộng sự 2022). Các loài Fusarium là tác nhân nấm phổ biến ảnh hưởng đến thực vật, đất, nước ngọt và nước lợ (Lightner 1996; Palmero và cộng sự 2009). Những loại nấm này có thể lây lan sang nhiều loại cây trồng khác nhau trên toàn cầu, gây thiệt hại cho nông nghiệp (Figueroa và cộng sự 2018; Moretti và cộng sự 2017; Summerell 2019).

Probiotic là các quần thể vi sinh vật riêng lẻ hoặc hỗn hợp có thể thúc đẩy sự phát triển và sức khỏe của vật chủ khi được cung cấp đủ số lượng (El-Saadony và cộng sự 2021; Lara -Flores và cộng sự 2010; Salminen và cộng sự 1999; Yilmaz và cộng sự 2022). Do những ưu điểm độc đáo và lợi ích sức khỏe, men vi sinh đã được tiếp thị và bán dưới dạng chất bổ sung nước và phụ gia thức ăn ngay lập tức (Jahangiri và Esteban 2018; LaPatra và cộng sự 2014). Áp dụng men vi sinh trực tiếp vào nước là một phương pháp hiệu quả để cải thiện chất lượng nước, nhưng việc ứng dụng làm chất bổ sung thức ăn cũng mang lại kết quả tích cực (Jahangiri và Esteban 2018). Probiotic ảnh hưởng tích cực đến các thông số chất lượng nước như oxy hòa tan, độ cứng, độ pH, nhiệt độ và áp suất thẩm thấu (Cha và cộng sự 2013; Das và cộng sự 2008).

Các loài Bacillus thường được sử dụng làm chất bổ sung men vi sinh hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản (Abdel-Tawwab và cộng sự 2022; Liu và cộng sự 2012). Bacillus có thể sản xuất một số enzyme ngoại bào và chịu được nhiệt độ khắc nghiệt cũng như tình trạng mất nước (Yu và cộng sự 2009). Những chế phẩm sinh học này đã được khám phá rộng rãi gần đây và có thể góp phần to lớn vào các điều kiện sinh lý, hình thái, huyết học và miễn dịch của sinh vật dưới nước khi được sử dụng ở mức tối ưu trong nước nuôi (Rahman và cộng sự 2021).

Mục tiêu chính của nghiên cứu này là kiểm tra ảnh hưởng của việc bổ sung ba mức bổ sung probiotic loài Bacillus (SANOLIFE®PRO-W) đến chất lượng nước, hiệu suất tăng trưởng, khả năng miễn dịch bẩm sinh, hoạt tính chống oxy hóa và khả năng kháng bệnh của tôm thẻ chân trắng đối với nhiễm F. solani.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1. Tôm và thiết kế thí nghiệm

240 con tôm khỏe mạnh với trọng lượng cơ thể ban đầu trung bình là 2,0 ± 0,07 g/con được thu mua từ một trang trại đặc biệt ở Tỉnh Ismailia, Ai Cập. Tôm được thích nghi trong 14 ngày trong bể sợi thủy tinh 2000 L ngoài trời và được cho ăn theo khẩu phần ăn thương mại của Skretting Company, Belbeis, Sharkia, Ai Cập. Thành phần dinh dưỡng của khẩu phần ăn này bao gồm bột cá (72% protein thô), bột đậu nành (48% protein thô), gluten ngô (63% protein thô), cám lúa mì, ngô vàng, dầu đậu nành, tinh bột, vitamin và hỗn hợp khoáng chất. Thành phần hóa học cơ bản của khẩu phần là 89,59% chất khô, 40% protein thô, 8,5% chiết xuất ether, 3,34% chất xơ, 6,52% tro, 41,56% NFE và 18,94 MJ/kg năng lượng tăng trưởng. Sau đó, tôm được thả ngẫu nhiên vào 12 ao bê tông rộng 1m³ (20 cá thể mỗi ao) trong một trang trại đặc biệt ở Tỉnh Ismailia, Ai Cập, để đại diện cho 4 nghiệm thức với ba lần lặp lại. Probiotic loài Bacillus, được bán thương mại dưới tên SANOLIFE®PRO-W (hỗn hợp Bacillus subtilis và B. licheniformis với tỷ lệ 5 × 10⁵ CFU/g; INVE Aquaculture, Bỉ), đã được thêm vào nước nuôi ở mức 0, 0.01, 0.02 và 0.03 g/m 3, lần lượt là T0 (đối chứng), T1, T2 và T3. 5L nước sạch được trộn với các mức men vi sinh khác nhau và nước (5 L) được rắc lên mặt ao 2 tuần/ lần trong 56 ngày. Nước được thay hàng ngày với tỷ lệ 5% cho mỗi ao. Tôm được cho ăn thức ăn thương mại ở mức 7% sinh khối tôm trong 28 ngày đầu và 6% sinh khối tôm trong 28 ngày tiếp theo. Thức ăn nhất định được chia đều thành ba phần và cung cấp cho động vật 3 lần/ ngày (8 giờ, 12 giờ và 16 giờ). Tổng số vi khuẩn trong SANOLIFE®PRO-W được xác định bằng phương pháp đổ đĩa tiêu chuẩn (APHA 1998).

2.2. Đo chất lượng nước

Các chỉ số chất lượng nước được xác định hàng ngày lúc 9 giờ ở độ sâu dưới 30 cm so với mặt ao. Nhiệt độ nước (T; °C) và oxy hòa tan (DO) được xác định bằng máy đo oxy (máy đo DO cầm tay 970, Jenway, London, Vương quốc Anh). Máy đo pH xác định độ pH (Máy đo pH mini kỹ thuật số, model 55, Fisher Scientific, Denver, CO, USA). Độ mặn được đo bằng khúc xạ kế (Erma, Nhật Bản). Đồng thời, nồng độ amoniac liên kết (NH₃) được tính toán bằng thiết bị so sánh HACH theo Boyd (1982), và tổng nitơ amoniac (TAN) của nước ao được xác định bằng bộ kiểm tra amoniac (Advance Pharma, Thái Lan).

2.3. Hiệu quả tăng trưởng của tôm

Hiệu suất tăng trưởng được đánh giá hai tuần một lần bằng cách lấy mẫu và cân 10 con từ mỗi ao. Tăng trọng cơ thể (WG), tăng trọng hàng ngày (DWG), tốc độ tăng trưởng cụ thể (SGR) và % tỷ lệ sống được tính toán bằng các phương trình sau:

Tăng trọng cơ thể (WG) = Cân nặng cuối cùng (Wf (g)) – Cân nặng ban đầu (Wi (g))

Phần trăm tăng trọng cơ thể (WG %) = (WG/ trọng lượng ban đầu) × 100

Tăng trọng hàng ngày (g/con/ngày): DWG = WG/ thời gian (T) (56 ngày)

Lượng thức ăn ăn vào (g/con): lượng thức ăn được cho hoặc cho trong thời gian thử nghiệm/con tôm (g)

Hệ số chuyển đổi thức ăn (FCR) = Lượng thức ăn ăn vào (g)/ tăng trọng (g)

Tốc độ tăng trưởng riêng (SGR) = 100 × (ln Wf – ln Wi)/T

Sinh khối tôm (g) = Wf × số lượng tôm cuối cùng

Tỷ lệ sống (SR) = (số tôm sống sót/số tôm ban đầu) × 100

2.4. Phân tích hóa học cơ bản của cơ thể

Khi thí nghiệm kết thúc, 5 con tôm từ mỗi ao được cân và sấy khô trong lò ở 105°C trong 180 phút, sau đó được nghiền nát và kiểm tra theo AOAC (1995) về độ ẩm, protein thô, chất béo thô và tro.

2.5. Hoạt tính của enzyme tiêu hóa

Gan tụy từ tôm được cân và 1,0 g được trộn trong 1,5 mL nước cất. Trước khi kiểm tra, các mẫu này được bảo quản trong ống Eppendorf 1 mL ở -20°C. Chất nổi phía trên thu được sau khi ly tâm ở tốc độ 13.000 × g trong 5 phút ở 4°C. Các thử nghiệm ba lần được thực hiện sau khi pha loãng chất đồng nhất với chất đệm thích hợp. Đơn vị hoạt tính của enzyme được đo bằng miligam protein hòa tan (U/ mg).

Hoạt tính của trypsin và chymotrypsin được đo động học (Geiger 1984; Tseng và cộng sự 1982) sử dụng N -α-benzoyl -DL -arginine p-nitroanilide (BAPNA, Sigma, B4875) và N -succinyl-ala-ala-pro-phe (SAPPNA, Sigma, S7388) làm chất nền. Máy quang phổ ghi lại cả hai phản ứng ở bước sóng 407 và 405 nm cứ sau 0,9 giây trong 3 phút. Nhiệt độ phản ứng và ủ là 25°C. Hoạt tính của trypsin và chymotrypsin tạo ra 1 μmol 4-nitroaniline mỗi phút trên mỗi miligam protein. Các tính toán sử dụng hệ số tuyệt chủng ε405 = 10,2 L mmol/ cm (Geiger 1984; Geiger và Fritz 1981).

Hoạt tính của enzyme protease được xác định thông qua azocasein (Sigma A2765, Sigma Chemical, St. Louis, USA) làm chất nền, như Svåsand và cộng sự (2007) đã mô tả. Hoạt tính enzyme lipase được xác định theo phương pháp của Versaw và cộng sự (1989) sử dụng β-naphthyl caprylate (Sigma, N8875). Độ hấp thụ tăng 0,001 U/phút ở bước sóng 440 nm và 540 nm được sử dụng để định lượng hoạt tính protease và lipase.

Sử dụng phương pháp được mô tả bởi Rick và Stegbauer (1974), hoạt tính alpha-amylase đã được đo. Maltose tạo đường chuẩn (Kanto Chemical, Tokyo, Japan). Ở bước sóng 550 nm, máy quang phổ đo nồng độ của mẫu và chất chuẩn được sử dụng để tạo đường chuẩn (Jenway, Essex, UK). Giá trị amylase được xác định bằng mmol maltose phát ra trong một phút trên mỗi µg protein.

2.6. Khả năng miễn dịch bẩm sinh gây ra

Hemolymp được thu thập từ 10 con tôm từ mỗi nghiệm thức. Hemolymp được chiết xuất từ cardio-coelom gần mặt sau của mai bằng kim và ống tiêm đã khử trùng y tế dung tích 1 mL. Thuốc chống đông máu (0,34 M NaCl, 0,01 M KCl, 0,01 M EDTA-Na 2 và 0,01 M HEPES, pH 7,45 và 780 mOsm./ kg) được đưa vào ống tiêm (Vargas-Albores và cộng sự 1993). Hemolymp được thu thập bằng tỷ lệ thuốc chống đông máu 1: 1. Sau khi hút 1 mL dung dịch hemolymp vào ống Eppendorf và ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C, phần nổi phía trên màu xanh được đưa vào các ống mới dưới dạng mẫu huyết tương ở nhiệt độ 80°C.

Tổng số lượng tế bào máu (THC) được xác định bằng máy đo huyết cầu và được kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi (Supamattaya và cộng sự 2000). Hàm lượng lysozyme trong huyết tương được đánh giá bằng cách phân giải dung dịch vi khuẩn Gram dương Micrococcus luteus (M3770-25G Lô 117K8707, Sigma-Aldrich), theo Zanuzzo và cộng sự (2017).

Hoạt động bùng nổ hô hấp (RB) được xác định trong một phần của toàn bộ khối máu tụ bằng thuốc chống đông máu làm mát trước bằng phương pháp được mô tả bởi Anderson và Siwicki (1995). Hoạt tính Prophenoloxidase (PO) được đánh giá bằng phương pháp đo quang phổ bằng cách đo sản lượng dopachrome có nguồn gốc từ L -DOPA (Liu và cộng sự 2004). Khả năng thực bào (PP) và chỉ số thực bào được đo bằng các quy trình được Rengpipat và cộng sự (2000).

2.7. Hoạt tính chống oxy hóa và peroxid hóa lipid

Các hoạt tính chống oxy hóa của enzyme, bao gồm hoạt tính của enzyme superoxide effutase (SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPx), đã được đánh giá trong các mẫu gan tụy. Hoạt tính CAT được đo bằng cách sử dụng quá trình tự oxy hóa pyrogallol được mô tả bởi Marklund và Marklund (1974). Hoạt tính CAT được phát hiện sau khi khử H₂O₂ ở bước sóng 240 nm, như Claiborne (1985) đã mô tả. Hoạt tính GPx được đo bằng cách theo dõi tốc độ oxy hóa NADPH bằng phản ứng hai bước với glutathione reductase ở bước sóng 340 nm sử dụng hệ số tắt là 6,22 mM/cm theo Gunzler và Flohe (1985). Đơn vị hoạt tính của enzyme được báo cáo là hoạt tính cụ thể (IU/mg protein). Chúng tôi sử dụng kỹ thuật được đề cập bởi Draper và Hadley (1990) để tạo ra TBARS thông qua phản ứng đun nóng axit để đo quá trình peroxid hóa lipid bằng malondialdehyde. Tương đương MDA được hiển thị dưới dạng protein nmol/mg.

**Đề kháng với nhiễm F. solani.**

Chuẩn bị chủng nấm

F. solani được lấy từ Đơn vị Vi sinh, Khoa Bệnh cá, Viện Thú y, Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp, Dokki, Giza, Ai Cập. F. solani được nuôi cấy trên môi trường thạch PDA trong 7 ngày ở 25°C. Sau đó, 20 mL nước cất đã khử trùng được đưa vào từng đĩa nuôi cấy để thu bào tử vào các ống 30 mL. Sau đó, các mẫu được lọc để xác nhận nấm conidia. Cuối cùng, việc liệt kê được thực hiện để đánh giá số lượng conidia và sau đó tối ưu hóa thành 5 × 10⁴ /mL trong nước cất tiệt trùng.

Quy trình lây nhiễm thực nghiệm

Tôm đã được xử lý được thu thập và nhóm lại với tỷ lệ 10 cá thể trên mỗi bể 50 L với 3 lần lặp lại đại diện cho mỗi nghiệm thức. Tôm bị nhiễm bệnh nhân tạo ở phần giữa của vỏ hoặc các tấm màng bụng và màng phổi, vỏ và mang, như mô tả của HOSE và cộng sự (1984). Việc gây thương tích cho tôm được thực hiện bằng cách loại bỏ mép sau của vỏ hoặc các tấm màng bụng và màng phổi, vỏ và mang. Một miếng bông gòn nhúng vào dung dịch đặc bào tử F. solani (5 × 10⁴ conidia/mL; thu được từ môi trường thạch Sabouraud dextrose 7 ngày tuổi) được sử dụng để lau nhanh trên vết thương. Trước khi thả tôm trở lại bể cá, hemolymp bị rò rỉ đã được đông lại và thu giữ các bào tử. Ngoài ra, một miếng bông gòn bị nhiễm F. solani được quay (dưới áp lực nhẹ) áp vào mang. Nhóm đối chứng không bị nhiễm bệnh nhưng bị thương như các nhóm khác. Trong 14 ngày, động vật được cung cấp khẩu phần ăn tương ứng giống như khi bắt đầu thí nghiệm. Những hành vi bất thường và tôm chết đã được phát hiện. Độ mặn, oxy hòa tan và nhiệt độ nước được duy trì trong suốt các thử nghiệm cảm nhiễm trong cùng điều kiện như thí nghiệm cho ăn. Thức ăn thừa và chất thải được loại bỏ cứ 2 ngày/lần.

2.8 Phân tích thống kê

Các thử nghiệm của Shapiro–Wilk và Bartlett đã xác minh tính quy phạm của dữ liệu và tính đồng nhất của phương sai trước khi phân tích thống kê. Giá trị trung bình và SEM của từng tham số đã được xác định. Sau khi phân tích phương sai một chiều (ANOVA) bằng IPM SPSS (Phiên bản 26), thử nghiệm Duncan được áp dụng để so sánh các phương tiện ở mức P < 0,05 (Dytham 2011).

3. Kết quả

3.1. Thông số chất lượng nước

Tất cả các chỉ số chất lượng nước đều phù hợp với nuôi tôm (Bảng 1). Tổng nitơ amoniac (TAN) và amoniac liên kết bị ảnh hưởng bởi chế phẩm sinh học của loài Bacillus vì giá trị của chúng giảm do tăng hàm lượng men vi sinh. Nghiệm thức đối chứng có hàm lượng TAN và amoniac cao, trong khi mức thấp nhất được quan sát thấy ở T2 và T3, nhận được 0,02 và 0,03 g/m³ chế phẩm sinh học loài Bacillus. Mặt khác, mức DO tăng lên đáng kể khi bổ sung men vi sinh, trong khi độ pH giảm. Ngược lại, việc bổ sung men vi sinh vào nước không ảnh hưởng đáng kể đến nhiệt độ nước và độ mặn (P > 0,05).

Bảng 1. Sự thay đổi các thông số chất lượng nước của các ao được xử lý bằng men vi sinh Bacillus ở các mức độ khác nhau và thả tôm chân trắng trong 56 ngày

3.2. Hoạt tính của enzyme tiêu hóa

Các enzyme tiêu hóa gan tụy của tôm được tăng lên đáng kể bằng cách áp dụng men vi sinh vào nước nuôi (P < 0,05; Bảng 2). Các hoạt tính của enzyme chymotrypsin, trypsin, protease, lipase và alpha-amylase được cải thiện đáng kể khi tăng mức men vi sinh so với nhóm đối chứng. Không có sự khác biệt đáng kể giữa T2 và T3 đối với tất cả các enzyme tiêu hóa ngoại trừ chymotrypsin.

Bảng 2. Men tiêu hóa của tôm thẻ chân trắng thả tại ao được xử lý bằng probiotic các loài Bacillus ở các mức độ khác nhau trong nước trong 56 ngày

3.3. Hiệu suất tăng trưởng và sử dụng thức ăn

Khi so sánh với nhóm đối chứng, kết quả cho thấy việc sử dụng men vi sinh trong nước đã nâng cao đáng kể (P < 0,05) hiệu suất tăng trưởng và trọng lượng của tôm (Bảng 3). Trọng lượng cuối cùng, tăng trọng, % tăng trọng, ADG, SGR và lượng thức ăn ăn vào tăng đáng kể khi sử dụng nước, không có sự khác biệt giữa T2 và T3 (P > 0,05). Ngược lại, FCR và tỷ lệ sống được tăng cường đáng kể ở nhóm sử dụng probiotic (P < 0,05) so với nhóm đối chứng mà không có bất kỳ sự khác biệt nào giữa T2 và T3.

3.4. Thành phần hóa học cơ thể

So với nhóm đối chứng, tổng hàm lượng protein và tro của tôm được điều trị bằng men vi sinh đã được cải thiện. Tuy nhiên, hàm lượng lipid đã giảm đáng kể (Bảng 4). Không có sự khác biệt đáng kể về độ ẩm giữa các nghiệm thức khác nhau (P > 0,05).

3.5. Tình trạng chống oxy hóa và peroxid hóa lipid

Hoạt tính của các enzym SOD, CAT và GPx được cải thiện đáng kể khi thêm vi khuẩn Bacillus vào nước so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05; Bảng 5). Ngược lại, nồng độ MDA giảm khi tăng lượng Bacillus trong nước ao so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05).

Bảng 5. Hoạt tính chống oxy hóa của enzyme và peroxid hóa lipid (nồng độ MDA) của tôm thẻ chân trắng thả tại ao được xử lý bằng các chế phẩm sinh học thuộc loài Bacillus ở các mức độ khác nhau trong nước trong 56 ngày

3.6. Tình trạng miễn dịch bẩm sinh

Tất cả các thông số miễn dịch được cải thiện đáng kể bằng cách tăng probiotic Bacillus so với nghiệm thức đối chứng (P < 0,05; Bảng 6). Hoạt tính THC, PO, RB, lysozyme và chỉ số thực bào tăng đáng kể ở tôm nuôi trong ao có bổ sung vi khuẩn Bacillus so với nhóm đối chứng, đặc biệt là ở T3 và T4.

Bảng 6. Phản ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng thả tại ao được xử lý bằng các loại men vi sinh Bacillus ở các mức độ khác nhau trong nước trong 56 ngày

‘

3.7. Khả năng chống nhiễm solani

Tôm được nuôi trong nước có chứa men vi sinh của loài Bacillus có khả năng chống nhiễm F. solani cao hơn nhóm đối chứng, nhóm có tỷ lệ tử chết cao nhất. Khi liều men vi sinh tăng lên trong nước nuôi, tỷ lệ chết giảm xuống sau mỗi lần bổ sung (Hình 1). Tỷ lệ sống của tôm ở nhóm T3 cao nhất (75%); tuy nhiên, tỷ lệ này là 0% đối với nhóm đối chứng không bổ sung men vi sinh (Hình 2).

Hình 1. Tỷ lệ chết tích lũy của tôm thẻ chân trắng được nuôi trong ao chứa các loại vi khuẩn Bacillus probiotic ở các mức độ khác nhau trong nước nuôi trong 56 ngày và sau khi bị nhiễm F. solani trong 14 ngày

Hình 2. Tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng nuôi trong ao chứa các hàm lượng men vi sinh Bacillus khác nhau trong nước nuôi là 56 ngày và sau cảm nhiễm F. solani trong 14 ngày. Các thanh có chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức P < 0,05

4. Thảo luận

Trong nghiên cứu này, các thông số chất lượng nước nằm trong mức được phê duyệt cho nuôi tôm (Boyd và Tucker 1998). Việc sử dụng chế phẩm sinh học loài Bacillus vào nước ao nuôi đã làm giảm nồng độ TAN và NH₃. Điều này là do sự hiện diện của hỗn hợp Bacillus, hỗn hợp này đóng các chức năng thiết yếu trong chu trình nitơ thông qua quá trình amoni hóa (Hui và cộng sự 2019), quá trình nitrat hóa (Rout và cộng sự 2017) và khử nitrat (Verbaendert và cộng sự 2011) cũng như cố định đạm (Yousuf và cộng sự 2017). Do đó, Bacillus sp. có thể loại bỏ các loại nitơ khác nhau từ nước thải nuôi trồng thủy sản. Ví dụ: B. amyloliquefaciens DT đã chuyển đổi nitơ hữu cơ thành amoni (Hui và cộng sự 2019), trong khi B. cereus PB8 loại bỏ NO₂-N từ nước thải (Barman và cộng sự 2018).

Chỉ số chất lượng nước quan trọng nhất đối với các hoạt động nuôi trồng thủy sản là lượng oxy hòa tan (DO) vì môi trường nước rất giàu amoniac, phốt pho, chất thải hữu cơ, đồng và các nguyên tố khác có thể làm giảm mức DO (dos Santos Simoes và cộng sự 2008). Trong nghiên cứu này, DO tăng rõ rệt khi bổ sung men vi sinh của loài Bacillus theo cách phụ thuộc vào liều lượng so với đối chứng, và điều này là do Bacillus có thể tối ưu hóa quá trình phân hủy tải lượng chất hữu cơ (Hai 2015), từ đó tái chế chất dinh dưỡng trong cột nước và giảm tích tụ bùn (Soltani và cộng sự 2019). Hơn nữa, sự phân hủy chất hữu cơ làm tăng DO (Boyd và Gross 1998; Cha và cộng sự 2013). Nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với kết quả trước đó cho thấy Bacillus sp. cải thiện mức DO trong nước nuôi, chẳng hạn như trong trường hợp B. megaterium (Hura và cộng sự 2018), sự kết hợp của Bacillus (Hainfellner và cộng sự 2018), hỗn hợp các loài Bacillus (bao gồm B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium và B. Laterosporus) (Gomes và cộng sự 2008; Zink và cộng sự 2011).

Nghiên cứu này cho thấy rằng hỗn hợp Bacillus làm giảm giá trị pH so với nhóm đối chứng, dựa trên liều lượng sử dụng nước. Những phát hiện này có thể được giải thích bởi thực tế là Bacillus biến đổi hiệu quả chất hữu cơ thành CO₂, sau đó được sử dụng làm nguồn carbon bởi β- và γ-proteobacteria (Koops và Pommerening-Röser 2001), chúng chuyển đổi hầu hết chất hữu cơ thành chất nhớt hoặc sinh khối vi khuẩn (Mohapatra và cộng sự 2013; Zorriehzahra và cộng sự 2016). Hơn nữa, CO₂ được biết là làm giảm độ pH. Đặc tính cơ bản của nước nuôi thích hợp hơn nước có tính axit, như Hura và cộng sự (2018) đã tìm thấy những đặc tính tích cực trong nuôi cá chép nhờ khả năng bảo tồn độ kiềm của B. megaterium. Trong các ao nuôi cá rô phi được xử lý bằng Bacillus, độ pH tăng lên cũng được phát hiện trong nghiên cứu được thực hiện bởi Elsabagh và cộng sự (2018). Trong môi trường có tính axit, Bacillus có thể làm tăng độ pH của nước, khiến nó trở nên lý tưởng cho việc nuôi cá. Ngược lại với những gì đã được báo cáo về độ pH, một số báo cáo cho thấy probiotic Bacillus đã hạ độ pH xuống mức trung tính (Gomes và cộng sự 2008; Nimrat và cộng sự 2012; Wu và cộng sự 2016).

Ở đây, hỗn hợp Bacillus không ảnh hưởng đến nhiệt độ, xác nhận các nghiên cứu trước đây cho thấy Bacillus sp. không có sự điều chỉnh nhiệt độ đáng kể. (Banerjee và cộng sự 2010; Ghosh và cộng sự 2008; Nimrat và cộng sự 2012). Như Velmurugan và Rajagopal (2009) đã lưu ý, nhiệt độ không bị ảnh hưởng bởi các hoạt động sinh học như một thước đo thận trọng.

Trong nghiên cứu hiện tại, kết hợp Bacillus sp. không ảnh hưởng đến độ mặn của nước. Aftabuddin và cộng sự (2013) kết luận rằng việc kết hợp B. megaterium và Streptomyces fradiae không ảnh hưởng đáng kể đến độ mặn của nước. Hơn nữa, Velmurugan và Rajagopal (2009) phát hiện ra rằng các quá trình sinh học không dễ dàng ảnh hưởng đến độ mặn vì đây là một chỉ số chất lượng nước có tính bảo toàn. Các tác giả này đã chứng minh thêm rằng Bacillus không có khả năng điều chỉnh độ mặn.

Có mối liên hệ chặt chẽ giữa loại và lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn với số lượng và hoạt tính của các enzyme tiêu hóa ở động vật thủy sản. Ở đây đã thấy rằng việc bổ sung Bacillus vào nước đã tăng cường hoạt tính của enzyme tiêu hóa so với nhóm đối chứng. Tương tự, có thông tin cho rằng B. licheniformis có thể tăng cường khả năng tiêu hóa dinh dưỡng của động vật thủy sản bằng cách tăng sản xuất enzyme, chẳng hạn như amylase, protease và cellulase. Ziaei-Nejad và cộng sự (2006) phát hiện ra rằng các chủng vi khuẩn Bacillus có lợi làm tăng các enzyme này ở tôm Ấn Độ. Ở đây, sự gia tăng các enzyme protease, amylase và lipase có thể là yếu tố chính dẫn đến hiệu suất tăng trưởng được cải thiện. Có vẻ như B. licheniformis có thể tăng cường khả năng hấp thụ, tiêu hóa và khả năng cung cấp một số chất dinh dưỡng (Yaqub và cộng sự 2022).

Tăng cường chức năng của các enzyme tiêu hóa có thể cải thiện quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn, do đó nâng cao hiệu suất tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn (Xie và cộng sự 2019). Các kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng việc bổ sung hỗn hợp probiotic Bacillus vào nước nuôi đã làm tăng tốc độ tăng trưởng của tôm. Điều này có thể là do vai trò thúc đẩy tăng trưởng tích cực của chúng (Yanbo và Zirong 2006). Chen và cộng sự (2020) phát hiện ra rằng B. licheniformis đã tăng cường đáng kể khả năng tăng trọng và tốc độ tăng trưởng cụ thể của tôm. Hơn nữa, cũng có phát hiện rằng Bacillus đã cải thiện hiệu suất tăng trưởng của tôm thẻ chân trắng L. vannamei (Cao và cộng sự 2022) và tôm Ấn Độ (Ziaei-Nejad và cộng sự 2006). Mặt khác, Kewcharoen và Srisapoome (2019) phát hiện ra rằng probiotic B. subtilis AQAHBS001 có thể tăng cường mô hình học của ruột giữa tôm thẻ chân trắng, tăng chiều cao/chiều rộng nhung mao ruột, giúp tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng và phát triển tôm. Verschuere và cộng sự (2000) và Zokaeifar và cộng sự (2012) đã chứng minh rằng Bacillus tiết ra một lượng lớn enzyme giúp cải thiện dinh dưỡng cho vật chủ, từ đó thúc đẩy tăng trưởng. Quá trình tiêu hóa thức ăn được cải thiện có thể liên quan đến hoạt tính của enzyme tiêu hóa cao hơn (Zokaeifar và cộng sự 2012).

Nghiên cứu hiện tại cho thấy nước được bổ sung men vi sinh Bacillus làm tăng protein thô và tro của tôm so với đối chứng. Những phát hiện này phù hợp với những báo cáo của Cao và cộng sự (2022), đã phát hiện ra rằng việc áp dụng một nồng độ men vi sinh cụ thể có thể làm tăng hàm lượng protein cơ thô của tôm thẻ chân trắng so với nhóm đối chứng. Seenivasan và cộng sự (2014) tuyên bố rằng dùng đường uống kết hợp LactoBacillus sporogenes, B. subtilis và Saccharomyces cerevisiae đã tăng cường hàm lượng protein thô và tro trong thân thịt gà. Ngược lại với những phát hiện của chúng tôi, Yu và cộng sự (2009) và Heizhao và cộng sự (2008) xác nhận rằng chế phẩm sinh học trong khẩu phần ăn không ảnh hưởng đến thành phần cơ thể của tôm thẻ chân trắng.

Các enzyme liên quan đến stress oxy hóa (SOD, CAT và GPx) và quá trình peroxid hóa lipid (đại diện bởi MDA) là các chỉ số sinh học về tổn thương tế bào do oxy hóa, có liên quan đến quá trình bệnh lý và nguyên nhân của nhiều bệnh ở cá (Abdel-Tawwab và Wafeek 2017; Hermes-Lima 2004; Kehrer 1993; Storey 1996). Trong cuộc nghiên cứu này, việc sử dụng men vi sinh đã tăng cường các đặc tính chống oxy hóa, bằng chứng là SOD, CAT và GPx tăng lên và giảm mức MDA trong gan tụy tôm. Những phát hiện như vậy có thể liên quan đến lượng Bacillus sp tăng cao trong nước ao nuôi. Shen và cộng sự (2010) kết luận rằng men vi sinh được thêm vào nước đã cải thiện hoạt tính của enzyme chống oxy hóa của L. vannamei (Shen và cộng sự 2010). So với nhóm đối chứng, Amoah và cộng sự (2019) đã quan sát thấy sự gia tăng đáng kể các hoạt tính SOD (huyết thanh) và GPx (huyết thanh và gan) ở tôm thẻ chân trắng được xử lý bằng B. coagulans ATCC 7050. Tác động chống oxy hóa như vậy đã được tìm thấy trong các nghiên cứu về các loại men vi sinh thương mại khác nhau (Abdel-Tawwab và cộng sự 2020; Župan và cộng sự 2015).

Ở tôm, hoạt tính của lysozyme và polyphenol oxidase (PO) là những enzyme miễn dịch thiết yếu góp phần tạo ra phản ứng miễn dịch bẩm sinh (Magnadóttir 2006; Whyte 2007). Trong nghiên cứu hiện tại, hoạt tính lysozyme và PO tăng lên ở tôm nuôi trong ao được xử lý bằng chế phẩm sinh học so với nhóm đối chứng. Những kết quả này có thể là do probiotic B. subtilis trong nước giúp tăng cường khả năng miễn dịch bẩm sinh của tôm thẻ chân trắng L. vannamei (Amoah và cộng sự 2019; Wongsasak và cộng sự 2015; Zokaeifar và cộng sự 2012). Hơn nữa, Kewcharoen và Srisapoome (2019) đã quan sát thấy rằng probiotic B. subtilis AQAHBS001 tạo ra hoạt tính lysozyme ở L. vannamei.

Trong nghiên cứu này, chế phẩm sinh học được sử dụng cho ao nuôi tôm đã làm tăng khả năng thực bào, THC và các hoạt động hô hấp. Thực bào chịu trách nhiệm tấn công mầm bệnh ngoại lai, kích hoạt tế bào T (Parham 2014) và tạo ra các tín hiệu kháng thể liên quan đến kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh. Tôm có ba loại tế bào máu: tế bào máu, tế bào hyalinocytes, bạch cầu hạt và bạch cầu bán hạt (Martin và Graves 1985). Tế bào máu là các tế bào bảo vệ trong bạch huyết, có hệ thống phòng thủ chung chống lại các hạt lạ. Tế bào máu có chức năng thực bào, bao bọc, hình thành nốt sần, chữa lành vết thương và đông máu (Aguirre-Guzman và cộng sự 2015; Martínez 2007). Những tế bào máu này có liên quan đến quá trình thực bào và tiêu diệt mầm bệnh và các chất lạ. Trong quá trình thực bào, một cơ chế phân tử được công nhận là sự bùng nổ bạch cầu hô hấp làm tăng sự hấp thu oxy, tạo ra sự khử oxy và anion superoxide (Biller-Takahashi và Urbinati 2014). Cuộc điều tra hiện tại cho thấy sự cải thiện đáng kể về các dấu hiệu miễn dịch so với nhóm đối chứng, cho thấy rằng hỗn hợp men vi sinh có thể ảnh hưởng tích cực đến khả năng miễn dịch trong hemolymp ở L. vannamei.

Probiotic rất quan trọng trong việc phát triển khả năng miễn dịch bẩm sinh ở các loài thủy sản, giúp chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh và các tác nhân gây stress môi trường (Abdel-Latif và cộng sự 2022; Abdel -Tawwab và cộng sự 2022; El-Saadony và cộng sự 2021; Rahman và cộng sự 2021; Yilmaz và cộng sự 2022). Trong nghiên cứu này, nhiễm F. solani dẫn đến tỷ lệ chết đáng kể ở nhóm đối chứng, nhưng tôm được nuôi trong ao có bổ sung men vi sinh đã giảm tỷ lệ chết. B subtilis và B. licheniformis điều chỉnh phản ứng miễn dịch khi được thêm vào nước dưới dạng men vi sinh, giúp tăng cường khả năng chống nhiễm nấm. Do đó, vi khuẩn probiotic có thể cạnh tranh với các vi sinh vật xâm nhập khác, làm giảm tỷ lệ nhạy cảm và tỷ lệ chết (Yaqub và cộng sự 2022). Những phát hiện tương tự đã được báo cáo trước đây bởi Balcázar và cộng sự (2006), đã chứng minh hiệu quả của khẩu phần ăn B. subtilis UTM 126 trong việc ngăn ngừa bệnh vibriosis ở tôm thẻ chân trắng. Hơn nữa, Zokaeifar và cộng sự (2012) đã chứng minh rằng việc bổ sung B. subtilis làm giảm tỷ lệ chết sau thử nghiệm gây nhiễm Vibrio harveyi.

5. Kết luận

Tóm lại, nghiên cứu này chỉ ra rằng việc sử dụng probiotic loài Bacillus bao gồm B. subtilis và B. licheniformis trong nước có ảnh hưởng tích cực đến hiệu suất tăng trưởng, thành phần hóa học, enzyme tiêu hóa, tình trạng chống oxy hóa, chỉ số miễn dịch và khả năng kháng bệnh ở tôm thẻ chân trắng, với kết quả cao nhất đạt được ở T2 và T3, lần lượt nhận được 0,02 và 0,03 g/m³.

Theo Mohamed N. Monier, Hoda Kabary, Amal Elfeky, Saadea Saadony, Nadia NB Abd El-Hamed, Moaheda EH Eissa &El-Sayed Hemdan Eissa

Nguồn: https://link.springer.com/article/10.1007/s10499-023-01136-1

Biên dịch: Nguyễn Thị Quyên – Tôm Giống Gia Hóa Bình Minh

TÔM GIỐNG GIA HÓA – CHÌA KHÓA THÀNH CÔNG

Xem thêm:

Kỹ Thuật Nuôi, Tin Tức